全 文 ：从甜叶菊叶片中分离纯化抗氧化内生真菌
王玉兵，郝再彬* ，李海云，陈志良 (桂林理工大学化学与生物工程学院，广西桂林 541004)
摘要 ［目的］从甜叶菊叶片中分离纯化抗氧化内生真菌。［方法］以甜叶菊叶片为材料，从中分离纯化出内生真菌，对它们进行了液体
培养，检测其发酵上清液的总抗氧化性能、清除 DPPH自由基和抑制化学发光的能力。［结果］共分离获得 42株内生真菌，编号为 F01-
F42。总抗氧化最强的为 F41;清除 DPPH能力最强的为 F37;综合比较总抗氧化性能和清除 DPPH能力，F02、F07、F20、F25、F37、F41 6株
较突出。利用流动注射化学发光法对这 6株发酵液进行检测，化学发光抑制率均大于 70%，验证了它们的抗氧化性能较突出;对这 6株
进行了初步形态鉴定，它们的菌落颜色为白色或淡黄色，F02菌丝有隔膜，其他没有。［结论］筛选出高抗氧化活性的真菌，为将来的抗
氧化研究奠定了基础。
关键词 甜叶菊;内生真菌;分离纯化;抗氧化
中图分类号 Q93 －33 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2012)03 －01272 －03
Separation and Purification of Antioxidant Endophytic Fungi from the Stevia Leaves
WANG Yu-bing et al (Guilin university of technology，Guilin，Guangxi 541004)
Abstract ［Objective］The aim was to separate and purify antioxidant endophytic fungi from Stevia leaves．［Method］Stevia leaves were used
as materials for endophytic fungi screening and purification． Then，liquid culture was conducted to test fermented supernatant abilities of antioxi-
dant，DPPH free radical clearing and chemiluminescence inhibition．［Result］Forty two endophytic fungi were separated from F01 to F42． F41
was proved to be the strongest in antioxidant aspect;F37 was the strongest in DPPH clearing;F02，F 07，F20，F25，F37，and F416 stood out in
a comprehensive comparison of the above aspects． Flow injection chemiluminescenct method was used to test the above six fermentation liquors，
and the results showed that antioxidant abilities of the six were quite strong for all of chemiluminescence rates were over 70% ． Through prelimi-
nary morphological identification，bacterial colony was found white or yellowy and only F02 was of dissepiment．［Conclusion］Fungi with high-
antioxidation activities were separated，which paved the way for future research．
