全 文 ：第 27 卷 第 2期
2008年 4 月
电　子　显　微　学　报
Journal of Chinese Electron Microscopy Society
Vol-27 , No.2
2008-04
文章编号:1000-6281(2008)02-0146-06
Latrunculin B处理后青 花粉管微丝骨架和细胞
超微结构的观察
田翠婷1 , 2 ,郑茂钟1 ,罗茂春2 ,3 ,林金星2 ,吕洪飞1 ,2＊
(1.浙江师范大学生命科学学院 ,浙江 金华 321004;2.中国科学院北京植物研究所 ,北京 100093;
3.福建龙岩学院生物系 ,福建 龙岩 364000)
摘　要:本文应用荧光探针标记技术和透射电子显微镜研究微丝抑制剂(latrunculin b , LATB)处理青 花粉管后 ,对
其微丝骨架和超微结构的影响。结果表明:LATB 剂量依赖性地抑制青 花粉萌发和花粉管生长;应用荧光探针
FITC-鬼笔环肽标记花粉管中的微丝 ,发现用正常培养基培养的花粉管中 , 束状的 F-actin 以与花粉管长轴平行的方
向排列 ,从花粉管基部一直延伸到花粉管亚顶端 ,而 LATB 处理导致微丝的解聚。通过透射电镜观察发现 , LATB处
理使花粉管顶端的透明区消失 ,顶端区域被一些空泡 、脂粒等占据 , 线粒体膜破裂 , 高尔基体片层断裂成泡状结构
以至解体。上述研究结果表明:微丝抑制剂 LATB通过破坏花粉管微丝的组装和超微结构影响青 花粉萌发及花
粉管生长 ,因此微丝在青 花粉萌发 、花粉管极性生长模式的建立和维持过程中起重要作用。
关键词:青 ;花粉;花粉管;微丝;超微结构;微丝抑制剂
中图分类号:Q949.6;Q944.42;Q944.44;Q248;Q336　　文献标识码:A
　收稿日期:2007-05-14;修订日期:2007-06-17
　基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.30370088).
　Foundation item:National Natural Science Foundation of China(No.30370088).
　作者简介:田翠婷(1982-),女(汉族),黑龙江人 ,硕士.
＊通讯作者:吕洪飞(1963-),男(汉族),浙江人 ,教授.
　　花粉管作为有花植物受精过程中雄性生殖单位
的载体 ,它的萌发及其伸长等一系列生理活动 ,直接
影响着受精过程能否顺利完成 ,该过程是当今植物
生殖生物学领域的研究重点之一。由于花粉管的生
长只局限于顶端区域 ,即极性生长 ,该过程的高度极
性化与微丝骨架系统有着密切的关系 ,因此 ,利用花
粉管系统研究微丝骨架及其在生物体内的功能也是
目前最活跃的研究领域之一[ 1] 。近年来的研究表
明 ,微丝是细胞骨架的重要组成部分 ,它在花粉萌发
和花粉管生长中执行着多种功能 ,其中包括维持和
建立细胞极性 ,参与细胞质流动与细胞器的运动 ,以
及对各种环境刺激做出反应等[ 2] 。同时人们还发
现 ,在自交不亲和反应中 ,微丝也是钙信号破坏过程
中的一个目标 ,大多数这些信号都传达到第二信使 ,
并与离子和活性氧一起参与到花粉管顶端生长过程
中。这些第二信使会与微丝结合蛋白相互作用 ,从
而影响微丝骨架的动态变化;反之 ,微丝骨架的动态
变化也会影响与极性生长相关的其它过程 ,如分泌
小泡的运输[ 3] 。由于被子植物花粉管具有生长速度
快 、易于操作等特点 ,因此目前人们在研究微丝骨架
调控细胞生长机理方面 ,常以被子植物花粉管作为
研究对象 ,而对裸子植物花粉管生长机理的研究则
甚少[ 4] 。特别是裸子植物花粉管的生长速度缓慢 ,
且其细胞壁结构与胞内细胞器的分布模式又与被子
植物花粉管有较大差异[ 5] ,那么微丝骨架对被子植
物花粉萌发和花粉管生长的作用机制 ,是否也同样
适用于裸子植物 ,目前尚不明确 。本文将以裸子植
物青 (Peced wilsonii)花粉为材料 ,系统研究微丝抑
制剂 LATB对其花粉萌发和花粉管生长的影响 ,并
观察青 花粉管经微丝抑制剂 LATB处理后其细胞
超微结构的变化 ,从而为进一步阐明微丝在裸子植
物花粉萌发 、花粉管生长过程中的作用机制提供基
础资料。
1　材料与方法
1.1　材料
实验材料为裸子植物松科云杉属的青 花粉 ,
栽培于中国科学院植物研究所植物园内生长良好的
成年大树 。2006年 4月于青 花粉散粉之前采集
