全 文 ：收稿日期:2011-01-11　　　修回日期:2011-02-22
作者简介:韩晓丽(1983-),女(汉),山西霍州人 ,助教 ,硕士 ,主要从事真菌及代谢产物方面的研究。
基金项目:财政部产业技术成果转化项目(05071)
J.SHANXI AGRIC.UNIV.(Natura l S cience Ed i tion)
学报(自然科学版)2011 , 31(2) 002757
一株银杏内生裂褶菌的鉴定
及其产黄酮的初步研究
韩晓丽1 ,康冀川2 ,段宝玲1 ,冯强1
(1.山西农业大学 林学院 ,山西太谷 030801;2.贵州省生化工程中心 ,贵州 贵阳 550025)
摘　要:为了解银杏内生真菌产黄酮情况 ,对从贵州大学校园银杏树叶中分离到的一株内生真菌 GZUY201 进行鉴定
及产黄酮的研究。菌株鉴定利用形态学和分子生物学相结合的方法 , 并通过 HPLC 法测定其产黄酮的含量。 鉴定菌
株 GZUY201 为裂褶菌(Schizophy llum commune F r.),菌株发酵液和菌丝体产黄酮苷元槲皮素量可达 40.8 mg· L-1
和 101.7 mg · g-1 。银杏内生裂褶菌可产黄酮苷元槲皮素 ,可作为生产银杏黄酮的候选菌株。
关键词:银杏;内生真菌;裂褶菌;黄酮;槲皮素
中图分类号:S432.4+4　　文献标识码:A　　文章编号:1671-8151(2011)02-0113-04
Preliminary Study on Identification of and Flavonoid Production from an Endophytic Fugus from Gink-
go bi loba L.
HAN Xiao-li1 , KANG Ji-chuan2 ,DUANBao-ling1 , FENGQiang1
(1.College of Forestry , S hanx i Ag ricultural University , Tai gu S hanx i 030801 , China;2.Guiz hou B iochemical En-
gineering Center , Guiyang Guizhou 550025 , China)
Abstract:In o rder to under stand Ginkgo biloba endophy tic fungi in brass , the research aimed to study on the identifica-
tion o f an endophy tic fungus strain GZUY201 , w hich was isolated from the leaves o f Ginkgo biloba L., and the produc-
tivity o f flavono ids from the fungus.The identification based on mo rpholo gical and molecular methods , the flavoniods
content w ere detected by means o f HPLC.The endophy tic fungus GZUY201 w as identified a s Schiz ophy llum commune
F r. and it can produce quercetin which is a kind o f flav onoid g ly co side up to 40.8 mg· L-1 and 101.7 μg· g-1 .The
endophytic fungus can produce que rcetin and can be used as an alternative strain fo r flav onoids production.
Key words:Ginkgo biloba;Endophy tic fungus;Schizophy llum commune;F lavoniods;Que rcetin
　　植物内生真菌是指与植物长期共生 ,且不引起
植物明显病害症状的真菌[ 1] 。基于内生真菌能产
生与其宿主植物相同或相似的生理活性物质[ 2 , 3] ,
学者们对药用植物内生真菌的研究十分活跃 ,如红
豆杉 、长春花等珍贵植物中均分离出能够产活性成
分的内生真菌[ 4 , 5] 。银杏为我国特有多年生药用
落叶乔木 ,同时也是濒危珍稀植物 。现有研究表
明 ,银杏叶提取物(Exact of Ginkgo biloba , EGB)
中的银杏黄酮 ,对治疗心脑血管疾病如冠心病 、心
绞痛 、脑动脉硬化 、老年性痴呆 、高血压等方面具有
显著效果 ,此外 ,还具有抗氧化 、抗衰老的药用价
值[ 6] 。目前 ,银杏黄酮类化合物制品主要通过银杏
叶提取 ,生产成本高 ,且不利于银杏资源的保护 。
因此从银杏中分离产黄酮内生真菌具有重要的意
义。目前对银杏内生真菌产黄酮的研究已陆续有
