全 文 ：第 14 卷第 2期
19 9 4 年6 月
西 南 林 学 院 学 报
JO N U A R LO O F SH U TWE STO F RE S丁O Y C R L L卜 GE
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14No
_
2
云南松思茅松地盘松种子同工酶谱研究
陈冲 荣 文 方德 马芳 莲 一】 吴展奎 2
( 西南林学院林业系 , 昆明 , 6 5 0 2 2 4 )
摘要 本 文研 究 了云 南松 、 思 茅松 、 地盘 松种 子 萌发 时的过氧化物酶 、 醋酶和酸
性磷酸酶 同工酶 谱特征 。 结 果表明 , 这三 类种 子在每一种 同工酶谱 中都 有明 显 的
种 间差异 。 但过氧化物酶 同工酶谱随着种 子 发 芽天数的增加 而 变化 , 酶谱难 于确
定 。 醋酶和酸性磷酸酶则比较稳 定 , 三 类种 子 的特征酶带也比 较 多 , 酶谱容 易确
定 , 可 作 为鉴别这三 类外观十分 相似的种 子 的生理指标 。 此外 , 还讨论 了同工酶
谱 相似度 ( s) 在研 究这三个树种 的 亲缘关 系及 其 演化中的应 用 问题 。
关键词 : 云 南松 ; 思茅松 ; 地盘松 ; 同工酶谱
云南松 ( 尸in su y o n n a ne sn is ) 主要分布在云南西北部和四川西南部 , 是我国西南地区
的 币要经 济林木 , 广泛 用于建筑 、 造纸 、 采 脂等 ; 思茅 松 ( 尸 in us k es iy “ va r . la n -g
h l’ ,阴 5 15) 是云南特有用材树种 , 树干通直 , 速生 , 自然分布于云南热带北缘和亚热带南
部 平湿润地区 ; 地盘松 (尸 in us y un n a en sn is v ar . 刀少g用ae a) 分布范围与云南松基本一致 ;
丛状矮生 , 被地植物学家认为是云南松的生态变种 〔’ , 2 〕 ; 无造林价值 ; 但在山地水土保
持和提供农村薪炭能源方面有些作用 〔2〕 。
由于云南松 、 思茅松和地盘松的种子在外观上十分相似 , 难于区分 , 生产部门对这些
种子的采收 、 贮存 、 购销以及造林等方面存在许多困难 , 急于寻求科学的鉴别方法 。 本研
究根据同工酶 谱种属专一性原理 , 分析 了这些种子的过氧化物酶 , 醋酶和酸性磷酸酶 同工
酶谱 , 试图在分子水平上把它们区分开来 。 同时讨论了同工酶谱相似度在研究云南松 、 思
茅松和地盘松的种质起源及演化中的应用问题 。
1 材料和方法
1
.
1 材料来源及处理
云南松 、 思茅松和地盘松种子均系云南省林木种子公司提供 , 纯种 ; 于 1 9 91 年冬分
别采 自云南会泽 、 景谷 、 大姚县境内 。 种子浸抱 l d 后用 10 % H Zo : 浸饱 l h , 然后用
蒸馏水冲洗 3 次 , 保湿培养 〔 (2 5 士 l) ℃ 〕。 胚轴长 1 c m 以上的发芽种子供作实验 。
1
.
2 过氧化物酶 同工酶谱测定
, 现在四川林业西吕技 卜 产校
! 9 9 3 0 8 2 7 收 稿
“ 现在 石南弥 勒八 边林 心一 局
2 期 陈坤荣等 : 云 南松思 茅松地盘松种子同 工酶谱研究 9 7
称取 1 9 萌发 种子 加 入 Z m l 电极 缓 冲液 在 冰 浴 中研 磨 成 匀浆 , 7 0 0 0 x g 离心
巧 m in , 上清液 为酶液 。 聚 丙烯酸胺浓 度 7 . 5% , 过硫酸按催化 聚合 。 电极 缓冲液为
T ir s一甘 氨酸 , p H 8 . 3。 酶 液进 样 量 50 川 / 管 , 低 温 中 ( 8℃ ) 电 泳 。 初 始 电 流为
1 m A / 管 , 30 m in 后调至 2 m A / 管 。 待澳酚蓝指示剂到达距端 点 1 c m 处停止 电泳 。
采用抗坏血酸一联苯胺染色 。
1
.
