全 文 ：第 45 卷 第 2 期 河 南 农 业 大 学 学 报 Vol． 45 No． 2
2011 年 4 月 Journal of Henan Agricultural University Apr． 2011
收稿日期:2010 － 12 － 28
基金项目:国家科技支撑计划项目 (2006BAD01A18)
作者简介:桑叶子，1986 年生，女，河南南阳人，硕士研究生，主要从事园林植物栽培繁殖、育种等方面研究．
通讯作者:张启翔，1956 年生，男，湖北黄冈人，教授，博士生导师．
文章编号:1000 － 2340(2011)02 － 0177 － 06
太行菊细胞悬浮培养体系的建立
桑叶子1，孙 明1，2，张启翔1，2
(1．北京林业大学园林学院，北京 100083;2．国家花卉工程技术研究中心，北京 100083)
摘要:以太行菊(Opisthopappus taihangensis)作为试材，进行了细胞悬浮培养的初步探讨．结果表明，试管苗茎段
诱导愈伤组织最适培养基配方为MS + 6-BA 2． 0 mg·L －1 + NAA 0. 5 mg·L －1 + 2，4-D 1． 0 mg·L －1，诱导出的愈
伤组织生长迅速，且排列紧密质地松软适合进行细胞悬浮培养．将获得的愈伤组织在液体培养基 MS + 6-BA 2. 0
mg·L －1 + 2，4-D 0． 5 mg·L －1中震荡培养，建立细胞悬浮体系．悬浮细胞的生长曲线呈抛物线型，初期增长缓
慢，4 ～ 6 d进入对数增长期，6 d以后由于培养基中营养物质的消耗和 pH值的下降，细胞生长迅速下降．
关键词:太行菊;细胞;悬浮培养;愈伤组织;液体培养基
中图分类号:S682． 1 文献标志码:A
Study on cell suspension culture of Opisthopappus taihangensis
SANG Ye-zi1，SUN Ming1，2，ZHANG Qi-xiang1，2
(1． College of Landscape Architecture，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China;
2． National Floriculture Engineering Research Center，Beijing 100083，China)
Abstract:This paper has done the preliminary research on cell suspension culture of Opisthopappus
taihangensis． The results show that the most suitable medium for callus induction using stem as its ex-
plant is MS + 6-BA 2． 0 mg·L －1 + NAA 0． 5 mg·L －1 + 2，4-D 1． 0 mg·L －1 ． The callus grows fast
and unconsolidated which is appropriate for cell suspension culture． To establish cell suspension cul-
ture，put the callus in liquid medium MS +6-BA 2． 0 mg·L －1 + 2，4-D 0． 5 mg·L －1 and shake． The
growth curve of suspension cells is of a parabola type． At the beginning of the culture，cells increased
slowly，and during 4 to 6 days，they reached logarithmic growth． 6 days later，as a result of the large
consumption of nutrients in medium and the pH value fallen off ，the trend of increasing went down．
