全 文 ：供试品溶液 ,按上述色谱条件分别测定 ,结果见表
1。
3 讨论
3.1 冬凌草甲素提取溶剂的选择中 ,采用甲醇和
醋酸乙酯两种溶剂分别超声处理 40min测定含量 ,
结果甲醇和醋酸乙酯为溶剂含量分别为 8.487 mg/
g、0.578 mg/g。迷迭香酸提取溶剂的选择中 ,采用
甲醇和丙酮两种溶剂分别超声处理 40 min测定含
量 ,结果甲醇和丙酮为溶剂含量分别为 0.0744 mg/
g、0.0189 mg/g。以甲醇为溶剂冬凌草甲素 、迷迭香
酸的含量最高 ,故样品处理的提取溶剂定为甲醇。
又以甲醇为溶剂 ,采用索氏提取和超声提取进
行了考察 ,结果见表 2。
表 2 不同提取方法冬凌草甲素含量的比较
提取方法 索氏4h 索氏6h 索氏8h 超声20min 超声40min 超声60min
冬凌草甲素含量(mg/g) 7.507 7.308 4.966 8.061 8.487 7.557
通过对不同的提取溶剂 、提取方法 、提取时间的
考察 ,提取时间越长 ,受热过程越多 ,冬凌草甲素的
含量随之降低越多 ,可见冬凌草甲素不稳定 ,故应注
意提取的时间 、温度。确定供试品溶液的制备方法
为:甲醇超声处理 40min。
迷迭香酸的样品处理 ,经高效液相色谱图分析 ,
以甲醇为溶剂并溶解的样品 ,无论超声处理 ,还是索
氏提取 ,迷迭香酸均产生前延峰 ,若改为甲醇为溶
剂 ,流动相溶解 ,迷迭香酸的色谱峰形对称 ,理论塔
板数高。故迷迭香酸的样品处理采用甲醇超声处
理 ,流动相溶解 。
3.2 实验结果可见不同产地或商品地的冬凌草中
冬凌草甲素 、迷迭香酸的含量差别显著 ,全草中冬凌
草甲素的含量 ,山西太原地区最低为 0.900 mg/g,
湖北武汉地区最高为 6.236 mg/g,两者相差 7倍。
叶中冬凌草甲素的含量 , 北京地区最低为 2.787
mg/g,河北安国地区最高为 7.340 mg/g,两者相差
2.6倍。全草中迷迭香酸的含量 ,山西太原地区最
低为 0.0186 mg/g,河北石家庄地区最高为 0.2055
mg/g,两者相差 11倍。叶中迷迭香酸的含量 ,河北
安国地区最低为 0.0385 mg/g,浙江温州地区最高
为 0.2459mg/g,两者相差 6倍 。
不同部位的冬凌草中冬凌草甲素的含量也有一
定的差别 ,河北安国地区的冬凌草叶中冬凌草甲素
的含量为 7.34mg/g,茎中含量仅为 0.475 mg/g,叶
中含量约为茎中含量的 15倍 。
参 考 文 献
[ 1] 刘晨江 , 赵志鸿 .冬凌草的研究进展 .中国药学杂志 ,
1998, 33(10):577-581.
[ 2] 李伟光 , 梁敬钰 .迷迭香酸的研究进展 .海峡药学 ,
2004, 16(1):1-3.
[ 3] 郑晓珂 , 董三丽 ,冯卫生 .冬凌草的质量控制研究 .中
国实验方剂学杂志 , 2005, 11(2):10-12.
[ 4] 陈随清 ,董诚明 , 郑晓珂 ,等 .冬凌草不同采收期迷迭香
酸的含量变化 .河南中医学院学报 , 2003, 18(6):29-
30.
