全 文 ：研究与探讨
2013年第8期
Vol . 34 , No . 08 , 2013
无患子总皂苷质控品的制备
伍 恒1，张 翠1，翁 震2，徐德平1，汪何雅1，姚卫蓉1
（1.江南大学食品学院，江苏无锡 214000；
2.福建源华林业生物科技有限公司，福建三明 354500）
摘 要：无患子皂苷具有较好的洗涤功能，因其天然、安全、无毒，可开发成食品工业用清洗剂，而目前尚未有市售高
纯度无患子总皂苷。以制备无患子总皂苷质控品为目标，通过乙醇提取、石油醚除杂、正丁醇萃取、AB-8大孔树脂、
MCI凝胶柱分离纯化得无患子总皂苷，此无患子总皂苷再经液质联用（HPLC/MS）、Libermann-Buehard反应、溶血反应
定性，香草醛-冰醋酸比色法定量。Libermann-Buehard反应颜色由黄-红-紫-蓝，有溶血性。HPLC/MS分析鉴定主要为
齐墩果酸型三萜皂苷，分别为Sapindoside B（882）、Sapindoside A（750）、Mukurozi-saponin E1（924）、Sapindoside L
（924）、Mukurozi-saponin G（966）、Sapindoside M（966）。以齐墩果酸为标准品，通过香草醛-冰醋酸显色，皂苷元在
550nm有最大吸收，进一步判定无患子总皂苷以齐墩果酸型皂苷为主，且用35%盐酸高温高压水解无患子总皂苷2h，
皂苷元得率最高，通过换算可知，无患子总皂苷的纯度能够达到95.2%，可作为无患子总皂苷质控品。
关键词：无患子皂苷，齐墩果酸型三萜皂苷，大孔树脂，质量控制
Preparation of total sapindus-saponins for quality control
WU Heng1，ZHANG Cui1，WENG Zhen2，XU De-ping1，WANG He-ya1，YAO Wei-rong1
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214000，China；
2.Fujian Yuanhua Forestry Biotechnology Co.，Ltd.，Sanming 354500，China）
Abstract：Sapindus saponin has wonderful washing fuction which is natural，environment-frendly and nontoxic.
It can be developed into food industry cleaning agent. However，there is no pure sapindus saponin commercially
available. With the goal of producing the total sapindus saponin for quality control，the method of ethanol
extraction，butanol extraction，AB-8 macroporous resin and MCI Gel column separation was used to separate
and purify sapindus saponin. The qualitative test was studied by means of Libermann-Buehard reaction and
Hemolysis test. The quantitive test was made afterwards based on High Performance Liquid Chromatography/
Mass Spectrum and the method of vanillin-sulfuric acid. Libermann-Buehard reaction showed the color
changes：yellow-red-purple-blue. Hemolysis test proved hemolytic. The components named Sapindoside B
（882），SapindosideA （750），Mukurozi -saponinE1 （924），Sapindoside L （924），Mukurozi -saponin G （966），
Sapindoside M（966） were analysed by HPLC/MS，which were identified as Oleanolic acid saponins. Oleanolic
acid was chosen as standard. Sapogenin of TSS after hydrolysis had a maximum absorption at 550nm with the
method of vanillin-sulfuric acid，which was the same as Oleanolic acid in the condition of 35% hydrochloric
acid，high temperature and pressure and time of 2h，the yield of sapogenin were the highest. The purity of TSS
（Total Sapindus Saponin） was calculated to more than 95.2%. It could be further conclued that TSS was mainly
oleanolic acid saponins and could be used for quality control as standard.
