全 文 ：　第 25卷 第 3期
2007年 8月 　　　　　　　
贵州师范大学学报(自然科学版)
JournalofGuizhouNormalUniversity(NaturalSciences)　　　　　　　　
Vol.25.No.3
Aug.2007
文章编号:1004— 5570(2007)03-0021-04
皱疤坚螺在不同发育时期的酯酶(EST)同工酶比较＊
张　珑 ,晏　飞 ,罗泰昌 ,谷晓明＊
(贵州师范大学 地理与生物科学学院 ,贵州 贵阳　550001)
摘要:采用聚丙烯酰胺电泳法分析了皱疤坚螺(Camaenacicatricosa)不同发育时期 3个组织的酯酶同工酶 , 得到
19条基本谱带 , 其中有 4条为公共谱带。实验结果表明:不同的组织之间酯酶同工酶存在差异。在相同组织的
不同发育时期酯酶同工酶酶谱是相似的 ,但在谱带上也存在有细微的差异;肝的酯酶活性最大 , 足的酯酶活性最
小。以酶谱为性状 , 对其进行了聚类分析 ,发现不同发育时期足和外套膜的相似性比较大 ,肝的酯酶同工酶酶谱
出现了较大变化 , 而且依成体肝 、亚成体肝和幼体肝的顺序与其它组织依次聚类。
关 键 词:皱疤坚螺;发育时期;组织特异性;酯酶同工酶
中图分类号:Q556　　文献标识码:A
AcomparisonstudyonisozymicESTsfromdifferentdevelopmental
stagesofCamaenaCicatricosa
ZHANGLong, YANFei, LUOTai-chang, GUXiao-ming
(SchoolofGeographyandBiology, GuizhouNormalUniversity, Guiyang, Guizhou550001, China)
Abstract:ThreediferenttissuesofCamaenacicatricosawereanalyzedusingpolypropylenegelelectro-
phoresis(PAGE)todeducethediferencesofESTisozymeinthethreetissuesatdiferentdevelopmen-
talstages.Therewere19 bandsintotaland4commonbands.TheresultsindicatedthatESTisozyme
wasdistinctamongthethreetissuesandtheenzymespectrumwassimilaramongthesametissuesat
diferentdevelopmentalstagesbutminordiferencesstilexistedintheenzymebands.Inliver, theen-
zymespectrumchangdgreatlyatdiferentdevelopmentalstages.Theadult, sub-adultandyoungliver
tissuesgroupedwithothertissuessuccessivelyinorder.
Keywords:Camaenacicatricose;developmentstage;tissuespecificity;ESTisozyme
　　皱疤坚螺(Camaenacicatricosa)属于陆生软体
动物 ,是一种大型蜗牛 ,左旋 ,壳质厚而坚实 ,呈扁
圆球形 。成体壳高约 35mm,宽约 49mm。分布于
我国贵州 、广东 、海南岛 、广西 、湖南 、上海等省市自
治区。在广东 、海南岛 、广西一带系优势种类。由
于本种个体较大 ,是一种有价值的饲养种类 ,肉可
食用 ,亦可作家畜 、家禽及鱼类的饲料(陈德牛 ,
1984)。另外 ,皱疤坚螺是广州管圆线虫的中间宿
主(梁浩昆 , 1992)。对该螺个体发育过程的研究
具有重要意义。
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＊ 收稿日期:2006-12-20
基金项目:贵州省高校发展专项资金资助自然科学类重点科研项目(黔教科 2004112), 贵州师范大学学生重点课题(2007
年度)
作者简介:张　珑 (1977-), 男 ,在读硕士研究生 , 研究方向:陆生贝类系统学 、生态学。