3 醋酶 同工酶谱测定
采用等电聚焦电泳法 。 将 4 0 % 两性电解质载体 A m p h o li n e ( v H 3 . 5一 。 ) 0 . 1 5 m l 与
丙烯酞胺 制成 7 . 5%凝 胶 , 酶液进样 量 50 川 / 管 , 阴极以 0 . 4% 的三 乙醇胺 , 阳极以
.0 2% 的硫酸作电泳液 ; 电泳 4 h , 电泳结束后用蒸馏水冲洗 。 染色采用 二 , 刀醋酸蔡醋坚
牢蓝溶液染色 。
1
.
4 酸性磷酸酶同工酶测定
采用等 电聚焦电泳法 。 其制胶 、 酶液进样量 、 电泳等过程均与醋酶同工酶测定方法相
同 。 染色液为 : 一磷酸蔡醋钠盐 ( 5 0 m g ) , 坚牢蓝 B 盐 ( 1 0 0 m g ) , 溶于 10 0 m l p H 5 . 0
的醋酸缓冲液 中。 于 37 ℃下染色到桃红色出现 。 脱色液 中脱色后扫描 。
以上三种同工酶均用圆盘电泳 , 每个样品三个重复 。 电泳后脱色的胶条用微量光密度
计扫描 , 波长均为 5 80 n m 。
酶谱相似度 3[, 4〕 s - 相同酶带数两个比较种同工酶带平均数 x 10 0%
2 实验结果
.2 1 过氧化物酶同工酶谱
云南松 、 思茅松和地盘松的种子萌发后第 4 , 8 , 12 d 的过氧化物酶 同工酶谱差异较
大 , 酶带数增减无规律 , 但这三类种子都以发芽后第 12 d 的酶带数较多 , 说明这时的基
因表达较充分 。 本文主要分析了它们发芽后第 12 d 的同工酶谱特征 。 结果表明 , 云南松
有 or 条酶带 , 思茅松 7 条 , 地盘松 9 条 。 把它们的迁移率 ( R了植 ) 差异不大于 .0 01 者
视为相同酶带进行编号 , 共有 13 条酶带 , 酶谱 中的第 2 , 7 , n 为这三类种子的相同的基
本酶带 , 见图 1。
云南松与思茅松的酶带总数 17 条 , 编号 2 , 4 , 6 , 7 , H , 12 为两者相同的酶带 , 酶
谱相似度 70 . 6% 。 云南松有 3 条 自己的特征酶带 ( 3 , 8 , 13) ; 而思茅松只有 1 条特征酶
带 ( 9 ) 。
云南松与地盘松的酶带总数 19 条 , 其 中有 6 条为相同酶带 (2 , 3 , 7 , 8 , 1 , 13 ) ,
酶谱相似度 63 .2 % 。 云南松的特征酶带 3 条 (4 , 6 , 10 ) ; 地盘松也有 3 条 自己的特征酶
带 ( l , 5 , 9 ) 。
思茅松与地盘松共有 16 条酶带 , 其中 4 条为相同酶带 (2 , 7 , 9 , 1 1 ) , 酶谱相似度
为 5 0 % 。 思茅松的特征酶带 3 条 ( 4 , 6 , 12 ) ; 地盘松 5 条 ( l , 3 , 5 , 8 , 13 ) 。
1几述表 明 , 地盘松与思茅松或地盘松与云南松之间 , 各 自的特征酶带较多 , 较易区
分 ; 石南松 与思茅松之间 , 因思茅松的特征酶带只有 1条 , 其它酶带都可在云南松的酶谱
中找到 、 因此 , ,憋茅松的酶 ,LR有可能被认 为是云南松基因表达不全的结果 , 难 于区分 。
西 南 林 学 院 学 报 14 卷
云渭松 愚 茅 舟乌 地 盘粉
图 1 过氧化物同工酶谱
李启任等 〔’ 〕测定成熟叶片 , 云南松与思茅松的过氧化物酶 同工酶谱相似度 57 % ; 云
