全 文 ：思茅松种子园遗传多样性的 ＲAPD分析
*
朱云凤1，陈少瑜1，郝佳波1，2，吴 涛1，2
(1. 云南省林业科学院，云南 昆明 650201;2. 云南省森林植物培育与开发利用重点实验室;
国家林业局开放性重点实验室云南珍稀濒特森林植物保护和繁育实验室，云南 昆明 650201)
摘要:以思茅松无性系种子园收集的来自 7 个居群的 85 个思茅松用材林优良无性系为试验材料，使用 2 × Taq
PCＲ MasterMix并利用 Touchdown PCＲ构建思茅松 ＲAPD-PCＲ反应体系。从 120 条引物中共筛选出适用于思茅松
遗传多样性分析的 20 条引物进行 PCＲ扩增，来自不同种源地 7 个居群的多态位点百分率 PPB平均值 59. 48 %;
平均每个位点的有效等位基因数 Ne平均值 1. 350 3;Nei’s基因多样指数 H平均值 0. 206 3;Shannon’s多样性信
息指数 I平均值 0. 310 0。通过对 7 个居群的遗传距离进行分析，并构建 UPGMA聚类树状图，从聚类结果看，7
个居群可以划分为遗传差异较明显的 3 大类群。
关键词:思茅松;ＲAPD标记;遗传多样性;UPGMA聚类
中图分类号:S791. 259 文献标识码:A 文章编号:1672 － 8246 (2015)02 － 0141 － 06
ＲAPD Analysis of Genetic Diversity of Pinus kesiya var.
langbianensis from Seed Orchard
ZHU Yun-feng1，CHEN Shao-yu1，HAO Jia-bo1，2，WU Tao1，2
(1. Yunnan Academy of Forestry，Kunming Yunnan 650201，P. Ｒ. China;
2. Key Laboratory of Ｒare and Endangered Forest Plants of State Forestry Administration，Kunming Yunnan 650201，P. Ｒ. China)
Abstract:As the study materials，85 Pinus kesiya var. langbianensis clones of 7 populations were collected from
the clonal seed orchard． By adopting the method of 2 × Taq PCＲ MasterMix amplification and Touchdown PCＲ，
ＲAPD reaction systems was tested． Twenty primers with high stability and polymorphism were screened out from
120 ＲAPD primers which could be used for all samples of ＲAPD-PCＲ amplification． The results showed that，for
the 7 population level，the percentage of polymorphic bands average was 59. 48 %，the number of effective alleles
per band Ne average was 1. 350 3，the Nei’s gene diversity index H average was 0. 206 3，the Shannon’s diversity
index I average was 0. 310 0． The genetic distance was analyzed and UPGMA were clustered at the 7 population，
and the study results revealed these 7 population could be divided into 3 groups．
Key words:Pinus kesiya var. langbianensis;ＲAPD markers;genetic diversity;UPGMA
思茅松 (Pinus kesiya var. langbianensis)为松科
(Pinaceae)松属 (Pinus)树种，常绿乔木，通常树
体高达 20 ～ 30 m，胸径 60 cm，树冠广圆形;树皮
褐色，裂成龟甲状薄块片脱落;枝条一年生长两轮
或多轮;主要速生用材树种之一。是中国亚热带西
部山地林木的代表类型。思茅松树干通直，木材纹
理好、变形小、出材率高、材质优良，常用于建筑、
造纸、制作家具、制胶合板等。活立木可采取松脂，
第 44 卷 第 2 期
2015 年 4 月