Key words：sapindus saponins；oleanolic acid saponins；macroporous resin；quality control
中图分类号：R917 文献标识码：A 文 章 编 号：1002-0306（2013）08-0091-06
收稿日期：2012－10－10
作者简介：伍恒（1988-），女，硕士研究生，研究方向：食品安全与质量
控制。
无患子又名肥皂树，其果皮中含有丰富的无患
子皂苷，是一种天然的非离子型表面活性剂，具有很
强的降低表面张力的作用，泡沫丰富、手感细腻、去
污力强。用从无患子果提取的皂苷制得的皂乳洗碗
剂、蔬果清洗露、食品机械清洗剂等用于食品工业中
不会带来萤光剂、表面活性剂、人工激素、江河湖泊
富营养化等负面问题，在一定程度上保证了食品安
全；另外，无患子皂苷还能迅速分解，不会对环境造
成任何污染。目前，国内对无患子皂苷的研究仍处于
初步阶段，市面上没有无患子皂苷的纯品出售，关于
其定性研究比较困难。关于皂苷的测定方法较多，主
要有紫外分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱
法、高效液相-质谱联用法、气相色谱法、高效毛细管
电泳法等，以上分析方法各个侧重点不同：比色法、
紫外分光光度法比较适用于检测总皂苷含量；薄层
色谱法在中药成分研究中应用较为广泛；高效液相
色谱法对于皂苷的定量检测较方便，但需要昂贵的
标准品做对照[1-2]；液质联用法能高效准确地对皂苷
91
Science and Technology of Food Industry 研究与探讨
2013年第8期
定性和定量[3-8]，但设备仪器价格昂贵，操作技术要求
高。分光光度法已经应用于人参总皂苷、酸枣仁皂
苷、黄芪总皂苷等的测定中，证明了该方法是检测总
皂苷含量的方便有效地方法之一。
所以本文采用醇提-大孔树脂吸附法自制无患
子总皂苷标准品，经Libermann-Buehard反应、溶血反
应定性，并采用HPLC/MS方法初步鉴定无患子总皂
苷成分，经香草醛-冰醋酸比色法定量无患子总皂苷
标准品纯度。目前市面上涌现出越来越多的无患子
皂苷产品，例如无患子蔬果清洁露、无患子洗碗露
等，所得高纯度皂苷可作为工艺研究的质量控制标
准品，同时也可作为食品工业上无患子皂苷产品中
皂苷含量检测的标准品。填补了市面上没有高纯度
无患子总皂苷出售的空白，为进一步实验研究打好
基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
无患子果皮 福建源华生物科技有限公司；95%
乙醇、石油醚、正丁醇、香草醛、高氯酸（70%~72%）、
冰醋酸、浓硫酸 分析纯，国药集团化学试剂有限
公司；AB-8大孔树脂 天津南开大学化学工厂；
MCIgelCHP20P（75~150μm）柱填料 日本三菱化成
公司；GF254薄层硅胶板 山东烟台芝罘化工厂；齐
墩果酸标准品 中国药品生物制品检定所；日本大
耳白兔 北京百尔康纳特实验兔繁育生物技术开发
有限公司。
可调试移液器 Thermo Labsystems公司；PL2002
型电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；
GEN-14型电动微型粉碎机 四川自贡渐飞机械厂；
W501型恒温水浴锅 上海申顺生物科技有限公司；
CQ-88-205型萃取罐 常州市特威电气自动化系统
有限公司；TU-1900型双束紫外可见分光光度计 日
本岛津公司；Waters Synapt G2型超高效液相色谱-
质谱联用仪 美国Waters公司；R-501型旋转蒸发器
上海申顺生物科技有限公司；SHBⅢ型循环水式
多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 无患子总皂苷质控品的制备
1.2.1.1 无患子粗皂苷的提取 将无患子果皮磨碎
成20目左右，称取5kg无患子粉末于提取罐中，加
15kg 70%乙醇75℃下提取3h。将第一次提取液经8层
纱布过滤从罐底放出。滤渣留在提取罐中进行第二、
三次提取，酒精浓度、酒精用量、提取时间和温度与
第一次提取相同，合并三次滤液并离心。采用旋转蒸
发仪蒸发回收乙醇至浸膏状。
1.2.1.2 无患子总皂苷的分离 将上述浸膏状无患
子粗皂苷分散至石油醚中萃取3次，弃去石油醚层，
水相部分用正丁醇萃取5次，至正丁醇相几乎没有颜
色，合并正丁醇相，减压浓缩，加入适量蒸馏水，水溶
液中加入5% Ca（OH）2混匀，放置2h使沉淀，去除粘
液质、鞣质和部分黄酮，抽滤后得到无患子粗皂苷溶
液继续上AB-8大孔树脂柱，流速约15mL/min，上样
量应低于柱体积的1/4。大孔树脂预处理、装柱及再
生方法见文献[9]。先用蒸馏水洗脱去除糖类、氨基
酸、色素等水溶性杂质，再用70%乙醇洗脱得无患子
粗皂苷液，取出一部分干燥成粉末，HPLC-MS分析其
成分。
1.2.1.3 无患子总皂苷的纯化 将大孔树脂分离所
得无患子粗皂苷液浓缩，再加水稀释至浓度约5%的