Key words:Opisthopappus taihangensis;cell;suspension culture;callus;liquid medium
植物细胞悬浮培养体系的建立是分离次生代
谢产物、进行原生质体融合与遗传转化的重要基础
工作，同时亦可用于植物抗性生理的研究及各种生
理生化指标的测定，还可作为诱变的对象，减少嵌
合体的产生［1，2］． 迄今，木本植物香花槐［3］、毛泡
桐［4］，药用植物红景天［5］及一些观赏植物高羊茅、
石竹、一品红、薰衣草［6 ～ 9］等都已成功建立细胞悬
浮培养体系，该体系在荔枝和龙眼［10］上实现了作
为转基因受体的功能．但菊科植物只有栽培品种小
菊建立了细胞悬浮培养体系［11］，但野生种鲜有报
道．太行菊(Opisthopappus taihangensis)是菊科菊蒿
亚族太行菊属多年生宿根草本植物，是中国的特有
种，分布在山西(陵川、晋城)、河南(济源)．太行菊
生于海拔 300 m以上的石壁或裸露的石砾坡地上．
其植株低矮，耐干旱、瘠薄，抗逆性很强，并且植株具
有一种独特的香气，作为地被植物在园林中推广应
用具有可观的前景．太行菊属与菊科其他属的二倍
体野生种杂交亲和性较好，这使得通过体细胞融合
DOI:10.16445/j.cnki.1000-2340.2011.02.023
178 河 南 农 业 大 学 学 报 第 45 卷
获得属间杂种的可能性大大提高．因此在遗传育种
和园林应用上太行菊都具有很高的研究价值［12，13］．
本研究以太行菊作为试材，探索建立细胞悬浮培养
体系的方法，以期为遗传转化、诱变育种奠定基础．
1 材料与方法
1． 1 材料
太行菊采自河北太行山区，在北京林大林业科
技股份有限公司 PC 板双坡面连栋加温温室培养
保存．
1． 2 方法
1． 2． 1 无菌苗的获得 采健康无病虫害、生长势
健壮的植株，修剪成带 1 ～ 2 个腋芽的茎段．流水冲
洗 30 min 后在体积分数为 70%乙醇中浸泡 30 s，
冲洗干净再加入吐温的 0． 1% 氯化汞处理 3. 5
min，最后用无菌水冲洗 4 遍． 接种到 1 /2 MS 培养
基上，诱导腋芽萌发．每 3 周继代 1 次．培养条件为
25 ℃，16 h /8 h光周期．
1． 2． 2 愈伤组织诱导培养基的筛选 将无菌苗的
叶片剪去，茎段剪成约 3 ～ 5 mm(不带腋芽)的小
段，横放在培养基上．根据预试验的结果，采用 3 因
素 3 水平的正交设计培养基，配方如表 1 所示．
表 1 愈伤组织诱导培养基正交试验设计
Table 1 Orthogonal design of callus induction
试验序号
Test No．
6-BA /
(mg·L －1)
NAA /
(mg·L －1)
2，4-D /
(mg·L －1)
a 1． 0 0 0
b 1． 0 0． 5 0． 5
c 1． 0 1． 0 1． 0
d 1． 5 0 0． 5
e 1． 5 0． 5 1． 0
f 1． 5 1． 0 0
g 2． 0 0 1． 0
h 2． 0 0． 5 0
i 2． 0 1． 0 0． 5
每瓶培养基中放入 10 根茎段，每个处理重复
3 次．每 10 d观察 1 次，4 d 后统计愈伤诱导率、死
亡率和愈伤组织生长状态． 普通拍照采用 CANON
IXUS50 拍摄，显微观察及照相采用 LEICA S8AP0
体视显微镜和 ZEISS Primo Star显微镜．
愈伤诱导率 =(诱导愈伤的外植体数 /接种外
植体数)× 100%
根据预试验的结果，将不同外观的愈伤组织同
解剖结构联系起来，最终将愈伤组织根据软硬程度
分为 5 级［11］，做为评价愈伤组织生长状态的指标．
1 级:疏松呈水渍状膨大，黄色愈伤组织，用解剖针
挑破会有汁液渗出;2 级:疏松表面有颗粒感，黄绿
色愈伤组织，用镊子可以轻易从表面剥离成若干小
球状颗粒;3 级:软，绿色愈伤组织表面有颗粒感，
用镊子解剖针挑开内部无褐化;4 级:硬，绿色愈伤
组织表面紧实，用手术刀切开，接近培养基部分褐
化泛黄;5 级:坚硬，绿色愈伤组织表面干硬泛白，
用手术刀切开，且内部发黑．