西 部 林 业 科 学
Journal of West China Forestry Science
Vol. 44 No. 2
Apr. 2015
* 收稿日期:2014 － 11 － 04
基金项目:国家发改委生物育种高技术产业化专项“思茅松用材林良种高技术产业化示范与研究”(2008C0361)。
第一作者简介:朱云凤 (1982 －)，女，助理工程师，硕士，主要从事植物学和遗传育种方面的研究。E-mail:sherry9872@ 163. com
通讯作者简介:陈少瑜 (1968 －)，女，研究员，博士，主要从事树木生理、林木遗传研究。E-mail:kji － 888@ 163. com
DOI:10.16473/j.cnki.xblykx1972.2015.02.027
树皮可提取栲胶，思茅松产脂量较高，产出的松香
和松节油品质好，是云南主要用材和采脂树种，具
有较高的经济、生态和社会价值［1］。目前云南省思
茅松的立木蓄积量 9 306 ×104 m3，松香年蓄积量为
11. 5 × 104 t［2］。ＲAPD (random amplified polymor-
phic DNA，ＲAPD)是 1990 年由美国杜邦公司科学
家Williams 和加利福尼亚生物研究所的Welsh 等发
明的一种分子标记技术［3 ～ 5］。近年来 ＲAPD已成功
应用于植物遗传分析的各个方面，如遗传多样性和
系统发育研究、目的基因的定位与分子标记的辅助
育种、品种鉴定、遗传作图和 DNA 指纹图谱等方
面［6 ～ 23］。目前思茅松在种源选优［24］、同工酶分
析［8 ～ 9］、产脂优树选优［25］等方面研究进展显著，
但 ＲAPD标记在思茅松的遗传关系方面的相关研究
报道甚少，鉴于此，作者以思茅松 85 个优良无性
系为研究对象，在以思茅松优化 ＲAPD技术的基础
上，进行遗传多样性分析，为思茅松标记辅助的优
良无性系鉴定、早期选择、杂交亲本的选配和育种
群体的多样性评价提供技术支持。
1 材料和方法
1. 1 材料
试验材料采自云南省西双版纳自治州普文林场
内的思茅松优树汇集区。该林场地处北纬 22. 24° ～
22. 26°，东经 101. 04° ～ 101. 06°，海拔 800 ～ 1 354
m，年平均气温 20. 1℃，年降水量 1 655. 3 mm，
土壤为赤红壤。
本次试验共采集 122 个优良无性系中的 85 个
无性系，每个无性系随机采集 1 个单株上木质化程
度较低的新梢，放入装有硅胶的自封袋中，标号，
带回实验室，保存于 － 30℃冰箱保存作为分子标记
试验的材料备用。这 85 个优良无性系分别来自 7
个天然居群，它们分别是景东者后、墨江通关永
马、思茅蔓歇坝和思茅木乃河、景谷县碧安、普洱
一工段、普洱二工段。居群编号、各居群对应无性
系号、居群所在地以及无性系数量见表 1。
表 1 85 个优良无性系及来源
Tab. 1 85 Pinus kesiya var. langbianensis superior clones from different provenances
居群编号 无性系号 居群所在地 经度 纬度 无性系数
1 1-1，1-2……1-18，1-19 思茅曼歇坝 100°19 ～ 101°27 22°27 ～ 23°06 19
2 2-1，2-2……2-12，1-13 景东者后 100°22 ～ 101°15 23°56 ～ 24°29 13
3 3-1，3-2 普洱二工段 99°09 ～ 102°19 22°02 ～ 24°50 2
4 4-1，5-2……4-12，4-13 景谷碧安 100°02 ～ 101°07 22°49 ～ 23°52 13
5 5-1，5-2……5-15，5-16 墨江通关永马 101°08 ～ 102°04 22°51 ～ 23°59 16
6 6-1，6-2……6-8，6-9 思茅木乃河 100°19 ～ 101°27 22°27 ～ 23°06 9
7 7-1，7-2……7-12，7-13 普洱一工段 99°09 ～ 102°19 22°02 ～ 24°50 13
7 个居群所在的 5 个县分别是普洱市思茅区、
墨江哈尼族自治县、景谷傣族自治县和景东彝族自
治县，其中居群 1、6 来自思茅区，居群 2 来自景
东县，居群 3、7 来自宁洱县，居群 4 来自景谷县，
群体 5 来自墨江县。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 思茅松基因组 DNA提取
采用 Solarbio 试剂盒提取思茅松基因组 DNA。
1. 2. 2 ＲAPD-PCＲ扩增及引物筛选
通过初筛和复筛，从北京奥科鼎盛生物科技有
限责任公司合成的 120 条引物中筛选出稳定性强，
多态性高的引物用于所有样品的 ＲAPD-PCＲ 扩
增［26 ～ 27］。