水溶液，上样MCI（聚苯乙烯基的反相树脂填料）凝胶
柱，分别用蒸馏水、30%、70%乙醇洗脱，减压浓缩干
燥得混合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，HPLC-MS、泡沫实验、TLC检
测、Libermann-Buehard反应、溶血性实验同步进行定
性分析。
1.2.2 无患子皂苷的定性测定
1.2.2.1 HPLC-DAD/MS检测条件 配制1mg/mL无
患子粗皂苷液（大孔树脂70%洗脱部分），进行HPLC-
DAD/MS检测。检测条件[10-11]如下：色谱柱为BEC C18
柱（2.1mm×100mm，1.7μm），流动相A：甲醇，流动相
B：水，起始时40%A，60%B；20min时80%A，20%B；
25min时100%A，流速0.3mL/min，柱温45℃，进样量
5μL。ESI离子源；正离子模式与负离子模式相互验
证，MRM多反应监测，雾化N2压力为275.8kPa，干燥
N2流速9L/min，温度为350℃，毛细管电压为3.0kV，质
量范围100~3000m/z，脱溶剂气温度250℃，离子源温
度120℃，DAD范围190~400nm进行扫描。无患子皂苷
正负离子流色谱图见图2、图3。
1.2.2.2 Libermann-Buehard反应 组分Ⅲ粉末1mg，
加乙酸酐溶解，随后再加入乙酸酐-浓硫酸（1∶20）数
滴，振摇[12]。观察颜色变化，颜色的变化为黄-红-紫-
蓝，显示可能有三萜皂甙。
1.2.2.3 溶血反应 溶血反应是皂苷的特征反应，皂
苷能导致血细胞破裂，因此可以利用溶血性来判断样
品中是否含有皂苷。取大耳兔新鲜血液20mL，放入
加有玻璃珠的三角瓶中，振摇10min除纤维蛋白后转
至刻度离心管中，加生理盐水10mL混匀后1500r/min
离心5min，除去上清液，再加适量生理盐水离心，重复
至上清液无色澄清。弃去上清液取2mL红细胞，加入
98mL生理盐水，即配成2%的红细胞悬浮液，备用[13]。
配制混合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ水溶液1mg/mL，取试管4支，分
别加入滤液0.25、0.5、0.75、1mL，然后依次分别加入
生理盐水2.25、2.0、1.75、1.5mL，使每一个试管中的
溶液均为2.5mL，再将各试管加入2%的血细胞悬液
2.5mL，振摇均匀后，立即置于37℃水浴中温浴3h，以
1500r/min离心5min，若实验溶液呈澄明红色，管底无
细胞残留或少量残留，表明有溶血反应；若细胞全部
下沉，上清液无色透明，表明无溶血现象发生[14]。
1.2.3 无患子总皂苷纯度鉴定
1.2.3.1 齐墩果酸标准曲线制备 根据HPLC-MS分
析结果，无患子总皂苷主要为齐墩果酸型三萜皂苷，
所以选择齐墩果酸作为无患子总皂苷元的标准品。
齐墩果酸用甲醇溶解，配制成1mg/mL的溶液，取18支
20mL比色管，编号1~6，每个编号三组平行，1~6号试
管分别取0、200、400、600、800、1000μL齐墩果酸标准
溶液，水浴挥干。每管加入0.4mL 5%（wt%）香草醛-
冰醋酸溶液和1.4mL高氯酸溶液为显色剂，摇匀，在
92
研究与探讨
2013年第8期
Vol . 34 , No . 08 , 2013
图2 TLC同步检测MCI柱分离结果
Fig.2 The result of separation of MCI GEL by TLC detection
组分Ⅰ 组分Ⅱ 组分Ⅲ
70℃水浴加热20min，冰水浴中冷却3min，加入10mL
冰醋酸为溶剂，摇匀，用分光光度计在400~600nm扫
描光谱，并在550nm测吸光度[15]。
1.2.3.2 无患子总皂苷水解条件的确定 浓盐酸水
解法是通过皂苷经水解后得到皂苷元，再经换算得
到相应皂苷的含量。无患子皂苷根据文献[16]对于酸
种类、酸浓度及水解时间都有一定的研究，但关于水
解方式的比较方面报道甚少。本实验比较了三种不
同的水解方式：回流加热、100℃水浴、高温高压。方
法如下：
待测样品的配制：精密称取无患子总皂苷粉末
1g，加33mL水溶解后，再加入17mL浓盐酸使盐酸浓
度达到35%左右。
（a）回流加热：组装实验室常用的回流冷凝装
置，将上述待测样品置于100mL圆底烧瓶中，用油浴
锅在100℃回流加热2h；
（b）100℃水浴：将上述待测样品置于100mL锥形
瓶中，加硅胶塞密封，用水浴锅在100℃加热2h；
（c）高温高压：将上述待测样品置于100mL锥形
瓶中，加硅胶塞密封，用高压蒸汽灭菌锅在120℃，
0.1MPa加热2h。
将以上三种水解方式的产物用三氯甲烷振摇提
取三次，合并提取液，回收溶剂至干，甲醇定容后待
测定。
1.2.3.3 无患子总皂苷与齐墩果酸量比换算系数 齐
墩果酸的分子式C30H48O3，分子量为456，按含量加权
分析[17]推断无患子总皂苷的平均分子量为882.5，与
齐墩果酸的分子量在理论上的量比系数为1.94，考
虑在无患子总皂苷水解过程中不能达到完全水解，
