全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2011)06 － 2311 － 05
收稿日期:2011 － 01 － 12
基金项目:国家公益性行业(农业)科研专项“秸秆主流组分分
离与资源化高效利用”(200803033) ;专题云南特色真菌(裂褶
菌)资源的收集、评价与应用研究(200803033-A0908)
作者简介:李梦杰(1985 －) ，男，在读硕士研究生，主要从事环
境生物修复研究，E-mail:lmj851111@ 163． com，* 为通讯作者，
E-mail:rongchunli@ 126． com。
裂褶菌液体和固体培养产漆酶的比较研究
李梦杰，王翠玲，张玉金，陈世通，李荣春*
(云南农业大学食用菌研究所，云南 昆明 650201)
摘 要:裂褶菌 GGHN08-104 是产漆酶能力强，且产酶速度快的菌株。对其在液体培养基、固体培养基中产生漆酶的能力和规律
进行了研究。结果表明，该菌株在 C /N比为 70 /1，初始 pH值为 5，Cu2 +离子浓度为 21mg /L的液体培养基中酶活最高，达 477． 94
U /mL(12 d)。固体培养时以配方①(棉籽壳 31． 14 %、木屑 66． 86 %、蔗糖 1 %、石膏 1 %)产酶活性和效率最高，分别为 2449． 02
U /g和 272． 11 U /g·d －1，固体发酵产酶效率是液体发酵的 6． 83 倍，因此固体培养更适宜该菌株产漆酶。
关键词:裂褶菌;液体培养;固体培养;产酶效率;漆酶
中图分类号:S794． 9 文献标识码:A
Comparative Studies on Laccase Production in Liquid and
Solid Cultures of Schizophyllum commune
LI Meng-jie，WANG Cui-ling，ZHANG Yu-jin，CHEN Shi-tong，LI Rong-chun*
(Institute of Edible Fungi，Yunnan Agricultural University，Yunnan Kunming 650201，China)
Abstract:Schizophyllum commune GGHN08-104 were high-yield strains producing Laccase and the enzyme production could peak at an early
stage of fermentation of the strains． Comparative studies on Laccase production in liquid and solid culture of the strains were conducted． The
results indicated that the enzyme activities of Laccase was the highest in GGHN08-104 growing in liquid culture that ratio of carbon to nitro-
gen was 70:1，the initial potential of hydrogen was 5 and the concentration of copper ions was 21mg / L，the activity of enzyme reached 477．
94 U /mL (12 d)． The optimal solid-state conditions were cotton seed hull 31． 14 %，sawdust 66． 86 %，sucrose1 %，gypsum1 % ． Under
these conditions，the laccase activity was 2449． 02 U /g，efficiency was 272． 11U /g·d －1 ． Solid-state incubation efficiency was 6． 83 times
the liquid incubation． Therefore，the solid-state incubation was more suitable for the strains producing Laccase．
Key words:Schizophyllum commune;Liquid incubation;Solid incubation;Enzyme production efficiency;Laccase
漆酶(Laccase，Lac)是一种含铜的多酚氧化酶，
它在制浆漂白［1］、食品工业以及土壤生物修复等领
域一直都是十分活跃的热点［2 ～ 4］。漆酶最初发现于
紫胶漆树(Rhus verniciflua)漆液中。拟南芥、水稻、
棉花、松树、黄杨和欧亚槭树等也可产生漆酶［5］。
随后发现某些高等真菌也能分泌该酶，目前 Traetes
versicolor 、Coriolus versicolor、Pleurotus ostreatus、Pyc-