20 μL的 ＲAPD 反应体系含 20 ～ 60 ngDNA 模
板 1. 0 uL，10 μM引物 1. 0 μL，2 × Taq PCＲ Mas-
terMix 10 μL，无菌 ddH20 8. 0 μL。热反应的基本
程序为:94℃预变性 5 min;94℃变性 30 s;复性
45 s，温度从 Tm +5℃在 10 次循环内逐步降至 Tm
－5℃ (每 1 次循环退火温度降低 1℃)，72℃延伸
2 min，10 个循环;之后 Tm℃复性 45 s，72℃延伸
2 min，25 个循环;最后 72℃延伸 7 min;4℃保
存。
1. 2. 3 扩增结果电泳及记录
用筛选出的引物对所有无性系样本进行
ＲAPD-PCＲ扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测，照
相，记录结果。
1. 3 遗传多样性及聚类分析
统计产生多态位点的引物在 7 个居群中扩增的
241 西 部 林 业 科 学 2015 年
电泳带总数与多态带的数目。无性系指纹图谱中的
每一条带作为一个分子标记，同一个位点上以出现
条带记为“1”，不出现为“0”来记录，将图谱数
据转化为 0 /1 数据矩阵。采用 POPGENE32 和
MEGA2 软件计算多态位点百分率 PPB、平均每个
位点的有效等位基因数 Ne、Nei’s基因多样指数 H
和 Shannon’s多样性信息指数 I 等多样性指标，以
及遗传距离 (GD)和 Nei’s 遗传相似性度 (I)，
并构建各无性系以及各居群的遗传关系 UPGMA 聚
类树状图。
2 结果与分析
2. 1 ＲAPD扩增及引物筛选结果
基于 1. 2. 2 的扩增体系和反应程序，从 120 条
引物中筛选出的 20 条稳定性强、多态性高的引物，
用于所有样品的扩增。20 条引物及扩增结果见表
2，引物 C13 对部分试验材料的扩增结果见图 1。
表 2 各引物多态性位点
Tab. 2 Each primer polymorphisms (SNPs)
引物名称 序列 Tm/℃ 位点总数 多态性位点数 多态位点百分率 /%
A03 AGTCAGCCAC 37 7 4 57. 14
A04 AATCGGGCTG 37 5 4 80. 00
A07 GAAACGGGTG 37 7 6 85. 71
A12 TCGGCGATAG 37 5 4 80. 00
A16 AGCCAGCGAA 37 7 6 85. 71
A17 GACCGCTTGT 37 6 6 100. 00
B04 GGACTGGAGT 37 7 6 85. 71
B08 GTCCACACGG 37 8 6 75. 00
B11 GTAGACCCGT 37 10 10 100. 00
B12 CCTTGACGCA 37 7 7 100. 00
B20 GGACCCTTAC 37 13 13 100. 00
C05 GATGACCGCC 41 4 3 75. 00
C06 GAACGGACTC 37 7 6 85. 71
C11 AAAGCTGCGG 37 6 4 66. 66
C13 AAGCCTCGTC 37 11 10 90. 90
C15 GACGGATCAG 37 6 5 83. 33
C16 CACACTCCAG 37 6 6 100. 00
D10 GGTCTACACC 37 5 4 80. 00
D15 CATCCGTGCT 37 8 8 100. 00
F09 CCAAGCTTCC 37 5 5 100. 00
总数 20 － 140 123 87. 85
图 1 C13 对部分无性系的扩增结果
Fig. 1 ＲAPD-PCＲ based on Primer C13
341第 2 期 朱云凤等:思茅松种子园遗传多样性的 ＲAPD分析
由于退火温度是影响 ＲAPD技术稳定性的主要
因素的特点，在体系优化要特别注意退火温度的选
择，具体是根据连续两次梯度 PCＲ，进行退火温
度的筛选。选择为连续两次 PCＲ 扩增结果一致的
温度作为 PCＲ的退火温度，温度为 37℃。
2. 2 7 个居群的思茅松种子园的遗传多样性
本项研究所收集的 7 个居群的多态位点百分率
PPB、平均每个位点的有效等位基因数 Ne、Nei’s
基因多样指数 H和 Shannon’s多样性信息指数 I的
结果见表 3。从表 3 可以看出，7 个居群的多态位
点百分率 PPB的范围是 22. 85 % ～73. 57 %，平均
值 59. 48 %;平均每个位点的有效等位基因数 Ne
的范围是 1. 228 6 ～ 1. 402 9，平均值 1. 350 3;
Nei’s基因多样指数 H的范围是 0. 114 3 ～ 0. 243 3，
平均值 0. 206 3;Shannon’s多样性信息指数 I的范
围是 0. 158 4 ～ 0. 369 4，平均值 0. 310 0。其中居
