全 文 ：基金项目：福建省自然科学基金项目“利用游离小孢子培育芦笋超雄株技术研究”（2009J01101）。
第一作者简介：林宗铿，男，1975年出生，福建莆田人，副研究员，硕士，主要从事蔬菜育种技术研究。通信地址：363001福建省热带作物科学研
究所，Tel：0596-6101150，E-mail：zklin2004@126.com。
收稿日期：2011-06-13，修回日期：2011-10-13。
白芦笋小孢子发育时期与花器形态相关性研究
林宗铿 1，张天翔 1，杨俊杰 1，蔡坤秀 1，陈振东 1，林义章 2
（1福建省热带作物科学研究所，福建漳州 363001；2福建农林大学园艺学院，福州 350002）
摘 要：为了寻找白芦笋小孢子发育时期的鉴定方法以及探讨小孢子发育时期与花器形态的相关性，采
用苯酚品红、醋酸洋红和醋酸铁矾水合三氯乙醛苏木精染色液进行染色观测，并对白芦笋小孢子发育时
期的细胞学以及小孢子不同发育时期与花蕾大小的关系进行了研究。结果表明，醋酸铁矾水合三氯乙
醛苏木精染色效果最好；白芦笋小孢子发育经四分体时期、单核早中期、单核靠边期和双核期，各时期的
特征明显；白芦笋小孢子发育时期与花蕾的外部形态特征密切相关，不同发育时期的花蕾其纵径、横径
间差异显著，白芦笋品种的小孢子处于单核靠边期时花蕾纵径为2.30 mm，花蕾横径为1.76 mm；依据白
芦笋花蕾的纵径和横径可判断小孢子的发育时期，从而确定小孢子培养最佳时期所对应的选蕾标准。
关键词：白芦笋；小孢子；发育时期；花器形态
中图分类号：S644.6 文献标志码：A 论文编号：2011-1719
Correlation of Microspore Development Period and the Flower Organ Morphology
of White Asparagus
Lin Zongkeng1, Zhang Tianxiang1, Yang Junjie1, Cai Kunxiu1, Chen Zhendong1, Lin Yizhang2
(1Fujian Institute of Tropical Crops, Zhangzhou Fujian 363001;
2College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002)
Abstract: The purpose of this paper is to find a identification method of the developmental asparagus
microspore and discuss the relevance between the developmental period of asparagus microspore and the
morphology of flower organ. So the phenol magenta, carmine acetate and heidenhain iron hematoxylin solutions
were selected for use in staining observation to asparagus microspore, then the developmental cytology, the
relevance between the microspore development and the bud’s size had been studied. The results showed that
the effect of heidenhain iron hematoxylin was the best in the three solutions. The development of asparagus
microspore was divided into tetrad, early or mid-uninucleate, late-uninucleate and binucleate stages, each
stage demonstrated distinctive characters. The developmental periods of asparagus microspore were closely
related to the morphological characters of buds. The longitudinal diameter and transverse diameter of buds had
significant differences in different developmental periods. When the asparagus microspores were at the
late-uninucleate, the buds showed 2.30 mm in longitudinal diameter and 1.76 mm in transverse diameter. The
developmental period of asparagus microspore could be judged by the longitudinal diameter and transverse
diameter of buds, so as to define the standard of bud selection corresponding with the optimal stage of
microspore culture.