noporus cinnabarinus、Lentinus edoders 等白腐真菌都
有报道产 Lac［6］，而关于用裂褶菌(Schizophyllum
commune)产 Lac 报道很少，Muhammad Asgher 等利
用裂褶菌对纺织品染料进行脱色过程中发现裂褶菌
IBL-06 菌株产 Lac(179 U /mL)［7］，国内目前还没有
裂褶菌菌株产 Lac 的系统报道，而且许多菌株研究
表明不产 Lac［8 ～ 9］。本试验菌株 GGHN08-104 是在
云南不同宿主、生境的裂褶菌野生菌株驯化中得到
的。
液体发酵培养是目前国内外关于产生 Lac 研究
最常用的方式，因为液体培养基具有成分明确、分布
均匀等优点，在试验过程中可以准确定位产酶的最
佳条件以及迅速检测酶液的理化性质。与液体培养
相比，固体培养则是一个在没有或几乎没有自由流
动水的状态下，以惰性基质或自然基质为底物的发
酵过程，它具有成本低、产物浓度高、能耗少等特
点［10］，但是由于固体培养底物成分复杂，所以很难
1132
2011 年 24 卷 6 期
Vol. 24 No. 6
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
DOI:10.16213/j.cnki.scjas.2011.06.008
确定具体什么成分引起 Lac的高效发生。
本研究通过对液体产酶培养基优化以及固体产
酶配方的筛选，比较 GGHN08-104 在液体培养基和
固体培养基中产漆酶的能力和规律。
1 材料与方法
1． 1 菌株和培养基
裂褶菌(Schizophyllum commune)菌株 GGHN08-
104 采自云南西南地区，24°53574 N，99°59928
E，海拔 1401 m，宿主植物为大戟科(Euphorbiaceae)
的麻疯树(Jatropha curcas L．)。
1． 2 培养基
PDA固体加富培养基:马铃薯 200 g /L 煮沸过
滤，琼脂 15 g，葡萄糖 20 g，蛋白胨 3 g /L，磷酸二氢
钾 3 g，硫酸镁 1． 5 g，维生素 B1 100 mg，pH自然。
液体培养基:C 源为葡萄糖，N 源为蛋白胨，根
据不同的 C /N比称取不同的量，磷酸二氢钾 3 g，硫
酸镁 1． 5 g。微量元素:CaCl2 100 mg /L，FeSO4·
7H2O 100 mg /L，MnSO4·7H2O 5 mg /L，ZnSO4·
7H2O 10 mg /L，CuSO4 20 mg /L，维生素 B1 100 mg /
L。
1． 3 液体培养及条件优化
将裂褶菌菌株 GGHN08-104 接种于 PDA 固体
加富培养基上，25 ℃培养 7 d，用无菌去离子水洗入
三角瓶中，匀浆器打碎，用移液器吸取 1 mL 菌种加
入到装有 30 mL 液体培养基的三角瓶中，在 25 ℃、
130 r /min摇床振荡培养。
1． 3． 1 C /N比对产 Lac的影响 设置 C /N比为 2 /
1，5 /1，10 /1，20 /1，30 /1，40 /1，50 /1，60 /1，70 /1，80 /
1，90 /1，100 /1 不同梯度，每个 C /N 比设 3 次重复，
从第 4 天开始测量酶活，连续培养 13 d后过滤在 60
℃下烘干，称菌丝体干重。
1． 3． 2 初始 pH 值对产 Lac 的影响 在最佳 C /N
比的条件下，设置初始 pH 值为 4，4． 5，5． 0，5． 5，6．
0，7． 0 的液体发酵培养基，通过单因素试验测量不
同 pH值对液体培养产 Lac的影响。
1． 3． 3 Cu2 +对产 Lac的影响 在最佳 C /N 比和最
佳 pH 值条件下，将液体培养基中 CuSO4 去除，设
Cu2 +浓度为 0、5、10、15、20、21、22 mg /L，比较不同
梯度 Cu2 +对产 Lac的影响。
1． 4 液体培养酶液制备
从液体培养的第 4 天开始，每天定时取样测酶
活，每次用移液器取样 150 μl，在 12 000 r /min 下离
心 5 min，上清液即为粗酶液。
1． 5 不同配方固体培养产 Lac及条件优化
裂褶菌属中高温型真菌，菌丝生长最适温度为
22 ～ 25 ℃，培养基最适含水量为 60 % ～75 %，菌丝
生长最适 pH 为 5 ～ 6［11］，配方①棉籽壳 31． 14 %、
木屑 66． 86 %、蔗糖 1 %、石膏 1 %;配方②木屑
74． 86 %、麦麸 23． 14 %、蔗糖 1 %、石膏 1 %;配方
③玉米芯 90． 4 %、麦麸 7． 6 %、蔗糖 1 %、石膏 1
%;配方④棉子壳 80 %、麸皮 10 %、豆秸 8 %，蔗糖
1 %、石膏 1． 00 %［12］。各配方均在含水量为 65
%，温度为 25 ℃条件下培养，每个配方设 3 次重复，
菌袋 12 cm ×22 cm，用 8 mm孔径的打孔器在长满
菌丝的 PDA 固体加富培养基上打孔，每袋接 3 菌
块。
1． 6 固体培养粗酶液制备
固态培养 4 d后，每袋每天取出 1 g培养物分装
于 150 mL 三角瓶中，加入 20 mL 乙酸钠缓冲溶液