成熟的孢子置于室温下过夜 ,待散粉后 ,用无菌干燥
小瓶收集花粉 ,并保存在-20℃的冰箱中备用。
1.2　花粉离体培养
花粉于 100%湿度的容器中室温水合 30 min
后 ,以 1 mg mL的浓度接种于液体培养基中 。采用
作者曾研究确定的青 花粉管离体生长的基本培养
基配方[ 6] :12%蔗糖+0.02%H3BO3+0.03%CaCl2 。
花粉接种于基本培养基中作为对照。参考 Chen
等[ 7] 方法 ,花粉接种于含 10 nmol L , 20 nmol L , 30
nmol L的微丝抑制剂 LATB[ 购自 SIGMA 公司 ,溶于
DMSO(二甲基亚砜)中] ,检测 LATB对花粉萌发 、花
粉管生长的影响 。
1.3　花粉萌发率 、花粉管生长速度的测定和形态观
察
花粉萌发实验表明 ,不同培养基培养的青 花
粉萌发率一般在 18 h达到最大值 ,为了保证所统计
的同一时间上的样品在培养时间上的一致性 ,每个
时间间隔随机抽取的样品(含培养基)都先以等浓度
蔗糖的3%多聚甲醛溶液固定30 min ,然后置于光学
显微镜下观测 ,统计花粉的萌发率。当花粉管的长
度大于花粉粒的直径时 ,则被认为花粉粒已萌发 。
根据公式:萌发率=萌发的花粉数 总的花粉数×
100%计算出萌发率 。每个实验重复 3次 ,每次所统
计的花粉粒数目不少于 200粒 。
花粉培养 12 h后 ,每隔 6 h取少量样品 ,用含与
培养基等浓度蔗糖的3%多聚甲醛溶液固定30min ,
在光学显微镜(Olympus)下选取已萌发的花粉进行
测量。每个样品至少测定 200个花粉管 ,计算出平
均长度和标准差。花粉管形态的摄影在 Zeiss
Q500IW型相差显微镜下进行 。
1.4　荧光探针标记花粉管中的微丝骨架
培养 18 h的花粉管(对照和处理)在新鲜配制
的4%多聚甲醛溶液(50 mmol L PIPES 缓冲液 , pH
6.9配制)中固定 1 h ,并同时抽气 3 min ～ 5 min。用
50 mmol L PIPES 缓冲液彻底清洗后 3次 ,以含有
1%Triton X-100的 PBS(pH 7.2)抽提1 h 。再用含有
1 mg mL NaBH4 的PBS处理 15 min ,以去除醛基产生
的荧光。经清洗后 ,加FITC标记鬼笔环肽(1∶100稀
释母液 ,最终浓度 1 μmol L),室温孵育 2 h ～ 3 h后
清洗 、封片 ,并置激光共聚焦显微镜下(ZEISS LSM
510 META)观察 , 激发波长 488 nm。每个样品取
20个～ 50个不同光切面扫描 ,最后将所有光切面的
图像叠加成像。
1.5　电镜观察花粉管的超微结构
对照和 LATB处理的花粉管培养 20h 后 ,过滤
去除培养基 ,PBS(0.1 mol L PBS配制 ,pH 7.2)清洗
3次后 ,以预冷的含 2.5%戊二醛 (0.1 mol L磷酸缓
冲液 pH 7.2 ,另加 2%多聚甲醛)固定材料 2 h 。经
PBS(0.1 mol L PBS配制 , pH 7.2)清洗 3次后(每次
10 min),用 1%锇酸(0.1 mol L PBS 配制 ,pH 7.2)再
固定 2 h。样品用系列乙醇冲洗 ,环氧丙烷过渡 ,
Epon812树脂包埋 ,热聚合 。用 LKB-V 超薄切片机
切片 ,切片厚度为 70 nm , 以 50 目铜网捞取。染色
后在 JEM-1230型电子显微镜下观察 、拍照。
2　结果
2.1　LATB对青 花粉萌发和花粉管生长的影响
通过不同培养基培养的青 花粉萌发率一般在
18 h达到最大值 ,此后仍不能萌发的花粉视为异常
花粉 。为了检验 LATB对青 花粉萌发和花粉管生
长的影响 ,不同剂量的 LATB (0 nmol L , 10 nmol L ,
20 nmol L , 30 nmol L)于花粉培养的初期 (0 h)被
分别加入到培养基中。结果发现:LATB对青 花粉
萌发具有显著的剂量依赖性的抑制作用。如图 1所
示 ,花粉培养 18 h 后 , 经 10 nmol L , 20 nmol L , 30
nmol L LATB处理组花粉的萌发率仅分别为64.2%,
46.2%和 24.7%, ;而对照的萌发率已经达到
75.9%,两者之间存在显著性差异(P <0.001)。
图 1　LATB 对花粉萌发的影响。
Fig.1　Effects of LATB on pollen germination.