Key word Stievia rebaudiana;Endophytic fungi;Separation and purification;Antioxidant
基金项目 国家自然科学基金(31060193) ;桂林理工大学科研启动费。
作者简介 王玉兵(1985 － ) ，男，山东德州人，硕士研究生，研究方向:
微生物活性物质，E-mail:e_wyb@ 126． com。* 通讯作者，教
授，博士，博士生导师，从事植物活性物质开发与利用，E-
mail:haozaibin2010@ 126． com。
收稿日期 2011-09-28
植物内生真菌(plant endophytic fungi)是指在植物的某
段生活史中出现的对其不造成明显伤害的真菌，它存在于植
物的根、茎、叶等器官内部［1 －2］，与植物体能够长期共存［3］。
人们对内生真菌研究已有 100多年的历史，其研究范围非常
广泛，从多年生木本植物到一年生草本植物都有研究。首次
分离的内生真菌是 vogl 在 1898 年从黑麦草(Lolium temulen-
tum L．)种子内分离出的［4］。
甜叶菊(Stievia rebaudiana)是一种多年生菊科草本植
物，叶片中含有一类四环二萜类衍生物的糖苷，在叶片中含
量约为 10%［5 －6］。甜叶菊糖苷具有抗氧化特性，叶片中的糖
苷为微生物的生长提供了一个极端生长的环境条件。因此，
笔者试图筛选出高抗氧化活性的真菌，为将来的抗氧化研究
奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 植物材料。选取广西桂林理工大学校区内种植多年
且生长良好的甜叶菊叶片。
1． 1． 2 主要试剂。硫酸庆大霉素(广西梧州制药股份有限
公司) ;硫酸钠(广东汕头市西陇化工厂) ;DPPH(1，1-二苯基
苦基苯肼，C18H12N5O6，Fluka公司 )。所用试剂均为分析纯，
水为去离子水。
1． 1． 3 仪器设备。Sigma 2-16p型高速离心机(德国 Sigma) ;
LRH-150-Z振荡培养箱(广东省医疗器械厂) ;LRH-250-Ⅱ微
电脑控制生化培养箱(广东省医疗器械厂) ;YXQ． SG41． 280
型手提式压力蒸汽灭菌器(上海华线医用核子仪器有限公
司) ;YSQ-LS-30SII型立式压力蒸汽灭菌器(上海华医用核子
仪器有限公司) ;SW-CJ-IF 型超净工作台(苏净集团安泰公
司) ;Carry50型紫外可见分光光度计(美国 VARIAN) ;Nikon
E200型光学显微镜及数码显微镜系统(北京福凯仪器有限
公司) ;KQ-500 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限
公司)。
1． 2 内生真菌的分离和纯化
1． 2． 1 培养基。真菌的分离、纯化、保藏、发酵培养采用
PDA(马铃薯、葡萄糖、琼脂)固体培养基，分离真菌时加 30
万 U/L的庆大霉素，培养基倒入直径 9 cm培养皿内;发酵培
养采用 PD(马铃薯、葡萄糖)液体培养基。培养基均灭菌后
备用。
1． 2． 2 真菌的分离。
(1)采集叶片:取无病虫害的叶片，先用自来水将所采集
的叶表面冲洗干净，冲洗约 20 min。
(2)表面消毒:0． 1%升汞漂洗(10 ～ 30 s)→无菌水冲洗
3次→75%酒精漂洗(30 ～60 s)→无菌水冲洗数 3次。
(3)接种:在无菌条件下将叶切成 0． 2 cm × 0． 2 cm小
片。取 15 ～20个小片放在研钵中，加入少量石英砂和 1 ml
无菌水研磨 1 ～2 min，用移液枪吸取 100 μl研磨液均匀涂布
在 PDA 培养基中。对照为吸取最后漂洗叶片的无菌水
100 μl，3次重复。将培养皿置于(28 ± 1)℃温箱培养 3 ～
7 d，每天观察培养基上真菌的生长［7 －9］。