1． 2． 3 细胞悬浮培养基的筛选 将在 1． 2． 2 中筛
选的培养基上诱导的愈伤组织放入液体培养基进
行悬浮培养．悬浮培养基根据预实验的结果，采用 3
因素 3水平的正交设计培养基，配方如表 2所示．
表 2 液体培养基正交试验设计
Table 2 Orthogonal design of liquid medium
试验序号
Test No．
激素质量浓度 /(mg·L －1)
Hormone concentration
2，4-D 6-BA
接种量 /(g·L －1)
Inoculum weight
A 0． 5 0． 5 10
B 0． 5 1． 0 20
C 0． 5 2． 0 40
D 1． 0 0． 5 20
E 1． 0 1． 0 40
F 1． 0 2． 0 10
G 2． 0 0． 5 40
H 2． 0 1． 0 10
I 2． 0 2． 0 20
将愈伤组织切碎后称重，放入 100 mL 三角瓶
中，每瓶加入 50 mL液体培养基．培养条件为:摇床
转速 100 r·min －1，(25 ± 1)℃，弱光．每 2 d 对悬
浮细胞进行观察计数，悬浮液用 60 目分样筛(孔
径为 250 μm)尼龙网过滤，取混匀的细胞悬浮液 1
mL，在其中抽取 40 μL 进行显微计数，平行测定 3
次，连续观察 10 d．
细胞悬浮液浓度 =(40 μL悬浮细胞液中细胞
个数 /40)× 1000
测量指标:细胞悬浮液浓度．以每毫升悬浮细
胞液中单细胞和小细胞团的密度作为衡量悬浮细
胞生长速率的指标．
2 结果与分析
2． 1 愈伤组织诱导培养基的筛选
太行菊试管苗比地被菊等其他品种的菊花生
长势较弱茎秆纤细，且容易莲座化，这个问题普遍
存在，通过改良培养基配方也很难解决． 因此诱导
愈伤的过程中一部分会自然枯黄、褐化，但是存活
的外植体愈伤诱导率很高，添加不同的激素对愈伤
组织的生长状态有较大影响．
第 2 期 桑叶子等:太行菊细胞悬浮培养体系的建立 179
表 3 不同培养对愈伤组织诱导的影响
Table 3 The effect of different medium to the induction of callus
试验序号
Test No．
诱导率 /%
Induction ratio
愈伤组织生长状况
Status of callus
愈伤组织软硬程度分级
Hardness standard of callus
a 0 褐化死亡 —
b 43． 33 少量黄色疏松愈伤组织 1
c 50． 00 少量黄色疏松愈伤组织 1
d 46． 67 大量黄绿色疏松愈伤组织 2
e 46． 67 少量但淡黄色疏松愈伤组织 1
f 33． 33 大量绿色紧密愈伤组织 4
g 50． 00 少量黄色疏松愈伤组织 3
h 46． 67 大量绿色紧密愈伤组织 4
i 50． 00 大量黄绿色疏松愈伤组织 3
由表 3 得知，a 培养基单纯添加细胞分裂素，
导致外植体较快的褐化死亡;而 b，e培养基细胞分
裂素与生长素添加质量浓度的比值相当，此时愈伤
组织多质地疏松偏黄，部分呈水渍状;而 d，h 培养
基中细胞分裂素比重大于生长素 2 ～ 3 倍，愈伤组
织偏绿色质地硬实不宜分散． g，i 培养基中细胞分
裂素比重大于生长素 1 倍左右时，愈伤组织生长状
况比较适中，排列紧密质地松软．
表 4 愈伤组织诱导正交试验的极差分析
Table 4 Variance analysis of callus induction orthogonal design
试验序号
Test No．
激素质量浓度 /(mg·L －1)
Hormone concentration
6-BA NAA 2，4-D
诱导率 /%
Induction ratio
a 1． 0 0 0 0
b 1． 0 0． 5 0． 5 43． 33
c 1． 0 1． 0 1． 0 50． 00
d 1． 5 0 0． 5 46． 67
e 1． 5 0． 5 1． 0 46． 67
f 1． 5 1． 0 0 33． 33
g 2． 0 0 1． 0 50． 00
h 2． 0 0． 5 0 46． 67
i 2． 0 1． 0 0． 5 50． 00
K1 /% 93． 00 96． 70 80． 00