通讯作者:谷晓明(1954-), 男 ,教授 , 硕士研究生导师 ,研究方向:动物遗传与进化。
DOI :10.16614/j.cnki.issn1004-5570.2007.03.016
　　同工酶技术出现以来 ,已经在各类动物中得到
广泛应用。但在陆生贝类的研究中运用较少 ,国外
进行了一些研究(J.-F.Arnaud, 1999a, 1999b),而
目前国内仅见的是对褐云玛瑙螺(Achatinafulica)
的研究(范学铭 , 1993, 1995)。本文初步研究了不
同发育时期皱疤坚螺酯酶(EST)同工酶的变化。
1　材料和方法
1.1　材料 　皱疤坚螺 (Camaenacicatricosa)于
2006年 10月 24日和 2006年 10月 25日采于贵阳
市黔灵公园 (罗泰昌 , 2003;罗泰昌 , 2004)。带回
实验室后测量称重 ,分为 4组。 ①成体:壳口外卷 ,
生殖系统完全发育 ,已性成熟;②亚成体:个体大小
与成体相似 ,但壳口不外卷 ,生殖系统未发育;③幼
体:个体较小 ,壳顶尚没明显隆起;④初孵幼体:从
采回的卵中孵出的幼体。活螺采回后在实验室
暂养。
1.2　电泳样品制备 取各组中较活跃的标本。活
体解剖动物 ,取肝脏 、外套膜 、足等组织 ,一般为
0.5g,用贝类缓冲液洗净 ,置玻璃匀浆器中 ,加入样
品提取液(Tris-HClpH8.0)0.5 ～ 1mL,在冰浴中匀
浆 , 4℃条件下 5 000rpm离心 15min,上清液按3∶1
的比例加入 40 %甘油 , -25℃冰箱保存备用(谷
晓明 , 2000)。
1.3　聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳(PAGE)采用高
pH的不连续系统 ,浓缩胶浓度为 4 % ,分离胶浓
度为 7.5% ,胶板体积为 12 ×11 ×0.1cm。每个
种使用上述 3种组织酶提取液(初孵幼螺肝脏太
小 ,没有取样),每孔加样量为 30 ～ 40μL;电极缓冲
液(Tris-Gly, pH8.3),先在 200V下电泳 30min,然
后在 300V电压下电泳 60 ～ 80min。当溴酚蓝指示
线达胶板下缘约 1cm时 ,关闭电源 ,卸板。染色 ,
固定按胡能书(1984)的方法并稍有改进 。
每次电泳的结果基本一致 ,取较清晰的一次拍
照 ,测量 、记录谱带。
2　结果分析
2.1　酶谱照片
皱疤坚螺 3种组织不同发育阶段的酯酶同工
酶(EST)酶谱如图 1所示。
　　从图中可以看出 ,可以将酶谱分为 3个活性
区 ,每个活性区都有染色较深的带和几条浅带 。染
色较深的可以认为此处的酯酶活性较强 ,较浅的活
性较弱 ,还有一些更浅的在照片上不能分辨。总的
来说 ,足的酯酶活性最低 ,外套膜稍高 ,而以肝脏的
酯酶活性最高。
2.2　谱图及 RF值
根据测量结果 ,绘出谱带图 ,并计算出 RF值
(图 2)。
从整体来看:这 11个样品的酯酶同工酶依 RF
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值分为 19条谱带 ,大多数是 10条左右 ,其中有 4
条为公共带 ,分别为 1-4, 1-5, 2-2, 3-2。另外
足和外套膜都具有 3-7 , 3-8两条共有带;外套膜
和肝都有共有带 1-7;足和肝之间没有共有带。
各组织的谱带分述如下:
成体和亚成体的足都是 9条带 ,比幼体和初孵
幼体都是多 1-6和 1-7两条带 ,但不存在足的特
有带;4个时期的外套膜都具有 6条共有带(1-4、
1-5、1-7、2-2、3-2、3-7、3-8);成体 、亚成体
和幼体具有带 2-3;但奇怪的是亚成体没有其他 3
个时期都具有的带 2 -1,具体原因有待进一步探
讨 。肝的情况比较复杂 ,谱带较多的是幼体的肝 ,
具 13条谱带;其它两个时期的都是 10条谱带 ,但
谱带位置不同;肝共有的带有 7条(1-4、1-5、1-
6、1-7、2-1、2-2、3-2)。但成体肝有 1-1, 1-
2两条特有带;亚成体只有一条特有带(3-1);幼
体有 3-3, 3-4, 3-5, 3-6 4条特有带 。
从发育阶段来看:随着发育的进行 ,足从亚成
体开始出现了 1-6 , 1-7两条新带;其它的带没有
变化;外套膜在幼体阶段出现了 2-3带 ,在成体阶
段出现 1-6带 ,但在亚成体阶段带 2-1消失。在