责任编辑 朱琼琼 责任校对 卢瑶安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2012，40(3):1272 － 1274，1354
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2012.03.153
1． 2． 3 真菌的纯化。观察是否有菌丝长出，及时将长出的
菌丝转接至新的 PDA培养基上，根据菌落形态、颜色以及长
出时间，分别挑取培养基上菌落边缘的菌丝转接于新的 PDA
培养基，继续进行分离纯化培养。培养数日后，观察菌落的
形态及其菌落边缘的整齐情况，并做相应记录［10］。
1． 2． 4 真菌的形态观察。采用载玻片培养的方法和菌落形
态学观察的方法，依据真菌鉴定手册［11］和 Illustratedgenera of
imperfect fungi［12］进行菌种的鉴定。菌落形态学观察:用接种
针挑取菌丝点接到 PDA培养基中心，在(28 ± 1)℃的条件下
培养 3 ～7 d，观察菌落的形状、颜色及菌丝的分布等特征;载
玻片培养方法:挑去菌丝接种到含培养基的载玻片上，盖上
盖玻片;添加 20%的甘油 500 μl 到滤纸上保湿，在(28 ±
1)℃的条件下培养 5 ～15 d。在光学显微镜下观察菌丝的生
长状况，记录菌丝的分支、有无隔膜、孢子等情况。
1． 3 真菌的液体发酵与抗氧化检测
1． 3． 1 菌种的发酵。将分离出来的菌株接种于 PDA平面培
养基上活化，(28 ±1)℃培养 3 ～7 d，在菌落边缘用直径为 6
mm的打孔器打饼 5块，将菌饼接种于 50 ml液体 PD培养液
的锥形瓶(100 ml)中，在(28 ± 1)℃、170 r /min摇床上震荡
培养 7 d。发酵结束后，用 3层纱布过滤制备发酵液，作为待
测试液样品。
1． 3． 2 样品总抗氧化性能(TAC)测定。按文献方法并略作
修改［13］。取 6支 25 ml具塞带刻度试管，分别加入 1． 0 ml浓
度为 0． 05、0． 10、0． 15、0． 20、0． 25、0． 30 mg /ml 的抗坏血酸溶
液，然后依次加入 3． 0 mol /L H2SO4 溶液 1 ml、0． 14 mol /L
Na3PO4 溶液 1． 0 ml 和 0． 02 mol /L (NH4)6Mo7O24 溶液
1． 0 ml，用蒸馏水定容至 5 ml，摇匀，加塞后于 95 ℃水浴中加
热 90 min，取出流水冷却。以不加抗坏血酸的溶液为空白，
在 695 nm波长处测定吸光度，绘制抗坏血酸总抗氧化能力
标准曲线。分别取 1． 00 ml 不同菌株的样品按上述方法测
定，在标准曲线上查得发酵液相当于抗坏血酸的量(mg)。
1． 3． 3 样品的 DPPH自由基清除能力测定。取样品 0． 1 ml，
加入 1 ×10 －4 mol /L的 DPPH溶液 3． 9 ml(乙醇为溶剂)。从
加入 DPPH 溶液开始计时，室温下避光放置 90 min 后，
517 nm波长处测定吸光度，记为 B。另取 0． 1 ml乙醇代替样
品同上操作，吸光度记为 A。按下式计算清除率［14］:
清除率(%)= A － BA ×100%
1． 3． 4 流动注射化学发光法测定样品的抗氧化性。利用
IFFM － E型化学发光分析仪以 5 × 10 －4 ml /L Ce 和 1 × 10 －2
ml /L Na2SO3 为体系，主副泵的转速都为 45 r /min，温度保持
在 35 ℃。原始液体培养基的光强记作空白 I0，测得样品光
强为 I，以光强差△I = I0 － I来表示样品对发光体系的抑制作
用，抑制率［15］表示抗氧化活性强弱:
抑制率(%)=
I0 － I
I0
× 100%
1． 3． 5 样品还原糖含量的测定。取 7支 25 ml刻度的试管，
精确加入质量浓度为 1mg /ml的葡糖糖标准溶液和 DNS。将
各管摇匀，在沸水浴中加热 5 min，取出后立即放入盛有冷水
的烧杯中冷却至室温，定容到 25 ml 刻度处，摇匀后在 540