(0． 01 mol /L，pH = 4． 5) ，130 r /min 下振荡浸提 30
min，过滤去除残渣后滤液经 12000 r /min 离心 5
min，上清液即为粗酶液。
1． 7 酶活测定
Lac酶活测定参照 Niku-paavola(1988)以 2，2-
连氮-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6-磺酸) (ABTS)为底
物［13］，定义每分钟氧化 1 μmol ABTS 为一个酶活单
位(U)。
锰过氧化物酶(MnP)、不依赖锰的过氧化物酶
(MiP)参照 Vyas(1994)［14］，木质素过氧化物酶
(LiP)参照 Niku-Paavola(1990)［15］进行。
2 结果与分析
2． 1 C /N比对裂褶菌产 Lac和生物量的影响
在温度为 25 ℃，摇速为 120 r /min 的条件下，
Lac酶活表现出与 C /N较大的相关关系，当 C /N 为
2 /1 时，没有检测到 Lac 酶活;随着 C /N 的增加，酶
活上升，当 C /N达到 70 /1 时，酶活达到最高 383． 34
U /mL(见图 1)。因此，选择 70 /1 为裂褶菌产 Lac
的最佳 C /N比。这与产 Lac 模式属(栓菌属)菌株
有很大区别，如苏东海等人利用 TP21产 Lac研究表
图 1 不同 C/N比对裂褶菌产 Lac的影响
Fig． 1 Effect of different C /N ratio on Lac production of Schizophyl-
lum commune
2132 西 南 农 业 学 报 23 卷
明，只有当 C /N ＜ 1． 5 时菌株才有较高酶活，而 C /N
＞ 1． 5 时，酶活较低［16］。
连续振荡培养 13 d后的菌丝干重表明，裂褶菌
生物量与 C /N比呈反比关系，菌丝生物量随着裂褶
菌 C /N的增大而减少(图 2)。
由此可见，不同 C /N比对裂褶菌产 Lac 影响很
大，裂褶菌 GGHN08-104 适宜在高 C 低 N 的条件下
产酶。菌丝体生物量在 C /N 比为 70 /1 之前，生物
量越大，菌株产 Lac 却越低(图 1、图 2) ，C /N 比为
70 /1 之后，菌株产 Lac 也随着生物量的降低而降
低。
2． 2 初始 pH值对液体培养产酶的影响
在最佳 C /N 比培养基中，当 pH 值为 5 时，第
12 天有最大酶活 408． 46 U /mL;随着 pH 值的增大
酶活降低，当 pH值为7时，第1 2天酶活下降为
214． 9 U /mL。说明 GGHN08-104 菌株适宜在弱酸
性的条件下产酶，与大多数真菌漆酶最适反应 pH
值一致［17 ～ 18］。
2． 3 Cu2 +对液体培养产 Lac的影响
该菌株液体发酵产 Lac 对 Cu2 +浓度有很大依赖
性，在最佳 C/N比和最佳初始 pH值情况下，Cu2 +浓度
为21 mg /L，有最大酶活为477． 94 U/mL(12 d);而在没
有 Cu2 +情况下，最大酶活仅为 41． 8 U/mL(图 4)。
2． 4 产 Lac固体培养最适配方的筛选
从图 5 可见，配方①的酶活峰值为 2449． 02 U /
g(9 d) ;配方②的酶活峰值为 2418． 78 U /g(12 d) ;
配方③的酶活峰值为 2438． 53 U /g(10 d) ;配方④
的酶活峰值为 1638． 16 U /g(8 d)。
经 ANOVA分析显示，配方①、②、③之间最大
酶活差异不显著，但都与配方④有极显著差异，说明
配方①、②、③更有利于该菌株产 Lac(表 1)。
表 1 不同固体培养配方的酶活峰值
Table 1 Enzyme activity peak value of different solid incubation formulas
配方 Formula
酶活峰值 Enzyme activity peak value(U /g)
1 2 3 均值 Average value
① 2440． 53 2458． 09 2448． 44 2449． 02 ± 8． 78aA
② 2419． 80 2410． 68 2425． 86 2418． 78 ± 5． 00aA
③ 2409． 53 2457． 18 2448． 88 2438． 53 ± 24． 01aA
④ 1688． 49 1606． 46 1619． 50 1638． 15 ± 41． 37bB
注:小写字母表示 P = 0． 05 水平下不同处理平均数间的显著性差异;大写字母表示 P = 0． 01 水平下不同处理平均数间的极显著性差异;有
相同字母的处理平均数间差异不显著。
Note:Lowercase letters P = 0． 05 level between different processing averages of significant differences，capital letters P = 0． 01 level between different