K2 /% 126． 70 136． 70 140． 00
K3 /% 147． 00 133． 33 146． 67
珋x1 0． 31 cB 0． 32 bB 0． 27 bB
珋x2 0． 42 bA 0． 46 aA 0． 47 aA
珋x3 0． 49 aA 0． 44 aA 0． 49 aA
R 0． 18 0． 14 0． 22
注:大写字母表示在 0． 01 水平上差异显著，小写字母表示在 0． 05 水平上差异显著．下同．
Note:Capital letter shows the significance difference on 0． 01 level，and lower-case letter shows the significance difference on 0． 05 level． The same as
below．
从表 4 可以看出，3 个因素处理间差异均显
著．第 3 因素 2，4-D 质量浓度的极差最大，其次是
第 1 因素 6-BA质量浓度，说明太行菊以茎段为外
植体的愈伤组织诱导受到生长素 2，4-D 质量浓度
的影响最大，其次是细胞分裂素 6-BA 的质量浓
度．从平均值看，第 1 因素的第 3 水平最好，第 2 因
素的第 2 水平最好，第 3 因素的第 3 水平最好．所
以各因素最好的搭配是 MS +6-BA 2. 0 mg·L －1 +
NAA 0. 5 mg·L －1 + 2，4-D 1. 0 mg·L －1 ．
通过对愈伤组织生长状态的连续观察发现，由
茎段诱导太行菊愈伤组织，接种 4 d 后可见两端切
口处增大，10 d以后茎段两端开始膨大，产生黄色
的愈伤组织，20 d 后外植体表面全部覆盖愈伤组
织，40 d 后产生大量愈伤组织外植体呈球状体如
图 1 所示．体视显微镜下解剖发现(图 2) ，球状体
表面覆盖着一层绿色的愈伤组织，并有少量分化的
芽点，内部成黄绿色的愈伤组织排列紧密，但质地
松软，表面细胞呈球形，类似胚性愈伤组织．
180 河 南 农 业 大 学 学 报 第 45 卷
2． 2 细胞悬浮培养基筛选
2． 2． 1 正交试验的极差分析 从表 5 可以看出，
第 3 因素接种量的极差最大，其次是第 1 因素 2，4-
D的质量浓度，说明细胞悬浮培养初期细胞团的个
数受到接种量的影响最大，其次是生长素的质量浓
度．从平均值看，第 1 因素的第 1 水平最好，第 2 因
素的第 3 水平最好，第 3 因素的第 3 水平最好．所
以各因素最好的搭配组合是 MS + 2，4-D 0. 5 mg·
L －1 + 6-BA 2. 0 mg·L －1 + 接种量 40 g·L －1 ． 在
0. 05 水平上，第 1 因素和第 3 因素处理间差异显
著，其余均不显著，而在 0. 01 水平上，各个因素的
处理间差异不显著．
表 5 细胞悬浮培养正交试验极差分析
Table 5 Variance analysis of cell suspension culture orthogonal design
试验序号
Test No．
2，4-D /(mg·L －1) 6-BA /(mg·L －1) 接种量 /(g·L －1)
Inoculum weight
悬浮细胞液浓度 /(个·mL －1)
Density cell suspension
A 0． 5 0． 5 10 866． 67
B 0． 5 1． 0 20 4 700． 00
C 0． 5 2． 0 40 7 566． 67
D 1． 0 0． 5 20 1 433． 33
E 1． 0 1． 0 40 2 000． 00
F 1． 0 2． 0 10 766． 67
G 2． 0 0． 5 40 3 925． 00
H 2． 0 1． 0 10 600． 00
I 2． 0 2． 0 20 1 341． 67
K1 12 475． 00 5 566． 67 1 575． 00
K2 4 200． 00 7 300． 00 7 475． 00
K3 5 866． 67 9 675． 00 13 491． 67
珋x1 4 158． 33 aA 1 855． 56 aA 525． 00 bA