Key words: Asparagus officinalis L.; microspore; developmental period; shape of floral organ
中国农学通报 2011,27(28):200-204
Chinese Agricultural Science Bulletin
林宗铿等：白芦笋小孢子发育时期与花器形态相关性研究
0 引言
芦笋（Asparagus officinalis L.）为百合科天门冬属
草本植物，是一种营养丰富且药用价值高的蔬菜。培
养芦笋雄株花药或游离小孢子可获得由花粉发育而来
的单倍体植株（X或Y），含有Y染色体的单倍体经染
色体加倍后可得到纯雄性双倍体（YY）。利用纯雄双
倍体（YY）与雌性个体（XX）交配，所得的F1种子全为
雄性（XY）。由于芦笋雄株产量高于雌株，所以该育种
方法已被许多先进国家用于培育芦笋全雄新品种。
在许多植物花药或游离小孢子培养中，并不是任
何发育时期的小孢子都可以在离体培养时接受诱导产
生愈伤组织或胚状体，只有当小孢子发育到一定时期，
离体刺激才最敏感。从现有成功诱导的报道看[1-4]，处
于单核中晚期或双核期的小孢子诱导效果最好，处于
减数分裂时期和充满淀粉粒的较老时期都很难产生愈
伤组织或胚状体。通过显微镜染色检测，可以直观地了
解植物小孢子的发育时期，但许多研究都表明小孢子
发育时期与花器外部形态密切相关，可以依据花器形
态特征，特别是花蕾的大小，即可判断植物小孢子发育
时期[5-7]。选择适宜的染色液，获得清晰易辨的植物游
离小孢子细胞核、质染色效果，才能准确判断小孢子的
发育时期。醋酸洋红是比较经常采用的染色液之一，
在瓜乐豆[8]、黄瓜[9]、四倍体刺槐[10]、金银花[11]和芒果[12]等
植物的游离小孢子上都取得不错的染色效果。但用醋
酸洋红直接染色番茄[13]小孢子，由于外壁上分布致密
的孢粉素对洋红有亲和性，且坚厚的细胞壁对洋红的
渗透也有影响，所以小孢子外壁被醋酸洋红染成紫红
色，影响了细胞核的观察。在辣椒[5]上，醋酸洋红对处
于四分体时期的小孢子染色效果好，而其他时期用醋
酸铁矾三氯乙醛苏木精染色效果更好。改良苯酚品红
也是一种较好的适用于植物体细胞、减数分裂的染色
液，可用于灯盏花[14]游离小孢子的细胞核染色。
芦笋游离小孢子培养是植物小孢子培养中的难点
之一，距今国内外报道成功诱导芦笋小孢子的例子很
少。发育时期是影响植物游离小孢子培养能否成功的
关键因素这一，选择适宜的发育时期的小孢子，是进行
小孢子培养前提。有关芦笋小孢子发育时期鉴定方法
的研究未见到详细报道。笔者在前人工作基础上，进
行了3种染色液的染色效果比较，并对白芦笋小孢子
发育时期的细胞学特点及其与花器外部形态的相关性
进行研究，旨在确定白芦笋雄核发育中评定小孢子发
育时期的外在衡量指标，以便直接从花蕾大小等形态
特征来推断其小孢子的发育时期，为进行芦笋单倍体
育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试芦笋（Asparagus officinalis L.）品种为白芦笋
‘Gijnlim’，采自福建省热带作物科学研究所芦笋种质
资源圃，植株为 2~3年生，田间管理同常规。于 2011
年 3月采取雄株花序，在白芦笋初花期，晴天上午
8:00—10:00用镊子采摘不同大小的花蕾放入自封袋
内，放入冰盒带回实验室进行处理。
1.2 试验方法
1.2.1 花蕾形态观察与测量 将不同长度的花蕾小心从
花序上取下，用游标卡尺测量花蕾的纵径、横径，剥开
少量花蕾，观察并描绘相应的花蕾、花药的形态特征。
1.2.2 小孢子发育时期细胞学观察 将测量过纵径的花
蕾从小到大分别用卡诺氏固定液于室温下固定 12 h，