群 5 (墨江通关永马，16 个无性系)的遗传多样
性水平最高，PPB、Ne、H、I 分别为 73. 57 %、
1. 402 9、0. 243 3、0. 369 4。其次是居群 1 (思茅
曼歇坝，19 个无性系)，PPB、Ne、H、I 分别为
70. 71 %、1. 361 7、0. 221 3、0. 339 9。而居群 3
(普洱二工段，2 个无性系)的遗传多样性水平最
低，PPB、Ne、H、I 分别为 22. 85 %、1. 228 6、
0. 114 3、0. 158 4。其次是居群 4 (景谷碧安，13
个无性系)，PPB、Ne、H、 I 分别为 57. 14 %、
1. 346 2、0. 205 4、0. 307 4。
表 3 各居群的遗传多样性指标
Tab. 3 Genetic diversity index of each population based on ＲAPD
居群号 位点总数 多态性位点数 PPB /% Ne H I
1 140 99 70. 71 1. 361 7 0. 221 3 0. 339 9
2 140 91 65. 00 1. 363 4 0. 215 9 0. 327 3
3 140 32 22. 85 1. 228 6 0. 114 3 0. 158 4
4 140 80 57. 14 1. 346 2 0. 205 4 0. 307 4
5 140 103 73. 57 1. 402 9 0. 243 3 0. 369 4
6 140 83 59. 28 1. 357 7 0. 211 7 0. 317 5
7 140 95 67. 85 1. 392 1 0. 232 8 0. 350 5
居群水平平均 140 83 59. 48 1. 350 3 0. 206 3 0. 310 0
物种水平 140 123 87. 85 1. 451 7 0. 274 9 0. 420 2
注:PPB为多态位点百分率;Ne为平均每个位点的有效等位基因数;H为 Nei’s基因多样指数;I为 Shannon’s多样性信息指数。
2. 3 7 个居群的遗传关系及聚类
用 POPGENE32 软件对由 85 个样本组成的来
自 7 个种源地的居群所有条带的 “0、1”矩阵进
行分析，得到样本间的遗传距离 I 和 Nei’s 遗传一
致度 D，结果见表 4。
表 4 7 个居群基于 ＲAPD的 Nei’s遗传一致度和遗传距离
Tab. 4 Nei’s genetic identity and genetic distance of 7 populations based on ＲAPD
群体号 1 2 3 4 5 6 7
1 ＊＊＊＊ 0. 944 9 0. 894 4 0. 912 0 0. 944 6 0. 909 8 0. 956 9
2 0. 056 7 ＊＊＊＊ 0. 867 4 0. 921 6 0. 926 0 0. 888 1 0. 947 9
3 0. 111 6 0. 142 3 ＊＊＊＊ 0. 860 0 0. 891 5 0. 872 3 0. 889 1
4 0. 092 1 0. 081 7 0. 150 9 ＊＊＊＊ 0. 962 2 0. 944 3 0. 935 1
5 0. 057 0 0. 076 9 0. 114 9 0. 038 5 ＊＊＊＊ 0. 969 9 0. 954 7
6 0. 094 5 0. 118 7 0. 136 6 0. 057 3 0. 030 6 ＊＊＊＊ 0. 913 0
7 0. 044 1 0. 053 5 0. 117 5 0. 067 1 0. 046 4 0. 091 0 ＊＊＊＊
注:对角线以上为 Nei’s遗传一致度和对角线以下为遗传距离。
由表 4 可知，这 7 个居群的遗传距离范围是
0. 030 6 ～ 0. 150 9。其中遗传距离最近的是居群 5
(墨江通关永马)，遗传距离为 0. 038 5 和居群 6
(思茅木乃河)，遗传距离为 0. 030 6。遗传距离最
远的则是居群 3 (普洱二工段)，遗传距离为 0. 142 3
和居群 4 (景谷碧安)，遗传距离为 0. 150 9。
441 西 部 林 业 科 学 2015 年
基于表 4 中的遗传距离绘制聚类图 (图 2)。
由图 2 可知，来自不同种源地的各居群之间的遗传
关系及聚类结果。在遗传距离约 0. 08 以上，可将
7 个居群分成 3 个类群。其中居群 3 (普洱二工段，
2 个无性系)为 1 个类群，居群 4 (景谷碧安，13
个无性系)、居群 5 (墨江通关永马，16 个无性
系)和居群 6 (思茅木乃河，9 个无性系)组成第
2 个类群，而居群 1 (思茅曼歇坝，19 个无性系)、
居群 2 (景东者后，13 个无性系)和居群 7 (普洱
一工段，13 个无性系)则组成第 3 个类群。