无患子总皂苷元的得率有所损失，皂苷元最大得率
达85%左右[18-19]，所以量比系数1.94除以85%即为加
权系数2.3，无患子总皂苷含量的计算公式为：
无患子总皂苷的含量=试样中齐墩果酸相当量
（μg）×2.3
2 结果与分析
2.1 大孔树脂分离所得无患子粗皂苷液成分鉴定
一般三萜皂苷类化合物的紫外吸收很弱，通过
高效液相-紫外检测（HPLC-UV）或高效液相-蒸发
光散射（HPLC-ESCD）测定其含量较困难，且需要较
昂贵的对照品。HPLC-MS检测三萜皂苷类物质灵敏
度高，并能提供每个谱峰的分子量及结构信息，在没
有对照品的情况下，可以快速鉴定出三萜皂苷类成
分。本研究首先采用大孔树脂初步分离纯化得无患
子粗皂苷液，为了判断所得无患子粗皂苷液中的成
分，选择正离子和负离子两种模式同步进行无患子
粗皂苷的ESI-MS检测，正、负离子模式下无患子粗
皂苷成分总离子流色谱图如图1所示，可以看出其单
体成分较多，很难完全分离，对主要色谱峰进行编
号，编号为1~15。
正离子ESI-MS谱中出现各皂苷成分的[M+Na]+
准分子离子峰，负离子ESI-MS谱中则为[M-H]-和[M+
Cl]-准离子峰。通过正、负离子质谱相互验证，因为各
单体很难完全分离，所以质谱图中会有一些碎片离
子干扰，但主要的碎片离子可以较易从图中读出，并
在相应的碎片离子上标明[M+Na]+、[M-H]-、[M+Cl]-，
从而初步判断无患子粗皂苷中主要单体的分子量，
根据相关书籍 [20]，初步推测无患子粗皂苷液中主要
成分，结果见表1。
根据质谱元素分析软件Mass Lynx V4.1，可以初
步判断分子量1188、1086、1400为含氮或含硫化合
物，属于杂质成分；6号组峰分子量均为1190，该类物
质王晓淳等 [21]报道其性质不稳定，很难分离得到纯
品，结构难以鉴定；8号组峰主要是分子量为1086与
1232的混合峰，很难分开；分子量为1044和1128的物
质至今未见报道；分子量为1000、1002、1146、1148、
1232的物质属于倍半萜糖苷类化合物；分子量为
1206、1074、882、750、924、966的物质为三萜皂苷类
化合物，杨运云等 [22]对复方毛冬青冲剂中三萜皂苷
活性成分进行分析，报道了齐墩果酸型及乌索烷型
三萜皂苷在一级正离子质谱图中均有m/z437特征离
子，上述无患子三萜皂苷正离子ESI-MS中均有特征
碎片峰m/z437，结果与杨运云等的报道相似，进一步
确定了分子量为1206、1074、882、750、924、966为三
萜皂苷，且主要为齐墩果酸型三萜皂苷。结合图3和
表1可知，4~10min出峰的主要是倍半萜糖苷类物质，
10~20min出峰的主要为三萜皂苷类物质，且主要有8
种三萜皂苷单体，这与Huang等[23]和Saxena等[24]报道
的10~20min出现约7个三萜皂苷单体的报道相似。综
上所述，要得到纯度较高的皂苷成分，还需要进一步
分离，将倍半萜糖苷类物质去除。
2.2 无患子总皂苷进一步纯化
2.2.1 TLC同步监测MCI柱分离结果 根据不同物
质在MCI柱上的吸附力不同，先用蒸馏水洗脱直至用
薄层板检测无检出物，这部分合并即为组分Ⅰ；用
图1 无患子粗皂苷液的ESI检测总离子流色谱图
Fig.1 ESI-total ion chromatograms of TSS
注：A：ESI+；B：ESI-。
时间（min）
0 4 8 12 16 20
30000
25000
20000
15000
10000
5000
0
离
子
强
度
1 2
3
4
5
6
7
8 9
10 11
12
13
14
15
93
Science and Technology of Food Industry 研究与探讨
2013年第8期
图4 齐墩果酸在香草醛-冰醋酸体系中紫外吸收
Fig.4 The UV graph of olenolic acid in
vanilin-acetic-HClO4 system
波长（nm）
400.00 450.00 500.00 550.00 600.00
2.000
1.500
1.000
0.500
0.000
Ab
s
548.00，1.025
实验号 出峰时间（min） M 分子式 [M-H]- [M+Cl]- [M+Na]+ 类型
1 4.43 1000 C45H76O24 999.51 1035.49 1023.55 MukuroziosideⅠb
2 5.06 1146 C51H86O28 1145.58 1181.57 1169.63 MukuroziosideⅡb
3 5.41 1188 未知 1187.41 1223.46 1211.50 杂质
4 5.79 1002 C45H78O24 1001.52 1037.50 1025.56 MukuroziosideⅠa
5 6.22 1148 C51H88O28 1147.60 1183.56 1171.63 MukuroziosideⅡa
6 6.65~7.60 1190 C55H98O27 1189.77 1225.73 1213.71 未知