报道 ,且多为有丝分裂产孢真菌[ 7 ～ 13] 。本文报道
了一株银杏内生产黄酮的担子菌———裂褶菌
(S chizophy llum commune Fr.)。
1　材料和方法
1.1　菌种
将采集于一株贵州大学校园银杏树的新鲜叶
片中分离到一株内生真菌 ,编号为 GZUY201 ,经
纯化培养的菌株转接到 PDA 斜面培养基上 , 27 ℃
DOI :10.13842/j.cnki.issn1671-8151.2011.02.020
培养箱培养 5 ～ 7 d ,然后放入 4 ℃冰箱保存。
1.2　培养基
1.2.1　基础培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato Dex trose
Agar ,PDA)。
1.2.2　子实体培养基
树皮培养基:老松树皮20 g ,葡萄糖 20 g ,蛋白
胨 15 g ,置于约 200 mL 罐头瓶中 ,以适量蒸馏水
浸没 ,加入 5 g 琼脂粉 ,10 h后用塑料膜封口(使营
养成分充分浸入树皮),灭菌条件:121 ℃,30 min。
1.2.3　发酵培养基
马铃薯葡萄糖液体(PD)培养基。
1.3　方法
1.3.1　培养方法
①将菌株接种于PDA培养基上 ,于27 ℃培养
7 ～ 10 d ,观察记录菌落特征 。将菌株接种于树皮
培养基上 ,置于 27 ℃恒温培养箱中黑暗培养 3 d
后 , 4 ℃见光 10 h 与 27 ℃黑暗培养 14 h交叉培养
15 d ,再放入 27 ℃恒温光照培养箱 ,培养 15 d ,可
见子实体长出 。再接着于 27 ℃恒温光照培养箱培
养 15 d ,子实体长大 ,可见一长出菌褶的子实体 。
记录菌落特征 ,进行形态学鉴定[ 14 , 15] 。
②在三角瓶中装入 PD 培养基 80 mL , 待
PDA 培养基上长满菌丝后 ,用直径约为 8 mm 的
打孔器打孔 ,每瓶接入 3 枚菌丝块 ,于振荡器上
28 ℃、120 r · min-1培养 7 d 后 , 经 4 000 r ·
min
-1离心 30 min ,然后将菌丝体与发酵液分别处
理后进行检测。
1.3.2　I TS序列分析
基因组 DNA 的提取:采用改良 CTAB 法提
取[ 16] 。PCR扩增:采用 50 μL 反应体系 。扩增菌
株的 rDNA ITS 序列 , 特异性引物为 I TS5 和
ITS4 , 序列:ITS5 GGAAGTAAAAG TCG TAA-
CAAGG/ ITS4 TCCTCCGCTTA TTGA TATGC 。
所测序的菌的 rDNA ITS 序列在 GenBank核酸序
列数据库中进行 Blastn 比对 ,下载相关序列后 ,利
用C lustalX与软件将序列匹配排列 ,用 mega 软件
进行 1000次 bootstrap统计学检验 ,构建系统树。
1.3.3　HPLC 待测样品的制备
①菌丝体处理方法:将菌丝体用蒸馏水清洗 2
次后放入 40 ℃烘箱烘干并研磨 ,称取 2 g ,加入 10
mL[ V(4 mo l·L-1甲醇)∶V(36%HCl)=7∶3]
浸提液后超声波破碎 30 min ,4 000 r ·min-1离心
30 min后取上清液 , 78 ℃避光水浴 4 h 后 4 000
r ·min-1离心 ,取上清液进行检测 。
②发酵液处理方法:将发酵液经 4 000 r ·
min-1离心 30 min后取上清液 50 mL ,经旋转蒸发
仪 50 ℃蒸发浓缩至干后 ,加入 5 mL 浸提液[ V(4
mo l·L-1甲醇)∶V(36%HCl)=7∶3] ,78 ℃避
光水浴 4 h后 4000 r ·min-1离心 ,取上清液进行
检测 。
1.3.4　HPLC分析
高效液相色谱仪(Aglient 1100 series);色谱
柱:C18(15 cm×4 mm);流速:0.8 mL·min-1 ;检
测器:紫外检测器;波长:360 nm;柱温:50 ℃;进样
体积:10 μL ;流动相:V(甲醇)∶V(H2O)∶V(磷
酸)=45∶55∶0.1;以 20 mg ·L -1槲皮素甲醇溶
液为标准品对照液 。采用外标法 ,以槲皮素为标样
计算样品中槲皮素苷元的含量[ 6] 。其中 C 代表样
品的浓度 ,V样 为供试液体积 ,G 为样品质量 , V总
为样品溶液总体积 ,A 代表峰面积 , 2.51为槲皮素
转化为槲皮素苷元的系数。菌丝槲皮素苷元含量
=C标×A样 ×V样×100×2.51/(A标 ×G×1000);
发酵液槲皮素苷元含量=C标 ×A样×V样 ×100×
2.51/(A标 ×V总)。
2　结果与分析
2.1　GZUY201形态学描述
菌株菌丝体在 PDA 平板上 ,于 27 ℃培养 7 ～
10 d ,直径菌落为 50 ～ 60 mm 。白色长绒毛状 ,气
生菌丝旺盛边缘整齐 ,背面呈微黄色 ,菌丝有间隔
有分枝。树皮培养基菌落菌肉白色 ,子实体菌盖宽
0.6 ～ 2.2 cm ,质韧 ,白色 ,被有绒毛 ,扇形或肾形 ,
边缘内卷 ,多数呈掌状开裂 ,具多裂瓣 ,菌柄长 1.0