　
通常 ,青 花粉萌发后 ,平均以 13.6μm h的速
率生长 ,培养30 h后 ,花粉管平均长度达到244.9μm ,
此后花粉管的生长则趋向缓慢 。而经过 10 nmol L ,
20 nmol L , 30 nmol L LATB 处理的花粉管生长速率 ,
分别为10.45μm h(10 nmol L),7.72μm h(20 nmol L),
5.00μm h(30 nmol L)。相应地 ,经过30 h培养后花粉
管平均长度分别为188.2μm , 138.9μm , 90.1μm 。对
照和处理之间的差异极显著(P<0.001)。由此可见 ,
LATB 不仅抑制了花粉的萌发率 ,而且还使花粉管的
生长受到明显抑制(图 2)。
通过光学显微镜观察发现 ,青 花粉萌发后 ,其
147第 2 期 田翠婷等:Latrunculin B处理后青 花粉管微丝骨架和细胞超微结构的观察 　　
图 2　LATB 对花粉管生长的影响。
Fig.2　Effects of LATB on pollen tube growth.
　
花粉管顶端出现一个帽状透明区 ,在透明区之后为
富含各种细胞器区域(图 3a),此种结构特征将一直
保持到花粉管停止生长为止。而经 10 nmol L LATB
处理后 ,花粉管的形态发生变化 ,其中最明显的是花
粉管分叉 、螺旋甚至扭曲 , 以及生长速度减慢等
(图 3b)。
2.2　LATB对青 花粉管中微丝骨架的影响
在激光共聚焦显微镜下观察表明 ,正常培养基
中培养 18 h的花粉管中 ,束状的F-actin以与花粉管
长轴平行的方向排列 ,从花粉管基部一直延伸到花
粉管亚顶端。和基部的粗 F-actin束相比 ,花粉管顶
端和亚顶端之间是一个由致密的 ,但仍和花粉管长
轴方向平行排列的精细肌动蛋白丝组成的领区
(collar),在正常生长的花粉管中将一直保持这种微
丝分布模式(图 3c , 3d)。经 10 nmol L LATB处理的
青 花粉管中 ,F-actin的排列发生明显变化:正常花
粉管中从花粉管基部延伸到花粉管亚顶端的束状
F-actin被解聚成短的 F-actin片段(图 3e),同时这些
短的 F-actin 片段还交织成网状 ,前移到花粉管顶
端 ,使顶端不再呈现 collar形微丝。当 LATB浓度增
加到 20 nmol L时 ,解聚情况则更加严重(图3f),由此
表明 ,抑制剂处理可导致花粉管中微丝骨架的破坏。
图 3　LATB 对花粉管形态和微丝骨架的影响。a:正常条件下生长的花粉管;b:10 nmol L LATB 处理后花粉管的群体形态;
c , d:正常培养基中培养 18h 的花粉管中的微丝;e:LATB 处理 18 h 后花粉管的后花粉管中的微丝;f:LATB 处理后花粉
管的后花粉管中的微丝。 a , b:Bar=100μm;c～ f:Bar=50μm
Fig.3　Effects of LATB on pollen tube morphology and actin skeleton.a:Pollen tube in standard medium;b:Pollen tube in medium
containing 10n mol L LATB;c , d:Actin in control pollen tubes cultured for 18 h;e:Actin in 10 nmol L LATB-treated pollen tubes
cultured for 18 h;f:Actin in 20 nmol L LATB-treated pollen tubes cultured for 18 h.a , b:Bar=100 μm;c～ f:Bar=50 μm
148　 　 电子显微学报　J.Chin.Electr.Microsc.Soc. 第 27 卷
2.3　青 花粉管的超微结构分析
通过透射电镜观察发现 ,在对照培养基中 ,花粉
管的顶端为透明区(clear zone),缺少细胞器 ,主要由
最顶端分泌小泡 、小液泡以及少量线粒体组成(图
4a)。透明区后端为细胞器区 ,充满浓密的细胞质以
及大量的细胞器 ,如内质网 、高尔基体 、线粒体以及
各种小泡 。其中高尔基体有 6个 ～ 8个片层 ,并不
形成特定的区域 。在高尔基体的周围有大量的分泌
小泡和包被小泡(图 4c),线粒体的膜结构完整(图
4d)。与对照相比 ,经 10 nmol L LATB 处理后 ,花粉
管顶端的分泌小泡数量减少 ,透明区消失 ,脂粒和液
泡的数量增加(图 4b),高尔基体直径增加 ,其片层
减少并断裂成泡状结构(图 4e),线粒体膜破裂 ,一
些线粒体还位移到花粉管顶端区域(图 4b , 4f);当
LATB浓度增加到 20 nmol L 时 ,花粉管超微结构的
破坏更加严重 ,其中线粒体嵴的数目开始减少(图
4h),高尔基体进一步解体 ,最终导致高尔基体消失
(图 4g)。
图 4　LATB 对花粉管中超微结构的影响。 a:正常培养基中培养 20 h 的花粉管顶端;b:LATB 处理 20 h 后花粉管顶端;c:正