7 7.90 1044 C33H58O15 1043.54 1079.55 1067.59 未知
8 8.49~9.84
1086 未知 1085.70 1121.68 1109.64 杂质
1232.56 C55H92O30 1231.62 1267.61 1255.68 Mukurozioside A
9 10.30
1206 C58H94O26 1205.68 1241.67 1129.70 Mukurozi-saponinY
1074 C53H86O22 1073.61 1109.59 1097.63 Mukurozi-saponinX
10 11.20 1128 C56H88O33 1127.71 1163.70 1151.69 未知
11 13.76 1400 未知 1399.72 1436.70 1423.74 杂质
12 14.72 882 C46H74O16 881.51 918.51 905.53 Sapindoside B
13 15.00 750 C41H66O12 749.47 785.45 773.49 Sapindoside A
14
15.14 924 C48H76O17 923.53 959.52 947.55 Mukurozi-saponin E1
15.52 924 C48H76O17 923.65 959.63 947.65 Sapindoside L
15
15.73 966 C50H78O18 965.56 1001.54 989.53 Mukurozi-saponin G
16.06 966 C50H78O18 965.54 1001.52 989.54 Sapindoside M
表1 无患子粗皂苷成分分析
Table 1 Analysis of components of the total sapindus-saponins
30%乙醇洗脱至薄层板上无检出物，合并洗脱液成
组分Ⅱ；再用70%乙醇洗脱直至无目标物，合并洗脱
液得组分Ⅲ，根据洗脱物保留时间不同可知组分Ⅰ、
Ⅱ、Ⅲ是三类不同极性的物质。
2.2.2 HPLC-MS检测组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 结合表1所鉴
定的无患子粗皂苷成分，编号对应图3。根据分子量
及出峰时间可以推断无患子总皂苷主要集中在组分
Ⅲ中，主要成分如下（括号内为分子量）：Sapindoside
B（882）、Sapindoside A（750）、Mukurozi -saponin E1
（924）、Sapindoside L（924）、Mukurozi-saponin G（966）、
Sapindoside M（966）；组分Ⅱ中也含有少量无患子三
萜皂苷，分别为Mukurozi-saponinY（1206）和Mukurozi-
saponinX（1074），出峰时间为10.02min，但因为其含
量较少，且从组分Ⅱ中完全分离比较困难，所以本实
验未对组分Ⅱ进行进一步分离，组分Ⅲ即为本实验
所需无患子总皂苷质控品，且根据峰面积可知组分
Ⅲ中无患子总皂苷含量较高。
2.2.3 组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ性能验证 经Libermann-Buehard
反应及溶血实验，发现组分Ⅰ、Ⅱ的Libermann-
Buehard反应无颜色变化，在较高浓度（0.3mg/mL）仍
无溶血反应，说明几乎不含皂苷或皂苷含量较少，这
与HPLC-MS推测的结果一致；组分Ⅲ有明显的皂苷
的特性，Libermann-Buehard反应颜色由黄-红-紫-
蓝，且在较低浓度（0.02mg/mL）时仍有溶血性，说明
三萜皂苷含量较高，进一步断定组分Ⅲ即所需无患
子总皂苷质控品。
2.3 无患子总皂苷纯度的判定
通过MCI柱分离可知，组分Ⅲ为纯度较高的无患
子总皂苷，因为其含有相同的齐墩果酸型皂苷元，结
构相似，所以很难完全分离开，无法用面积归一化法
对其进行纯度的计算。根据文献[25]，通过将皂苷水
解为皂苷元，再经过加权系数分析，可以计算皂苷的
含量。
2.3.1 齐墩果酸标准曲线 齐墩果酸通过香草醛-
图3 组分Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的ESI检测负离子流色谱图
Fig.3 ES-ion chromatograms of mixture Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ
时间（min）
0 4 8 12 16
25000
20000
15000
10000
5000
0
离
子
强
度
1
2 3
4 5
6
7
8
9 10
11
12 13
14
15
组分Ⅰ
组分Ⅱ
组分Ⅲ
94
研究与探讨
2013年第8期
Vol . 34 , No . 08 , 2013
冰醋酸显色后在400~600nm扫描，可知在550nm左
右有最大吸收。以齐墩果酸为无患子三萜皂苷元的
标准品，得回归方程如下：y=0.0006x+0.0838，R2=