processing average significantly difference，with the same letter with no significant difference between the average．
31326 期 李梦杰等:裂褶菌液体和固体培养产漆酶的比较研究
表 2 裂褶菌固体培养不同生育期的酶活
Table 2 Enzyme activity of different periods of Schizophyllum commune in solid state incubation
配方
Formula
不同生育期酶活 Enzyme activity of different periods(U /g)
8d 9d 10d 11d 12d 13d 14d
① 1767． 43 2449． 02(菌丝满袋) 2399． 52
1296． 68
(原基形成)
869． 37 838． 5 814． 62
② 869． 63 1078． 83 1659． 57 2382． 61 2418． 78(菌丝满袋) 2368． 28
1096． 26
(原基形成)
③ 1269． 33 1775． 74 2438． 53(菌丝满袋) 2400． 78
1390． 6
(原基形成)
977． 04 950． 02
④ 1638． 15(菌丝满袋) 1490． 57
810． 4
(原基形成)
481． 3 466． 27 460． 38 422
2． 5 固体培养不同生育期产 Lac分析
从表 2 可看出，配方 1 在第 9 天菌丝长满菌袋
并达到最大酶活，然而在第 11 天裂褶菌原基形成时
酶活却急剧下降，下降 47． 05 %。配方 2 在第 12 天
菌丝长满菌袋时达到最大酶活，第 14 天原基形成时
酶活却下降了 54． 68 %。配方 3 在第 10 天菌丝长
满袋时达最大酶活，第 12 天原基形成时酶活却下降
了 42． 97 %。配方 4 在第 8 天菌丝长满袋时达最大
酶活，第 10 天原基形成时酶活下降 50． 53 %。由此
可知，裂褶菌 GGHN08-104 菌株产 Lac 过程主要是
在菌丝营养生长阶段，上述 4 个配方都有在菌丝长
满袋时达最大酶活，原基形成即生殖生长开始时酶
活急剧下降的现象。
2． 6 液体培养和固体培养产酶能力和效率分析
从图 4、图 5 可知，菌株 GGHN08-104 在最佳液
体培养条件下 Lac 峰值为 477． 94 U /mL，时间为 12
d，产酶效率为 39． 83 U /mL·d －1。最佳固体培养基
为配方①，Lac峰值为 2449． 02 U /g，时间为 9 d，产
酶效率为 272． 11 U /g·d －1，产酶效率是液体培养
的 6． 38 倍(按 1 mL =1 g计) ，并且 Lac峰值提前了
3 d。配方②Lac 峰值虽为 2418． 78 U /g，但酶活峰
值时间为 12 d，所以导致产酶效率为 201． 57 U /g·
d －1，为固体培养配方中最低。配方③Lac 峰值为
2438． 53 U /g，时间为 10 d，比液体培养提前了 2 d，
产酶效率为 243． 85 U /g·d －1。配方④Lac 峰值为
1638． 15 U /g，时间为 8 d，产酶效率为 204． 77 U /g·
d －1，比液体培养提前了 4 d，是最早达到酶活峰值的
配方。
上述结果表明，菌株 GGHN08-104 固体培养产
酶能力远远高于液体培养，而且产酶速度除配方②
与液体培养一致外，其它都快于液体培养，因此该菌
株更适宜用固体培养来产 Lac。
此外，该菌株在液体培养和固体培养过程中都
没有检测到 LiP、MnP、MiP的活性。
3 讨 论
液体培养基 C /N优化试验表明，菌株 GGHN08-
104 适宜在较高的 C /N 下产酶，主要原因可能是由
于 C /N 小于 70 /1 时，氮源充足，菌体生长过于旺
盛，造成对碳源消耗过快，不利于漆酶的积累;而当
C /N大于 70 /1 时，因氮源不足而导致菌体生长缓
慢，也不利于漆酶的合成。
在固体发酵过程中发现，该菌株产酶在菌丝长
满菌袋时达到最大值，然而在原基形成时酶活却急
剧下降，这可能是该菌株在营养生长期间需要不断
分泌 Lac来分解底物，从而获得自身扩繁的养料;而
当菌株转入生殖生长时，菌丝之间相互扭结，从而抑
制了菌株胞外产酶。此外，固体发酵配方④在第 8
天最先达到酶活峰值，其次是配方①在第 9 天达到
峰值，最迟达到峰值的为配方②，原因可能是棉籽
壳、玉米芯与杂木屑相比具有较好的团粒结构，适合
菌株生长。
造成菌株 GGHN08-104 液体培养产酶效率远低
于固体培养产酶效率的原因，笔者认为主要是以下
2 个方面:①裂褶菌属于好氧性真菌，液体培养通过
摇床转动供氧，不但不能满足菌体和产酶需求，而且
由于转动引起的剪切力让部分漆酶失活。②棉籽
壳、木屑、玉米芯、麸皮等底物的化学组成、矿质元
素、颗粒大小、多孔性等特性有利于该菌株在固体培
养时 Lac的产生。
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(责任编辑 王家银)
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