常培养基中培养 20 h 的花粉管中的高尔基体;d:正常培养基中培养 20 h 的花粉管中的线粒体;e:10 nmol L LATB 处
理 20 h 后花粉管中的高尔基体;f:10 nmol L LATB 处理 20 h 后花粉管中的线粒体;g:20 nmol L LATB处理 20 h 后花粉
管中的高尔基体;h:20 nmol L LATB处理 20 h 后花粉管中的线粒体(a , b:Bar=1 μm;c～ h:Bar=0.2μm)。
CW:细胞壁;M:线粒体;V:液泡;SV:分泌小泡;L:脂体;G:高尔基体
Fig.4　Effects of LATB on ultrastructure in pollen tube.a:Tip in control pollen tubes cultured for 20 h;b:Tip in LATB-treated pollen
tubes cultured for 20 h;c:Golgi stack in pollen tubes cultured for 20 h;d:Mitochondria in control pollen tubes cultured for 20 h;e:
Golgi stack in 10 nmol L LATB-treated pollen tubes cultured for 20 h;f:Mitochondria in 10 nmol L LATB-treated pollen tubes
cultured for 20 h;g:Golgi stack in 20 nmol L LATB-treated pollen tubes cultured for 20 h;h:Mitochondria in 20 nmol L LATB-
treated pollen tubes cultured for 20 h(a , b:Bar=1 μm;c～ h:Bar=0.2 μm).
CW:Cell wall;M:Mitochondria;V:Vacuole;SV:Secretory vesicles;L:lipid body;G:Golgi apparatus
149第 2 期 田翠婷等:Latrunculin B处理后青 花粉管微丝骨架和细胞超微结构的观察 　　
3　讨论
花粉管发育模式已成为各种细胞事件主要的研
究领域之一 ,其极性生长过程受到多种因素的影响 ,
其中包括生长温度 、培养基渗透压 、Ca2+ 、硼酸等[ 8] 。
本文的研究发现 ,微丝抑制剂 LATB剂量依赖性不
仅抑制青 花粉的萌发和生长速率 ,而且还导致花
粉管的形态异常 ,干扰了花粉管的生长方向 ,这与陈
艳梅等人对白 (Picea meyeri)花粉研究的结果比较
一致[ 7] 。此外 ,作者还发现 , 10 nmol L ～ 20 nmol L
LATB对青 花粉萌发和花粉管生长可产生较为显
著的抑制作用 ,而 LATB的这个浓度比 ,Gibbon 等人
在研究被子植物玉米花粉时所用的浓度(40 nmol L
～ 50 nmol L LATB)略低[ 9] ,上述差异可能与物种不
同有关。
花粉管的生长与其它植物细胞不同 ,它具有极
性顶端生长 ,并依赖于生长的花粉管中微丝正常聚
合[ 10] 。微丝是由肌动蛋白单体 G-actin 组成的直径
约7 nm ～ 9 nm 的骨架纤维 , 又称肌动蛋白纤维
(actin filament , AFs)。目前利用荧光标记法观察微
丝的方法 ,主要有抗体间接标记和鬼笔环肽直接染
色两种 。由于微丝抗体在标记 F-actin 的同时也能
标记G-actin ,因此标记后得到的图像常有较高的背
景[ 11 , 12] 。而鬼笔环肽的优点在于能专一性地标记
F-actin ,相比之下 ,较多的实验认为 ,鬼笔环肽直接
染色法能提供相对理想的结果[ 13] 。在本实验中 ,作
者采用 FITC标记的鬼笔环肽观察青 花粉管中微
丝骨架的分布及其变化 ,结果可以看出 ,绝大部分的
花粉管中 ,粗的 F-actin束以与花粉管长轴平行的方
向排列 ,从花粉管基部一直延伸到花粉管亚顶端 ,而
亚顶端的微丝明显比花粉管基部的要精细 ,但排列
仍很整齐 ,而极少部分花粉管中也观察到亚顶端杂
乱无章的微丝网络 。由此认为 ,正常生长花粉管亚
顶端的微丝呈有序排列 ,而在极少数花粉管中也观
察到亚顶端杂乱无章的微丝网络 ,这可能是在固定
过程中未得到良好保存细胞骨架的精细结构所致 。
当用 LATB处理后 ,微丝随着 LATB浓度的增加而逐
渐解聚 ,上述结果与陈彤等人的研究报道比较一
致[ 4] 。
此外 ,花粉管的顶端生长需要完整的分泌系统 。
在花粉管生长期间 ,从高尔基体或早期的内涵体循
环产生的分泌囊泡 ,并携带细胞壁前体物质在微丝
骨架的作用下 ,集聚在花粉管的顶端 ,通过不断与顶
端细胞质膜融合 ,释放细胞壁的前体及相关酶物质 ,
从而使花粉管得以伸长[ 14 , 15] 。本文中微丝荧光标记
和超微结构分析结果充分说明 ,经过 LATB 处理后
花粉管的微丝骨架和分泌系统均遭到破坏 。在被子
植物中 ,与细胞能量代谢有关的细胞器-线粒体 ,它
由花粉管的细胞器区进入顶端是生长异常的一个典