0.9996，其中，x为齐墩果酸含量，y为吸光度。齐墩果
酸含量在200~1000μg范围内与吸光度呈现良好的线
性关系，可作为齐墩果酸型皂苷元质量评价的标准
曲线。
2.3.2 无患子总皂苷水解后的吸收特征 无患子总
皂苷经过水解得到皂苷元，经过香草醛-冰醋酸显色
后，在550nm左右处有最大吸收，这与齐墩果酸标准
品的最大吸收峰一致，进一步说明了该三萜皂苷元
为齐墩果酸型皂苷元。
2.3.3 无患子总皂苷水解条件的确定 从表2可以
看出，当盐酸浓度35%，水解2h时，高温高压方法下
皂苷元得率最高，通过1.2.3.3的换算方法可知无患
子总皂苷的纯度可达95.2%。
3 结论
通过乙醇提取，石油醚除杂，正丁醇萃取，AB-8
大孔树脂，MCI凝胶柱分离纯化得无患子总皂苷，鉴
定主要为齐墩果酸型三萜皂苷，纯度可达95.2%，可
作为无患子总皂苷质控品。无患子皂苷是一类结构
相似的混合物，由于其具有多样性与复杂性，单个皂
苷分离十分困难，关于无患子皂苷的化学组成的研
究一直是一大难题。本文的研究内容为进一步分离
无患子皂苷单体奠定了坚实的基础。
参考文献
[1] Simone CBG，Eloir PS，Valquiria LB．HPLC method to assay
saponins in Ilex paraguariensis aqueous extrat[J]． J Braz Chem
Soc，2005，16（4）：723-726.
[2] Sezgin C-AE，Artik N． Determination of saponin content in
turkish tahini halvah by using HPLC[J]． Advance Journal of Food
Science and Technology，2010，2（2）：109-115.
[3] Combarieu ED，Falzoni M，Fuzzati N，et al． Identification of
ruscus steroidal saponins by HPLC-MS analysis [J]． Fitoterapia，
2003，73：583-596.
[4] Liu J H，Wang X． Analysis of the constituents in the Chinese
drug notoginseng by liquid chromatography-electrospray mass
spectomntry[J]． J Chin Pham Sci，2004，13（4）：225-237.
[5] Ryan D，Robards K，Prenzler P，et al． Liquid chromatography
with electrospray ionization mass spectrometric detection of
phenolic compounds from Olea euro paea[J]． J Chromatogr A，
1999，855（2）：529-537.
[6] Lee MR，Chen CM，Wang BH，et al． Analysis of Saponins from
black bean by rlectrospray ionization and fast atom bombardment
tandem mass spectrometry[J]． Mass Spectrom，1999，34：804-812.
[7] Feng L，Li JL，Zeper A，et al． Structural characterization of
steroidal saponin by electrospray ionization and fast -atom
bombardment tandem mass spectrometry[J]． Rapid Commun Mass
Spectrom，2002，16：1168-1173.
[8] Wang X，Sakuma T，Asafu-AE，et al ． Determination of
ginsenoside in plant extracts from panax ginseng and panax
quinquefolius by LC/MS/MS [J] ． Anal Chem，1999，71：1579-
1584.
[9] 何伟，李伟． 大孔树脂在中药成分分离中的应用[J]． 南京中
医药大学学报，2005，21（2）：134-136.
[10] Shiau IL，Shih TL，Wang YN，et al． Quantification for saponin
from a soapberry（sapindus mukorossi gaertn）in cleaning products
by a chromatographic and two colorimetric assays[J]． J Fac Agr，
2009，54（1）：215-221.