发育过程中 ,肝的变化比较大 ,带 3-3, 3-4 , 3 -
5, 3-6在幼体阶段出现 ,随后消失;带 3 -1, 2-3
在亚成体出现后又在成体消失;带 2-4在成体中
消失;带 1-3存在于成体和幼体阶段;带 1-1, 1
-2存在于成体阶段 。
2.3　对谱图的统计分析
聚类分析是一种分析方法 ,它将一批样品或变
量 ,按照它们在性质上的亲疏 、相似程度进行分类。
处理电泳数据聚类方法常用的有类平均法或相似
系数法 。由于酯酶的遗传机制尚不清楚 ,为方便对
结果的处理 ,将谱带的差异作为基因位点的差异处
理 ,在此基础上使用聚类分析的方法进行综合分
析 ,即不考虑酶的强弱 ,仅以酶的存在与否进行编
码 ,条带存在的记为 “1”,条带不存在的记为 “ 0”。
将数值化后的结果使用 SAS9.0系统进行系统聚
类(高惠璇 , 2001,类平均聚类法 , AVE),得到聚类
图如下(图 3)
　　从图中可以看出 ,所有个体的足以及初孵幼体
的外套膜聚在了一起 ,而剩余 3个个体的外套膜聚
在了一起。这两部分聚类后又依次与成体肝 、亚成
体肝和幼体肝聚类 。这个结果和谱图上所直接观
察得到的结果是类似的。
图 3　皱疤坚螺 3种组织不同发育时期酯酶同工酶聚类图
3　讨论
基因在不同细胞类型或相同细胞类型的各个
不同发育阶段有着不同的表达;而基因活动的一些
规律 ,可以根据个体发育过程中同工酶的不同来测
定。酯酶同工酶是酯代谢的重要酶类 ,不同发育时
间酯酶同工酶的表达各不相同 ,与其相应代谢水平
有关 。
在这 19个谱带中 ,有一些谱带是公共带 (RF
值相同),如 1-4、1-5、2-2、3-2,说明编码这些
谱带的基因有一定的同源性 。这种在各个组织中
都存在的公共酶 ,一般也称管家酶 。随着发育的进
行 ,足在发育至亚成体后增加了两条带(1-6, 1-
7);外套膜在发育至幼体时增加了带 2-3 ,发育至
成体时增加了带 1-6,但在亚成体时带 2-1消失
了 ,具体的原因有待进一步研究;肝的发育变化比
较复杂 ,从幼体至成体的阶段有一些带消失 ,一些
带出现 ,幼体时有 13条带 ,亚成体和成体时共有
10条带。在对水生软体动物发育的研究中发现 ,
随着发育的进行 , 酯酶的谱带数增加 (贾守菊 ,
2003)。范学铭对褐云玛瑙螺胚胎的研究也得出
类似的结果 (范学铭 , 1995)。本文对皱疤坚螺的
研究基本支持以上结论 ,足和外套膜发育时期谱带
都是增加的 。但由于以上两研究均是以动物整体
匀浆 ,所以与本文的对比只具有相对意义 。
在聚类图中可以注意到一个有意思的问题 ,所
有不同发育时期的足和初孵幼体的外套膜聚在了
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　第 3期　　　　　张　珑 ,晏　飞 , 罗泰昌 ,谷晓明:皱疤坚螺在不同发育时期的酯酶(EST)同工酶比较　　　　　　　
一起。可能的解释就是初孵幼体与足一样 ,合成酯
酶动用的基因较少 ,从而出现了较少的带 ,两者表
现了很大的相似性 ,说明不同发育时期足部和初孵
幼体的外套膜的酯酶较少变化。从中还可以注意
到 ,肝的酯酶在发育过程中的差异很大 ,以致于不
同发育时期肝的酯酶不能聚在一起 ,其中幼体肝与
其他时期的肝的酯酶差异最大 ,因而在个体发育过
程中肝酯酶的变化是最活跃的 。另外 ,肝的酯酶活
性在发育的各个阶段活性都是最大的 ,说明肝是螺
体内利用酯来获取能量最重要的器官 。由于酯酶
尚不能定位到基因 ,因此对结果的解释带来不便。
今后将通过与其它同工酶实验结果的对比 ,以得到
更有说服力的结论。
通过同工酶技术对个体的发育进行研究 ,可以
在发育的各个时期辨别出容易消逝的同工酶谱 ,这
对解释发育过程的这些阶段中特有的代谢问题是
必不可少的 ,对阐述发育过程会起到重要作用(C.
C.赖德 , 1987)。在此方面工作做得较多的类群是
脊椎动物 ,对于低等动物如软体动物的研究还很
少 。希望今后能有更多的人从事此项工作 ,为人类
更好地利用自然资源做出贡献 。
致谢:在本实验过程中 , 2004级硕士研究生何
淑艳提供了大量的指导和帮助 , 2005级硕士研究
生袁萌 , 2006级硕士研究生罗煜协助野外采集标
本 。
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