南松与地盘松 87 . 5% , 认为地盘松与云南松的亲缘关系密切 , 是云南松的生态 变种 。 但
本研究表明 , 云南松与地盘松的酶谱相似度只有 63 . 2% ; 云南松与思茅松为 70 . 6% , 似
乎表明 , 云南松与地盘松的亲缘关系还不及与思茅松密切 。 问题在于过氧化物酶同工酶谱
相似度能否准确反映种质起源及演化特点 。 许多报道都表明 〔’ 一 8 〕 , 过氧化物酶同工酶谱
与不同生长发育期 , 不同组织器官 , 不同年龄 , 部位以及特定环境条件等有相关变化 。 因
此 , 对某植物过氧化物酶谱型的确定不大容易 , 准确统计种间同工酶谱相似度较为困难 。
.2 2 醋酶同工酶谱
醋酶 同工酶谱 比较稳定 , 种子发芽后 6 一 18 d 所测定的同工酶谱基本一致 。 图 2 为
种 子发芽后第 s d 的 同工酶谱 。 云南松有 9 条酶带 , 思茅松 1 条 , 地盘松 1 条 , 它们
之 l’irJ 相同的酶带 5 条 ( l , 4 , 7 , 10 , 1 3 ) 。
云南松与思茅松共有酶带 2 0 条 , 有 7 条相同 ( l , 4 , 7 , 9 , 10 , 13 , 14 ) , 酶谱相似
度为 7 0 % ; 云南松的特征酶带 2 条 ( 3 , 1 2 ) ; 思茅松 4 条 ( 2 , 5 , 6 , 1 1) 。
云南松 与地盘松的酶带共 20 条 , 有 7 条相同的基本酶带 (l , 3 , 4 , 7 , or , 12 ,
13 )
, 酶谱相似度 7 0% 。 云南松的特征酶带 2 条 ( 9 , 14 ) ; 地盘松 4 条 ( 5 , 6 , 8 , 1 1 ) 。
思茅松与地盘松共有 2 2 条酶带 , s 条为相 同的基本酶带 ( l , 4 , 5 , 6 , 7 , 1 0 , 1 1 ,
13 ) ; 酶谱 相似度 7 2 . 7% 。 思茅松的特征酶带 3 条 ( 2 , 9 , 14 ) ; 地盘松 也有 3 条 ( 3 ,
8
, 12 )
。
上述结果表明 , 云南松 、 思茅松和地盘松的种间酶谱相似度都很接近 , 约 70 % ; 而
且各种问的特征酶带数也基本相同 (2 一 4 条 ) 。 由于醋酶 同工酶谱在种子不同发芽天数中
比较稳定 , 屯现性好 ; 特征酶带较 多 ; 用来区分这二类不同的种 子比过氧化物酶同工酶谱
要容易 些 。
2 期 陈坤荣等 : 云南松思茅松地盘松种 子同工酶 谱研究 99
3任
5 6
l 4
l 4
l 3
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12
l 0
1 0
云南松 思茅松 地盘松
图 2 醋酶同工酶谱
编
1 S
1 ,
1 3
1 3 16
} 4
云 南松 界茅松 地盘松
图 3 酸性磷酸酶同」_:酶谱
10 0 西 南 林 学 院 学 报 14卷
2 3 .酸性磷酸酶同工酶谱
酸性磷酸酶对植物的生长发育有重要的调节作用 川 。 但用其同工酶谱进行种质鉴定
的报道较为少见 。 本实验测定了云南松 、 思茅松和地盘松种子发芽后第 8 天的酸性磷酸酶
同工酶谱 (图 ) 3。 结果表明 , 云南松有 1 条酶带 , 思茅松 13 条 , 地盘松 1 条 。 它们的
相同酶带 3 条 ( 2 , 9 , 1 0 ) 。 云南松特有的酶带 l 条 ( 14 ) ; 思茅松 3 条 ( 3 , 4 , 5 ) ; 地盘