再转到体积分数 70%酒精中，置于 5℃冰箱保存备
用。分析时用镊子取出固定处理后的花蕾，小心剥去
花瓣，取出花药，在 1 mol/L HCI中 60℃恒温下解离
5 min上，然后用蒸馏水清洗干净，将花药放在载玻片
上，滴 1滴染色液，用双面刀片从花药中部切断，用大
头针尖头轻轻挤压花药，使其散出小孢子，去掉花药壁
残渣，染色 5 min后加盖盖玻片，吸去多余的染色液，
用铅笔头轻敲几下，用光学显微镜先在低倍下找到视
野，再在高倍下确定各花药小孢子所处的发育时期并
照相。
苯酚品红染色液参照余毓君[15]的做法。原液A：
3 g碱性品红溶于100 mL的70%酒精中；原液B：取原
液A 10 mL加入到90 mL的5%的苯酚水溶液中；原液
C：取原液B 55 mL，加冰醋酸和37%甲醛各6 mL。取
原液C 10~20 mL，加 45%醋酸 80~90 mL，再加山梨醇
1.8 g，配成 10%~20%浓度的苯酚品红染色液，存放 2
周后使用。
醋酸洋红染色液：参照余毓君 [15]的做法。取
100 mL 45%醋酸加热到沸，移去火源，徐徐加入1 g洋
红，倒入烧瓶，上接回旋冷凝器，再加热2~24 h，充分溶
解后过滤。
醋酸铁矾水合三氯乙醛苏木精染色液参照李懋
学 [16]的做法。A液：称取苏木精 1 g加 50%冰醋酸
100 mL；B液：称取铁矾（FeSO4·7H2O）0.5 g，加 50%冰
醋酸100 mL。等量混合A、B液，每100 mL混合液中加
入4 g水合三氯乙醛，充分溶解、摇匀，存放1天后使用。
2 结果与分析
2.1 3种不同染色液的染色效果
不同染色液对白芦笋游离小孢子染色效果不同
（见图 1、2、3）。苯酚品红染色效果最差，将小孢子细
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胞壁染成深紫色，从被染色小孢子表面看不到细胞核；
醋酸洋红将白芦笋游离小孢子的细胞质和细胞核都染
成浅红色，双核期前的细胞核染色深一些，可以辨别，
但在双核期时营养核染色较浅，与细胞质背景色差不
明显，不易观察到；醋酸铁矾水合三氯乙醛苏木精染色
液染色效果最佳，细胞核染成深褐色，细胞质染成浅
色，区分度明显。
2.2 白芦笋各发育时期的细胞学特征
将不同发育时期的白芦笋小孢子用醋酸铁矾水
合三氯乙醛苏木精染色液染色，观察小孢子各发育时
期的细胞学特征。花粉母细胞经过减数分裂产生四分
小孢子，外被一层厚的胼胝质包围，显微镜下四分体的
4个细胞排列成四面体（图4）；从四分体胼胝质壁释放
出来的小孢子，进入了单核期，变成了圆形或近圆形，
单核期可分为单核早、中期（图 5）和单核靠边期（图
6），处于单核早、中期的小孢子无可见的液泡，核大、位
于细胞中央，单核靠边期小孢子的细胞质中出现液泡，
将细胞核从中心挤压到靠近细胞壁，并会出现了萌发
孔；单核靠边期的小孢子经过第1次有丝分裂后，开成
1个营养细胞和1个生殖细胞。营养细胞体积大，核较
大、染色浅；生殖细胞体积小，核较浓缩、染色较深。这
个时期的小孢子处于双核期（图7）。
2.3 白芦笋小孢子发育时期与花蕾外部形态的关系
将测量过纵、横径的花蕾进行处理，用醋酸铁矾水
合三氯乙醛苏木精染色液染色后观察小孢子的发育时
期，并将各发育时期与花蕾的长度、花蕾颜色、花药颜
色进行比较，结果表明，白芦笋小孢子发育时期与花蕾
外部形态具有一定对应关系（表1）。
当花蕾纵径长1.54 mm时，纵横径比值为1.12，整
个花蕾近球形、颜色为白绿色，花药颜色为黄绿色，此
时多数小孢子处于四分体时期；当花蕾纵径长至
1.96 mm时，纵横径比值增大，花蕾颜色变深绿色，花
药呈淡黄色，大多数小孢子处于单核早、中期；当花蕾