～ 2.5 cm(图 1)。菌株菌丝球在 28 ℃发酵培养基
培养 7 d ,菌丝相互缠结成菌丝球 ,质地胶粘 ,直径
1.5 ～ 2.0 cm 。
2.2　GZUY201的分子鉴定
将所测得的 GZUY201 的 ITS 序列到 Gen-
Bank中用 Blast程序查询已测定同源序列 ,下载与
其相似度较高的菌株序列比对 ,使用相关生物软件
构建的分子系统树 ,从而确定各菌株的亲缘关系及
分类地位 。从 NCBI 上下载的序列有:FJ478109 、
AB428350 、AY57160 、FJ196608。构建的系统树如
图 2。
　　I TS 序列分析结果证明菌株 GZUY201 属于
裂褶菌 属 (Schizophy l lum), 并 且 聚在 菌 株
Schizophy l lum communeFJ478109和 AB428350
114 山 西 农 业 大 学 学 报(自然科学版) 2011
图 1　GZUY201 形态学特征
Fig.1　Colony and encarpium of GZUY201
注:1 、2 GZUY201在 PDA 平板上菌落正、背面;3 、4 GZ UY201在树皮培养基上长出子实体;5 GZUY201在深层培养中形
成菌丝球
Note:1 、2 Th e fo rw ard and the back Colony of GZUY201 on PDA;3 、4 Encapium of GZUY201 on Pine bark cul tu re;5 My-
celial bead of GZUY201 f rom submerged cluture
图 2　基于产黄酮菌株 GZUY201 及其参考菌株的 rDNA ITS 序列的系统树
Fig.2　The tree wa s generated based on the rDNA ITS sequences of the flavoniods-producing endophytic fun-
gal isolate GZUY201 and its Gen Bank allies
的分枝上 。以形态学特征为基础结合菌株 rDNA
ITS 序列分析 , 确定菌株 GZUY201 为裂褶菌
(Schizophy l lum commune Fr.)。
2.3　GZUY201产黄酮苷元检测结果
通过 HPLC 检测 ,菌株 GZUY201 发酵液和
菌丝体的样品在设定条件下与标准品的保留时间
Rt值相同 ,均为 5.61 min(图 3)。
结果表明 ,GZUY201 的发酵液和菌丝体中均
含有黄酮苷元槲皮素 ,根据公式计算槲皮素含量分
别为 40.8 mg ·L -1和 101.7 μg · g-1 。
3　讨论
目前对银杏内生真菌菌种及类群的研究报道
中 ,裂褶菌鲜见报道[ 7 ～ 13] 。银杏内生裂褶菌的发
现结果表明 ,外生于植物上的某些担子菌 ,很可能
其生活史中会有某一段时间生活于植物组织内。
图 3　供试样品的 H PLC 图谱
Fig.3　The HPLC chromatog r am o f the endophy tic
funga l iso lates samples
1.槲皮素标准品的 HPLC 检测图谱;2.GZUY201发酵液
HPLC图谱;3.GZU Y201菌丝体 HP LC图谱
1.The HPLC chromatog ram of quercetin S tandard;2.T he
HPLC chromatogram of fermentat ion b roth of GZU Y201;3
The HPLC chromatogram of mycelial of GZUY201
11531(2) 韩晓丽等:一株银杏内生裂褶菌的鉴定及其产黄酮的初步研究
陆续报道的产黄酮银杏内生真菌多为有丝分裂产
孢真菌[ 7 ～ 12] ,如刺盘孢属(Colletotrichum)、镰孢属
(Fusarium)、安培菌属(Anpelomyces)、茎点霉属
(Phoma)、明孢多节孢(Nodulisporium)等属真
菌。本文所述的银杏产黄酮苷元槲皮素内生裂褶
菌属于担子菌的范畴 ,经人工培养长出了子实体 。
在对此菌做产黄酮检测之前 ,对该菌进行了 9次
PDA 平板转接培养 ,表明该菌具有一定的产黄酮
的稳定性 。菌株 GZUY201 的黄酮苷元槲皮素含
量与其他已报道产黄酮菌株相比相对较高[ 7 ～ 12] 。
因此可将该菌作为生产银杏黄酮类物质的候选菌
株 ,对银杏黄酮类药物的生产以及银杏资源的保护
都具有重要的意义 。
此外 ,现有研究还表明 ,裂褶菌的生物活性主
要表现在抗动物肿瘤等方面[ 17 ～ 20] 。这预示着此菌
还可能有其它方面的潜在应用价值 ,所以有必要对
此菌进行产多糖及抑癌方面的深入研究。
参　考　文　献
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(编辑:武英耀)
116 山 西 农 业 大 学 学 报(自然科学版) 2011