[11] Hamburger M，Slacanin I，Hostettmann K，et al． Acetylated
saponins with molluscicidal activity from Sapindus rarak：
unambiguous structure determination by proton nuclear magnetic
resonance and quantitative analysis[J]． Phytochemical Analysis，
1992，3（5）：231-237.
[12] 高锦明． 植物化学[M]． 北京：科学出版社，2003，267-271.
[13] Hong XS，Yi PY，Hang JP，et al． Adjuvant effect of panax
notoginseng saponins on the immune responses to ovalbumin in
mice[J]． Vaccine，2004，22：3882-3889.
[14] 秦枫，陈玉勇，冒美丽，等． 三七皂苷PNS-5的溶血性及生
物免疫活性研究[J]． 中国医药导报，2008，5（29）：10-11.
[15] Xiang ZB，Tang CH，Chen G，et al．Studies on colorimetric
determination of oleanolic acid in Chinese quince [J] ． Natural
Product Research and Development，2001，13（4）：23-26.
[16] 袁丁，何毓敏，鲁科明，等． Rp-HPLC法测定竹节参药材中
三萜皂苷元齐墩果酸的含量 [J]． 中国药房，2009，20（15）：
1151-1153.
[17] 刁小琴，田晓菊，关海宁，等． 以齐墩果酸为标准品测定大
豆皂甙的研究[J]． 精油加工，2009（11）：53-55.
[18] 刘新清，王小艺 ． 茶皂素含量的分析[J]． 茶叶，2000，26
（2）：81-82.
[19] 钟世红，卫莹芳，古锐． 红毛五加叶中常春藤皂苷元的高
效液相色谱法测定[J]． 时珍国医国药，2010，21（1）：6-7.
[20] 宁正祥． 食品成分分析手册[M]． 北京：中国轻工业出版
图5 无患子皂苷元在香草醛-冰醋酸体系中紫外吸收
Fig.5 The UV graph of sapindus-sapogenin in
vanilin-acetic acid-HClO4 system
波长（nm）
400.00 450.00 500.00 550.00 600.00
1.000
0.750
0.500
0.250
0.000
Ab
s
549.00，0.948
水解条件
三萜皂苷元含量
（mg）
总皂苷含量
（mg）
总皂苷纯度
（%）
回流加热 370 888 88.8
100℃水浴 336 806 80.6
高温高压 412 952 95.2
表2 无患子皂苷水解条件的确定（n=3）
Table 2 Comparation of hydrolysis conditions of
the total sapindus-saponins（n=3）
95
Science and Technology of Food Industry 研究与探讨
2013年第8期
图8 1～10批羊肉多重PCR检测结果
Fig.8 Lamb sample 1~10 for multiplex PCR
M mix 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
400
300
200
bp
该批肉为假冒牛肉的猪肉制品；羊肉制品中，3、4批
（取自流通环环节）无条带，而第5批出现猪、羊条带，
第8批只有猪肉条带，证明这几批羊肉为掺假或假冒
产品。无条带的PCR产物说明这些肉类不属于猪、
牛、羊中任意一种。
3 结论与讨论
研究通过在基因库中比对猪、牛、羊的线粒体基
因细胞色素b（cyt-b）基因序列，寻找三种动物的共同
序列及其特异性序列，确定了针对这三类种常见畜
肉的特异性检测引物体系。实验证明，获得的引物具
有特异性强、灵敏度高的特点，研究所建立的多重
PCR检测方案样品用量少、操作简便、实验灵敏度
高、结果准确可靠，适合作为常规检测的技术手段，
可推广应用。
根据研究发现，牛肉和羊肉中存在不同程度的掺
伪造假现象，其中以羊肉尤为突出。因此，相关部门应
加强对市场上羊肉和牛肉的监管力度，特别是对流通
和餐饮环节的监管，应定期对超市货架和餐馆厨房的
牛、羊肉制品进行抽检，对于存在抽检不合格的商家，
应禁止其牛、羊肉制品的销售，并进行产品的溯源，
严厉打击掺伪造假的生产窝点，依法给予行政处罚。
由于目前并没有相关的法律法规对肉制品中的
肉类含量进行规定，市面常见的肉制品及肉类加工
产品均未标明各成分的含量。因此，本研究的检出限
完全可以满足相关部门对肉类检测的技术要求。随
着相关法律、政策的完善，以后可能会对检测检出限
提出更精确的要求，即对DNA进行准确的定量，以满
足实际应用的需要。据此，可根据本研究，采用荧光
定量多重PCR的方法，进一步对样品的DNA含量进
行定量，从而实现极微量甚至痕量肉源的检测。基于
该研究的多重PCR技术，同样可以用于饲料中牛源
成分、肉类制品中微生物残留[15]等热点问题的研究。
参考文献
[1] Aguado V，Vitas A L，Garcia -Jalon ． Random amplified
polymo rphic DNA typing applied to the studies of cross -
contamination by Listeria monocytogenes in processed food
products[J]． Food Protection，2001，64（5）：7l6-720.