nm处测定吸光度［16］。取样品 0． 1 ml 按照上述方法测定还
原糖吸光度值，在标准曲线查出还原糖含量。
2 结果与分析
2． 1 内生真菌的分离及初步鉴定 试验共分离获得 42 株
内生真菌，编号为 F01 ～ F42;对照培养基上未长出任何真菌
菌落，证明组织表面消毒彻底，分离到的均为内生真菌。在
加入和未加入抗生素的对照中发现，未加入抗生素的平板培
养基中细菌及放线菌生长抑制了部分内生真菌，使真菌的菌
落较少;加入抗生素的培养基中真菌形成的菌落较多，但生
长速度较未加入抗生素的慢。
2． 2 抗氧化性能结果
2． 2． 1 总抗氧化能力(TAC)的测定。绘制出抗坏血酸总抗
氧化性标准曲线，方程为 A = 25． 337X + 0． 043 4，R2 =
0． 994 1。由图 1可知，42 株真菌中总抗氧化性能比较强的
前 10位中最强和最弱的分别是 F41 和 F38 号菌，它们的含
量分别相当于含抗坏血酸 86和 11 μg /ml，之间相差 8倍。
图 1 总抗氧化比较明显的前 10株真菌
2． 2． 2 清除 DPPH自由基能力的测定。由图 2 可知，42 株
中清除 DPPH能力最强的前 10株真菌中有 3 株清除率高达
80%以上，分别为 F20、F25和 F37;最弱的 F06和 F38，清除率
仅为 8%。最强和最弱的之间相差 10倍。
图 2 清除 DPPH能力较明显的前 10株真菌
2． 2． 3 总抗氧化和清除 DPPH自由基。综合分析上述总抗
氧化能力和清除 DPPH能力，再次优选出 6 株，分别为 F02、
F07、F20、F25、F37和 F41(表 1)。
2． 2． 4 流动注射化学发光法测定 6 株真菌发酵液的抗氧化
性。依据总抗氧化性能和清除 DPPH 的能力筛选出的 6 株
真菌，进一步用化学发光体系的发光程度来表征发酵液的抗
372140 卷 3 期 王玉兵等 从甜叶菊叶片中分离纯化抗氧化内生真菌
氧化性能。从图 3 可以看出化学发光体系的抑制率均在
70%以上，说明这 6株真菌发酵液均很好地抑制了化学发光
表 1 总抗氧化能力和清除 DPPH比较突出的前 6株真菌
编号 总抗氧化能力 TAC∥μg /ml 清除 DPPH能力∥%
F02 60 66． 89
F07 70 68． 07
F20 52 80． 12
F25 66 80． 49
F37 61 82． 04
F41 86 75． 28
图 3 流动注射化学发光测定抗氧化性
体系发光，其中 F20 和 F37 的抑制率高达 79%和 82%;而
F41的抑制率最小为 71%。
2． 2． 5 发酵液还原糖糖含量的测定。试验得到葡萄糖标准
曲线 y =1． 056 2x －0． 151，R2 = 0． 998 3。对这 6 株真菌进行
发酵 7 d 后测定其发酵液中还原糖的含量，F02、F07、F20、
F25、F37和 F41 分别为 37． 7、45． 2、35． 1、31． 0、2． 9 和 2． 7
μg /ml，由此可知，这 6 株菌株发酵液中几乎不含有还原性
糖，在配制培养基中加入的还原性糖被内生真菌消耗殆尽。
2． 2． 6 6株内生真菌的形态描述。以上 6 株的菌落及菌丝
形态如下如图 4和表 2所示。
3 结论
该试验选取甜叶菊叶片，采用贴片培养和研磨液培养的
方式，分离纯化得到 42株内生真菌，并对它们进行了总抗氧
化性能和清除 DPPH能力检测，结果表明，总抗氧化最强的
为 F41;清除 DPPH能力最强的为 F37;综合比较总抗氧化性
能和清除 DPPH 能力，F02、F07、F20、F25、F37、F41 6 株较突
出。利用流动注射化学发光法对这 6株发酵液进行检测，化
学发光抑制率均大于 70%，验证了它们的抗氧化性能较突
出;对这 6株进行了初步形态鉴定，它们的菌落颜色为白色
或淡黄色，F02菌丝有隔膜，而其他则没有。
注:左图为 6株真菌在 PDA培养基上培养 5 d后的形态，其中 A为第 1天，B为第 5 天;右图为 6 株在载玻片培养基上培养 8 d后观察的菌丝
形态。