型特征[ 16] 。同样在本文的实验中也观察到类似现
象 ,即经过 LATB处理的花粉管内 ,顶端的透明区消
失 ,分泌囊泡数量急剧下降或无分泌囊泡 ,花粉管顶
端区域被一些空泡 、线粒体 、脂粒以及各种各样的囊
泡所占据 。更值得注意的是 ,当 LATB 处理后的青
花粉管内 ,与分泌特别相关的细胞器 —高尔基体
出现了异常 ,如高尔基体片层断裂成泡状结构以至
解体 ,最终导致高尔基体周围分泌囊泡数量的减少。
由于高尔基体分泌囊泡朝向细胞壁的运输是控制花
粉管生长速度的决定因素之一[ 17] ,因此抑制剂处理
后分泌系统发生了紊乱 ,从而不可逆地抑制了花粉
管的伸长 。
致谢:感谢中国科学院植物研究所发育中心胡玉熹
研究员对本论文提出的宝贵意见 。
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　　＊　Corresponding author
Observation of ultrastructure and actin filaments of pollen
tube in Picea wilsonii after Latrunculin B treatment
TIAN Cui-ting1, 2 ,ZHENG Mao-zhong2 ,LUO Mao-chun2 , 3 ,LIN Jin-xing2 ,L Hong-fei1 , 2＊
(1.College of Life Science , Zhejiang Normal University , Jinhua Zhejiang 321004 , China;
2.Institute of Botany , Chinese Academy of Sciences , Beijing 100093 , China;
3.Department of Biology , College of Longyan , Fujian Longyan 364000 , China)
Abstract:The effects of latrunculin B (LATB) on actin filaments and ultrastructure of Picea wilsonii pollen tube were investigated using
fluorescent labeling and transmission electron microscope(TEM)observation.It was shown that LATB inhibited pollen germination and tube
growth in a dose-dependent manner;fluorescent labeling revealed that a dense array of fine filaments , and a few thick bundles of filaments
extended along the length of the control pollen tube beyond the collar into the apex.In the presence of LATB , the organization of filaments was
obviously disturbed , resulting in a meshwork of short actin filaments.TEM observation showed that LATB induced sharp decline in the number
of secretory vesicles and the increase in the number of vacuoles.In addition , the Golgi apparatus and mitochondria membranes disintegrated ,
indicating that the secretory system was interfered.In all , these results demonstrated that LATB , an inhibitor of actin polymerization , affected
P.wilsonii pollen germination and tube growth through actin organization and ultrastructure , implying that actin played an important role in
P.wilsonii pollen germination , organization and maintenance of polarized growth of pollen tube.
Keywords:Picea wilsonii;pollen;pollen tube;actin;ultrastructure;actin inhibitor
151第 2 期 田翠婷等:Latrunculin B处理后青 花粉管微丝骨架和细胞超微结构的观察