[2] 杨清文，王发强，任锁成，等． 常见性状异常肉的鉴定与处
理[J]． Journal of Animal Science and Veterinary Medicine，2010，
29（5）：94-95.
[3] Hubalkoval Z，Kralik P，Tremlova B，et al． Methods of gadoid
fish species identification in food and their economic impact in
the Czech republic：a review[J]． Veterinarni Medicina，2007，52
（7）：273-292．
[4] Wintero A K，Thomsen P D，Davies W ． A comparison
of DNA - hybridization， immunodiffusion， countercurrent
immunoelectrophoresis and isoelectric focusing for detecting the
admixture of pork to beef [J]． Meat Science，1990，27（1）：75-85．
[5] Magdsiena M，Edward P． Species identification of meat by
electrophoretic methods[J]． Acta Sc Pol Technol Aliment，2007，6
（1）：5-16．
[6] 林世武，李学花． 羊肉和猪肉的快速鉴定方法[J]． 肉品卫
生，2002（9）：36.
[7] Tartaglia M，Saulle E，Pestalozza S，et al． Detection of bovine
mitochondrial DNA in ruminant feeds：a molecular approach to
test for the presence of bovine -derived materials[J]． Journal of
Food Protection，1998，61（5）：513-518.
[8] Lahiff S，Glennon M O B L，Lyng J，et al. Species specific
PCR for the identification of ovine，porcine and chicken species
in meta and bone meal（MBM）[J]. Molecular and Cellular Probes，
2001，15（1）：27-35.
[9] Lahiff S，Glennon M，Lyng J，et al． Real －time polemerase
chain reaction detection of Bovine DNA in meat and bone meal
samples[J]． Journal of Food Protection，2002，65（7）：1158-1165.
[10] 陈颖，吴亚君，徐宝梁，等． 进出口动物源性产品中牛羊成
分的检测方法[J]． 食品工业科技，2004，25（8）：143-145.
[11] 孙艳华，张智禹，牛晋阳，等． PCR法快速检测熟肉制品中
肉类来源[J]． 食品研究与开发，2010，31（5）：139-142.
[12] 宗卉，范万红，温燕辉． 应用多重PCR同时检测牛、羊源性
成分[J]． 中国食草动物，2006，26（6）：21-23.
[13] 李杰，乔绪稳，余兴龙，等． 快速鉴定猪肉和牛肉多重PCR
方法的建立及初步应用[J].湖南畜牧兽医，2011，162（2）：13-15.
[14] 沙才华，杨素，廖秀云，等． 应用三重PCR方法鉴别肉制品
中猪和牛源性成分[J]. 检验检疫，2011，272（12）：52-53
[15] 杨平，杨迎伍，陈伟，等． 食品中4种致病微生物的多重PCR
快速检测技术研究[J]. 西南大学学报：自然科学版，2007，29
（5）：90-93.
（上接第85页）
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
社，1997.
[21] 王晓淳． 高效液相色谱-质谱联用分析无患子中的表面活
性物质[J]. 高等学校化学学报，2006，19（6）：529-531.
[22] 杨运云，郭鹏然，陈怡禄，等． 高效液相色谱-质谱法快速
鉴定复方毛冬青冲剂中三萜皂苷活性成分[J]． 分析化学研究
简报，2009，37（10）：1523-1527.
[23] Huang HC，Liao SH，Cheang FR，et al． Molluscicidal saponins
from Sapindus mukorossi，I nhibitory agents of Golden Apple
Snails，Pomacea canaliculata [J]． J Agr Food Chem，2003，51：
4916-4919.
[24] Saxena D，Pal R，Dwivedi AK，et al． Characterisation of
sapindosides in Sapindus mukorosii saponin（reetha saponin）
and quantitative determination of sapindoside B [J] ． Journal of
Scientific & Industrial Research，2004，63（2）：181-186.
[25] 李锐，周燕，杨永成，等． 无患子皂苷成分的串联质谱分析
[J]． 高等学校化学学报，2006，27（1）：52-54.
96