图 4 6株真菌的菌落及菌丝形态(10 ×10)
表 2 6株真菌菌落及菌丝形态描述
编号 菌落正面形态 菌落背面形态 菌丝形态
F02 白色、平面扩散、絮状、圆形 淡黄色、外圈偏白色透明 二叉分枝，菌丝宽 3 ～7 μm，有隔膜
F07 白色、菌丝比较卷曲、同心圆圈，内圈菌丝比较密集，
外圈稀疏
白色、颜色均匀 树枝状分枝，菌丝宽 3 ～7 μm，无隔膜
F20 淡黄色、边缘平整，菌落有同心圈、放射状、中心突出。淡黄色、中间黄色较深、菌落边缘白色 二叉分枝，密集菌丝宽 3 ～5 μm，无隔膜
F25 黄色，菌丝淡黄色 淡黄色、中心颜色较深 树枝状分枝，有根主菌丝，菌丝宽 5 ～ 15
μm
F37 白色、菌丝白色、短绒状、卷曲、稀疏 白色、颜色均匀 树枝状分枝，菌丝宽 3 ～7 μm，无隔膜
F41 白色、边缘平整，菌丝白色、絮状、稀疏 中心淡黄色、周围白色，边缘平整 密集网状，菌丝宽 5 ～10 μm，无隔膜
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(下转第 1354页)
4721 安徽农业科学 2012年
个，单铃重 5． 32 g。新陆早 44号产量达到 5 338． 23 kg /hm2，
显著高于对照的5 090． 69 kg /hm2。分析产量构成，新陆早44
号较高的田间收获株数和单铃重显著高于对照，是导致产量
较高的原因。
表 2 新陆早 44号净光合生产率的动态变化 g /(m2·d)
棉花品种
苗期 －蕾期
SS － BS
蕾期 －盛蕾期
BS － BPS
盛蕾 －初花期
BPS － EFS
初花期 －铃期
EFS － BOS
盛铃期
BFS
盛铃 －吐絮期
BFS － BBOS
新陆早 44号 19． 12 15． 72 20． 49 11． 55 15． 12 5． 95
对照 16． 98 12． 75 17． 78 8． 14 13． 54 7． 38
图 3 新陆早 44号生物产量的积累动态
表 3 新陆早 44号的产量及产量构成
品种
籽棉产量
kg /hm2
收获株数
万株 /hm2
单株结
铃数∥个
单铃重
g
新陆早 44号 5 338． 23 a 20． 52 a 4． 89 a 5． 32 a
对照 5 090． 69 b 20． 35 a 4． 91 a 5． 09 b
注:数据后同列不同小写字母表示在 0． 05水平上有差异(P ＜0． 05)。
3 结论与讨论
3． 1 讨论 王克如等研究提出，新疆棉花实现皮棉产量
3 000 kg /hm2 的栽培生理指标是:总生物产量积累 19 480
kg /hm2，积累速率最大值出现在盛铃初期，为 315 kg /(hm2·d)，
LAI在盛铃期最大，为 4． 28;总光合势为 3． 65 ×106 m2·d［6］。在
该试验中，新陆早 44号产量为 5 338． 23 kg /hm2，总生物产量
积累 14 370 kg /hm2，最大生物量日积累速率为 276
kg /(hm2·d)。LAI在盛铃期达到最大为 4． 36，总光合势为
2 ． 87 × 106 m2·d。新陆早44号号需加强栽培管理措施，进
一步提高产量。
与对照品种新陆早 33 号相比，新陆早 44 号 LAI最大值
4. 36，小于新陆早33号的4． 72，但新陆早44号 LAI高于4． 00
的持续天数为 42 d，新陆早33号为28 d;新陆早44号光合生
产率的最大值为 20． 49 g /(m2·d) ，高于新陆早 33 号的
17. 78 g /(m2·d)。此外，新陆早 44 号的总光合势和总生物
产量积累量都略高于新陆早 33 号，这些都可能是新陆早 44
号高产的原因。
3． 2 结论 与对照品种新陆早 33 号相比，LAImax持续时间
长、全生育期的总光合势高和最大生物量积累出现早，这些
可能是杂交棉新品种新陆早 44号高产的原因。
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