松没有 自己特有的酶带 , 它的所有酶带可在云南松或思茅松 中找到 。
但在云南松与思茅松之间 , 共有酶带 2 4 条 , 其 中相同的酶带只有 6 条 (2 , 6 , 8,
9
, 10
, 1 2 )
, 酶谱相似度 5 0% 。 云南松的特征酶带 5 条 ( 1 1 , 1 3 , 14 , 16 , 18 ) ; 思茅松
7 条 ( l , 3 , 4 , 5 , 7 , 15 , 17 ) 。
云南松与地盘松的总酶带数 2 条 ; 相同酶带数 7 条 (2 , 9 , 10 , 1 , 13 , 16 , 18 ) ,
酶 谱相似度 6 3 . 6% 。 云南松的特征酶带 4 条 ( 6 , 8 , 1 2 , 14 ) ; 地盘松也有 4 条 ( l , 7 ,
15
,
1 7 )
。
思茅松与地盘松的总酶带数 24 条 ; 相同酶带数 7 条 ; 酶谱相似度 58 . 3% 。 思茅松的
特征酶带 6 条 ( 3 , 4 , 5 , 6 , 8 , 12 ) ; 地盘松 4 条 ( 1 1 , 13 , 16 . 18 ) 。
七述结果表 明 , 云南松与思茅松 , 云南松与地盘松 , 思茅松与地盘松之间的酶谱相似
度都较低 , 为 50 % 一 64 % , 说明种间差异较大 , 亲缘关系不密切 。 但各个种间的特征酶
带较多 , 进行种质鉴定比较容易 。
3 讨 论
醋酶被广泛用 于小麦 〔 ’ ” 〕和水稻 4[, ” , ’ 2 〕 的种质起源及其亲缘关系的研究 。 其同工
酶 谱为细胞核基因组编码 , 具有早期表达 , 稳定 , 无组织器官特异性等特点 〔 ’ 2〕 , 是比较
好的鉴定核基因组差异的酶标 。 本研究也表明 , 在云南松 、 思茅松和地盘松种子萌发后的
近半个月中 , 醋酶同工酶谱都比较稳定 , 重现性好 , 三类不同种子的特征酶带也较多 , 容
易区分 。 酸性磷酸酶 同工酶谱也容易区分这三类种子 , 相对稳定 , 各 自的特征酶带较 多 。
过氧化物酶同工酶谱不够稳定 , 重现性差 , 甚至发芽相隔仅 l d , 酶带数增减较大 , 用以
区分这些种子较为困难 。
有人用过氧化物酶 〔’ 〕和醋酶 〔 4〕 同工酶谱相似度分析种质起源和演化 , 但很少有人
同时用多种同工酶谱相似度综合分析比较 。 从本实验结果来看 , 云南松 、 思茅松和地盘松
的过氧化物酶 、 醋酶及酸性磷酸酶 同工酶谱相似度差异较大 , 很难根据某一同工酶谱相似
度对它们之间的亲缘关系得 出统一的结论 。 如 , 云南松和思茅松 曾被认为是地理替代现
象 , 思茅松是 由西向东分布的变种 〔 ’ 〕 ; 李启任等测得云南松与思茅松的过氧化物酶同工
酶谱相似度为 57 % 〔 ’ 〕 ; 本研究中 , 过氧化物酶和醋酶的 同工酶谱相似度却高达 70 % ;
而酸性磷酸酶 同工酶谱相似度只有 50 % 。 说明不 同的同工酶谱相似度差异较大 , 难于反
映其亲缘关系 ; 又如 , 思茅松与地盘松 , 地植物学家很少讨论其亲缘关系 , 但本实验 中的
醋酶 同工酶谱相似度高达 72 . 7% , 两者的亲缘关系似乎较密切 。 但过氧化物酶和酸性磷
酸酶 同工酶谱相似度分别只有 47 % 和 58 . 3% , 亲缘关系又显得很不密切 。 地盘松被认为
是云南松的生态变种 , 是矮化型石南松 , 有 人种 mlJ 得其过氧化物酶同 [ 酶谱相似度为
87
.