珋x2 1 400． 00 bA 2 433． 33 aA 2 491． 67 bA
珋x3 1 955． 56 bA 3 225． 00 aA 4 497． 22 aA
R 2 758． 33 1 369． 44 3 972． 22
通过对细胞悬浮液中细胞(图 3)的观察发现，
初代培养的细胞悬浮液中包括小细胞团、球形细胞
和长型细胞．一些细胞团是在细胞脱离愈伤组织团
块的基础上自身分裂产生的(图 4) ，细胞团中的细
胞处于有丝分裂的不同时期．一般这类的细胞团细
胞个数较少，在 10 个左右或 10 个以下． 初代培养
球形单细胞(图 5)的个数较少，通常是以 2 ～ 3 个
细胞组成细胞团的形式出现． 初代培养中，长型细
胞以及部分的畸形细胞产生率较高．
1．长型细胞;2．球形细胞;3．细胞团．
1． Long cell;2． Spherical cell;3． Cell cluster．
图 3 细胞悬浮液(×100)
Fig． 3 Cell suspension liquid (×100)
第 2 期 桑叶子等:太行菊细胞悬浮培养体系的建立 181
图 4 旺盛分裂的细胞团(×200)
Fig． 4 Fast division cell cluster(×200)
图 5 球型单细胞(×400)
Fig． 5 Spherical cell(×400)
2． 2． 2 正交设计培养基中细胞生长曲线 由图 6
可以看出，悬浮培养细胞生长曲线呈现抛物线型，
2 ～ 4 d生长缓慢，4 ～ 6 d进入对数生长期，6 d以后
呈现极速下降的趋势．原因主要是由于后期培养基
中养分的消耗和 pH 值的变化使得悬浮细胞的生
长环境急剧恶化，导致其分裂速度大幅下降，细胞
死亡． 因此，太行菊细胞悬浮培养的继代周期
为6 ～ 7 d．
图 6 不同培养基上太行菊悬浮细胞生长曲线
Fig． 6 The growth curve of Opisthopappus taihangensis
suspension cells in different mediums
3 讨论
细胞悬浮培养体系的建立多来源于胚性愈伤
组织，但是胚性愈伤组织的界定没有一个统一的标
准，不同种植物的胚性愈伤组织也存在一定的差
异．通常对于进行细胞悬浮培养所采用的愈伤组织
不同研究者都有自己的划分方式，红景天［5］、草地
早熟禾［17］、薰衣草［9］等几种植物材料的细胞悬浮
培养体系建立，对于不同种类的愈伤组织有自己的
划分．也有研究者笼统地将其描述为生长旺盛、疏
松易于分散的愈伤组织，益母草［14］、桑树［15］、杜
仲［16］等植物的细胞悬浮培养体系建立中是采取这
种描述的．而对于太行菊，根据经验，结合了上述 2
种方式，从外观以及解剖触感等方面以软硬程度为
划分标准，人为将其划分为 5 个梯度，以 2 和 3 为
较适合进行悬浮培养的愈伤组织［11］．
太行菊的细胞悬浮培养体系初代培养中细胞
的几种形态，与报道的其他种类植物相似［17］，有细
胞团、球形细胞及长形细胞． 而悬浮细胞的生长曲
线与报道的小菊悬浮细胞半抛物线生长曲线有所
不同［18］，而与红景天［5］、丰花月季［19］的类似，悬浮
细胞的生长曲线有明显的峰值，经过对数生长期后
较明显的下降，这样的结果可能是由于培养体系较
小，培养液的缓冲能力差，造成培养液环境过酸不
适合细胞的生长，也有可能是太行菊悬浮细胞对于
酸性的环境耐受度较差造成的．
综上所述，以太行菊为试验材料初步建立了细
胞悬浮培养体系:以试管苗茎段为外植体，在 MS +
6-BA 2. 0 mg·L －1 + NAA 0. 5 mg·L －1 + 2，4-D
1. 0 mg·L －1培养基上诱导出的愈伤组织生长迅
速，且排列紧密质地松软适合进行细胞悬浮培养．
将获得的愈伤组织在液体培养基 MS + 6-BA 2. 0
mg·L －1 +2，4-D 0. 5 mg·L －1中震荡培养，建立细
胞悬浮培养体系．
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(责任编辑:曾玲玲)
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(责任编辑:曾玲玲)