纵径为2.30 mm时，小孢子进入了单核靠边期，花蕾为
图1 苯酚品红染色的小孢子（600×） 图2 醋酸洋红染色的小孢子（600×）
图3 苏木精染色的小孢子（600×）
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林宗铿等：白芦笋小孢子发育时期与花器形态相关性研究
深绿色，花药为淡黄色；花蕾长到 2.96 mm时，横径也
长到近 2.0 mm时，整个花蕾变长，花蕾颜色变为黄绿
色，花药呈黄色微红，小孢子进行双核期；花蕾进一步
生长，小孢子则发育成成熟花粉粒。
从表1可以看出，小孢子的发育时期不同，花蕾的
纵径、横径长度间差异都达到显著水平。因此，花蕾的
纵径和横径都可作为白芦笋小孢子发育时期的判断指
标，但纵径较横径大，测量误差小，更为准确。而在纵
横径比方面，虽然四分体期和双核期与其他各期差异
达到显著水平，但单核早、中期与单核靠边期的纵横径
比值差异不明显，因而纵横径比、花蕾颜色和花药颜色
只做为辅助指标进行参考。
3 结论与讨论
本试验研究了白芦笋小孢子发育时期的染色鉴定
方法，观测了小孢子各发育时期的细胞学特征及其与
花蕾外部形态的关系。试验结果表明，3种染色方法
中苯酚品红和醋酸洋红染色白芦笋小孢子效果差，醋
酸铁矾水合三氯乙醛苏木精染色效果最好，不仅核、质
区分度明显，容易辨别，而且在四分体期、单核期和双
核期的使用效果都不错。康洁[13]认为番茄小孢子在外
壁上分布致密孢粉素，影响了细胞核的观察，但经酒
精、盐酸处理后再加洋红染色，可以改变孢子外壁的性
质、增加透性，再经醋酸软化、分色，细胞核着色就比较
明显。本试验也在实践中发现，不管使用何种染色方
图4 四分体时期的小孢子（600×） 图5 单核早、中期的小孢子（900×）
图6 单核靠边期的小孢子（900×） 图7 双核期的小孢子（900×）
小孢子发育时期
四分体
单核早、中期
单核靠边期
双核期
纵径/mm
1.54d
1.96c
2.30b
2.96a
横径/mm
1.33d
1.52c
1.76b
1.95a
纵横径比值
1.12c
1.28b
1.34b
1.52a
花蕾颜色
白绿色
深绿色
深绿色
黄绿色
花药颜色
黄绿色
淡黄色
淡黄色
黄色或微红
表1 白芦笋小孢子各发育时期的形态特征
注：表中数据为10个数值的平均值，3次重复；数据后不同字母表示在0.05水平下差异显著。
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法，白芦笋小孢子只有通过固定、酒精保存、HCI处理
等步骤后，细胞核才能着色，未经处理的小孢子外壁染
成深色，看不见细胞核。
本试验结果表明，白芦笋小孢子的发育时期与花
蕾的纵径、横径密切相关，不同时期的小孢子其花蕾纵
径和横径差异显著；白芦笋品种‘Gijnlim’的小孢子处
于单核靠边期时花蕾纵径为 2.30 mm，花蕾横径为
1.76 mm，花蕾为深绿色，花药为淡黄色。在植物花药
或游离小孢子培养过程中，取材时期对于培养成功与
否起着决定性的作用[4]，确定花蕾的外部形态特征与
小孢子发育时期的对应关系后，就可通过花蕾外观形
态直观准确地判断出小孢子发育的时期，免去接种时
每个花蕾均需镜检确定小孢子发育时期这一复杂步
骤，提高工作效率。所以在开展白芦笋游离小孢子培
养时，也可以直接根据白芦笋花蕾的大小，同时参考花
蕾和花药的颜色来判断小孢子发育时期，此法方便、快
捷、准确。白芦笋小孢子离体培养是个难点，要获得成
功，还需对影响培养效率的其他因素，如基因型、亲本
植株的生理状态、培养方法和培养条件等做深入地研
究。
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