5% 〔 ’
一
, 。 但在本实验 中 , 它们的过氧化物酶 、 酉污酶和酸性磷酸酶 同上酶谱相似度都在
2 期 陈坤荣等 :石 南松思 茅松地 盘松种子同 五酶谱研究 10 1
0 7 %以 \ I’ , 表明亲缘关系并不密切 。 可见 , 用同工酶谱相似度讨论种质起源及种间的亲
缘关系 , 受 许多因素的制约 。 首先是选择能正确反映种间亲缘关系的同工酶谱比较困难 ,
日前 , 尚无公认的酶谱 , 这是关键 问题 , 这个问题未解决 , 同工酶谱相似度的统计将失去
科学性 。 如 , 有人 曾测得云南松与马尾松的过氧化物酶 同工酶谱相似度为 87 . 5% , 地盘
松与湿地松为 90 . 5% 〔’ 〕 。 这些比较种在分类学上的亲缘关系相差甚远 ; 而过氧化物酶同
工酶谱相似度在统计学 上却关系密切 , 这类统计就没有什么意义 。 其次是某一物种同工酶
谱型的确定和识别也不太容易 , 要做许多工作 。 因为基因的表达受控于环境条件和时空顺
序 , 不能简单地根据某一酶谱中酶带数的增减来判断基因存在与否 。 本实验 中过氧化物酶
同工酶谱随种子发芽天数而变化 , 难于确定 , 就是一例 。 此外 , 图谱识别存在技术条件问
题 。 本实验曾采用肉眼观察绘图或照相的办法识别图谱 , 同时将同一胶条用微量光密度计
扫描 , 所得到的两种 图谱相差很大 , 后者比较精确 , 肉眼 无法识别的酶带也能表现出来 。
因此 , 同一样品 , 酶谱相似度的统计将可能发生技术性的变化 , 具体应用有待深入研究 。
致谢 : 云南省林木种子公司的李基平和钟椒英同志提供实验材料 , 并关心 、 支持本研究 。 特致谢
参 考 文 献
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S Pe e i n e P e r o x z d a s e z s o e n z y m e s a r e e o r r e e t e d w l t h o r g a n o g e n e s l s
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19 8 7
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9 9一 10 5
9 C h e n K u n 一 r o n g , W e n F a n g一 d e , L I Z h o u 一 Ji e e t a l
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A d v a n c e s z n th e s c 一e n c e a n d t e e h n o lo g y o f s e e d s S e l e n e e P r e s s , B e 1Ji n g , N e w Y o r k ,
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10 2西 南 林 学 院 学 报 14卷
ST U DIE SON T H E I SOZ Y ME P AT T E N R SOT FH E SE E D S
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, e s t e r a s e
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t h e t h r e e k i n d s o f s e e d s w e r e c l e a r i n e a e h t y P i c a l i s o z y m e P a t t e nr
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P a t t e r n s e h a n g e d w i t h t h e i n e r e a s i n g o f g e r m i n a t i o n d a y s o f s e e d s
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P h o s P h a t a s e w e r e r e l a t iv e l y s t e a d y
, a n d t h e r e w e r e m o r e s P e e i if e i s o z y m e b a n k s i n t h e s e
s e e d s t h a n i n t h o s e o f t h e i s o p e r o x id a s e p a t t e r n
, 50 i t 15 e a s y t o d e t e mr i
n e t h e s e tw o k i n d s
o f i s o z y m e P a t t e r n s
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T h e i s o z y m e P a t t e r n s o f e s t e r a s e a n d a e i d P h o s P h a t a s e m a y b e e o n s id
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r e n t i a t e t h e s e t h r e e k i n d s o f s e e d s w h i e h w e r e v e r y
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B e s i d e s t h e a b o v e
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-
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