图 2 7 个居群的 ＲAPD标记的聚类分析树状图
Fig. 2 Dendrogram of ＲAPD markers of 7 populations
3 结论与讨论
(1)思茅松种子园收集的优良无性系保存了
思茅松种质资源丰富的遗传多样性
85个无性系的多态位点百分率 PPB为 87. 85 %，
平均每个位点的有效等位基因数 Ne 为 1. 451 7，
Nei’s基因多样指数 H为 0. 274 9，Shannon’s多样
性信息指数 I 为 0. 420 2。数据表明思茅松种子园
收集的优良无性系保存了思茅松种质资源丰富的遗
传多样性。
姜远标［7］等人曾研究的 20 个思茅松家系，其
多态位点百分率 PPB 仅为 43. 87 %，表明该种子
园优树汇集区的 85 个思茅松无性系的遗传多样性
远高于之前研究的 20 个家系。姜远标等人之前研
究 20 个家系与本研究的 85 个无性系中的 20 个无
性系有相同的母本，且研究中每个家系只采集了 1
个单株进行研究，所以此研究结果也正好印证了
85 个思茅松无性系更加丰富的遗传基础。
此外，对比其他研究者对松属其他植物油松
(Pinus tabuleaformis)和马尾松 (P. massoniana)
的 ＲAPD标记研究，其多态位点百分率 PPB 大于
其他 3 位研究者研究的油松和马尾松;平均每个位
点的有效等位基因数 Ne 大于赵飞等研究的油
松［20］，但小于万爱华等研究的马尾松［18］;Nei’s
基因多样指数 H 小于其他 3 位研究者研究的油松
和马尾松［18 ～ 20］;Shannon’s多样性信息指数 I 也小
于其他 3 位研究者研究的油松和马尾松。总之，这
几项衡量遗传多样性的指标与其它已研究的松属植
物相比，并未明显小于其他松属植物的这些遗传多
样性指标，因此可以说，思茅松种子园内优树汇集
区的 85 个无性系与其他省份的油松种子园、油松
天然居群和马尾松种子园的的遗传多样性相当。此
外，来自 3 个种源地的油松［19］以及来自 8 个种源
地的马尾松［18］，特别是来自 4 个省的 12 个天然居
群的油松［20］，其研究者都得出了遗传多样系丰富
的结论，而它们的遗传多样性指标并未高于本研究
的 85 个思茅松无性系，因此，云南省林业科学院
普文试验林场思茅松种子园收集的优良无性系保存
了思茅松丰富的遗传多样性，为其进一步遗传改良
提供了基础。
本研究结果显示，7 个居群的遗传多样性水平
从高到低排列依次是居群 5 ＞居群 1 ＞居群 7 ＞居
群 2 ＞居群 6 ＞居群 4 ＞居群 3。从这个排列次序也
可看出各居群对整体遗传多样性的贡献程度。而各
居群遗传多样性的大小与选优母本所在的天然居群
大小、分布、选择优树的数量及分子标记分析的无
性系数量等因素有关，此结果可以为今后试验对象
的选择提供依据。居群 3 在本次试验中因客观条件
的限制，取样过少，导致居群 3 的遗传多样性参数
偏低。
(2)基于 ＲAPD 分子标记的遗传距离及聚类
分析为思茅松杂交群体的选择提供参考
由图 2 的结果可以看出各居群之间的遗传关
系，并将 7 个居群分为遗传差异较明显的 3 大类
群，居群 3 相对其他居群的遗传距离最大。而居群
4、居群 5 和居群 6 之间的遗传距离较小，可归为
一类;居群 1、居群 7 和居群 2 之间的遗传变异也
较小，可归为另一类;而这两类居群之间的遗传变
异则相对较大。此结果可为杂交群体的选择提供分
子水平上的依据。
依据此关系可以为育种时杂交亲本的选配提供
参考。例如，当根据需要选择居群 3 内的各无性系
作为杂交的父本材料时，由图 2 就可以看出居群 3
内的各无性系与其它各无性系的遗传关系，根据远
541第 2 期 朱云凤等:思茅松种子园遗传多样性的 ＲAPD分析
交优势的原理，在选择与之杂交的母本时，就应该
选择与居群 3 内各无性系遗传距离尽可能远的无性
系，这样杂交之后得到优秀子代的可能性将会更
大。
此外，临近的两个县之间的距离最多不超过
100 km。思茅松属风媒传粉植物，其传粉距离较
远，居群之间应存在一定程度的基因交流。将各居
群的遗传距离和聚类图与 7 个居群所在的 5 个县的
空间距离相比较发现，各居群的空间距离和遗传距
离之间并没有表现出明显的相关关系，即空间距离
远的两个居群，其遗传距离并不一定大，而空间距
离近的两个居群，其遗传距离并不一定小。这说明
空间距离不是影响这 7 个居群间遗传距离的主要因
素。其原因与思茅松的繁殖机制以及各居群所在地
的地形、风向、动物活动或地理变迁等因素有关。
例如地形的原因，空间距离较近的两个居群之间若
存在山川，它们之间的基因交流就会受到影响，由
此两个居群之间的遗传距离反而会较远。
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641 西 部 林 业 科 学 2015 年