(2007-06-05收稿)
基金项目:陕西省自然科学基金(批准号:2004C229)作者简介:郭增军 ,在职博士 ,副教授。科研方向为天然药物资源的开发利用 、化学成分和有效成分研究。电话:(029)82655133, E-mail:guozj@mail.xjtu.edu.cn。
九牛造中总鞣质提取方法和没食子酸含量测定研究
郭增军 1, 2 ,孙启时 2 ,龙丽辉 1, 3 ,卜筱茜 1
(1.西安交通大学医学院药学系 ,陕西西安 710061;2.沈阳药科大学中药学院 ,辽宁沈阳 110016;3.宝鸡
高等职业技术学院 ,陕西宝鸡 721008)
摘要 目的:测定九牛造根中总鞣质和没食子酸含量。方法:以没食子酸为对照品 ,分别用紫外分光光度法及
高效液相色谱法测定九牛造根中总鞣质和没食子酸含量。结果:九牛造根不同提取方法所得样品中总鞣质含量分
别是水超声提取为 4.375%;70%乙醇超声提取为 7.24%;丙酮超声提取为 3.958%;水回流提取为 3.773%;70%
乙醇回流提取为 2.503%;丙酮回流提取为 1.59%。九牛造根中没食子酸含量为 0.047%。结论:采用 70%乙醇超
声提取所得样品中总鞣质含量最高 ,该方法可用于九牛造根中总鞣质的提取方法。
关键词 九牛造;鞣质;没食子酸;含量测定
中图分类号:R284.1/R284.2 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2007)11-1398-04
1398 中 药 材 JournalofChineseMedicinalMaterials 第 30卷第 11期 2007年 11月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2007.11.023
StudiesontheMethodsofExtractandDeterminationofTotalTannins
andGalicAcidsoftheRootofEuphorbiahylonoma
GUOZeng-jun1, 2 , SUNQi-shi2 , LONGLi-hui1, 3 , BUXiao-qian1
(1.FacultyofPharmacyofSchoolofMedicine, XianJiao-tongUniversity, Xian710061, China;2.SchoolofTraditionalChineseMa-
teriaMedica, ShenyangPharmaceuticalUniversity, Shenyang110016, China; 3.BaojiSeniorVocationalTechnologyColege, Baoji
721008, China)
Abstract Objective:TodeterminetotaltanninsandgallicacidoftherootofEuphorbiahylonoma.Methods:Withthegalicacid
asreference, tanninsandgallicacidoftherootofEuphorbiahylonomaweredeterminedbyultravioletspectrophtometerandhighper-
formanceliquidchromatography, respectively.Results:ThecontentoftanninsoftherootofEuphorbiahylonomaweredeterminedby
differentextractmethods, includingextractedbywater, 70% alcohol, acetoneonsupersound, thedeterminationdatawere4.375%,
7.240%, 3.958%, respectively.Whenusedrecirculationmethodbywater, 70% alcohol, acetone, thedeterminationdatawerethe
determinationdataare3.773%, 2.503%, 1.59%, respectively.thecontentofgalicacidoftherootwas0.047%.Conclusion:Con-
tentoftotaltanninsbyalcoholsupersoundisthehighestcomparingwithotherextractmethods, thismethodcanusedinextractoftotal
TanninsoftherootofEuphorbiahylonoma.
Keywords EuphorbiahylonomaHand.-Mazz.;Thannins;Gallicacid;Assaying
九牛造原植物为大戟科(Euphorbiaceae)大戟属
(Euphorbia)植物湖北大戟 (Euphorbiahylonoma
Hand.-Mazz.),民间以根入药 ,具有通便利水 、消积
破瘀 、止痛的功效 ,用于治疗二便不通 、肝癌和肝硬
化腹水等〔1、2〕。在我国 ,主要分布于陕西 、湖南 、湖
北 、四川 、贵州等省。实验证明九牛造根具有一定的
生物致死活性 ,其氯仿提取物对 7721型肝癌细胞具
有明显的抑制作用 〔3、4〕 ,石油醚和苯萃取物对三龄
粘虫具有较高毒杀活性〔5、6〕。关于九牛造化学成分
研究已有报道〔7、8〕 ,化学成分中以鞣质类成分报道
较多 ,且多为没食子酸及鞣花酸衍生物 ,而鞣质在抑
菌 、抗氧化 、抗病毒 、及抗癌等方面均有报道 〔9、10〕。
为开发鞣质资源 ,本文分别采用不同提取方法对九
牛造药材中总鞣质进行了提取 ,用紫外分光光度法
及高效液相色谱法测定九牛造根中总鞣质和没食子
酸含量 ,同时对鞣质在根不同部位的含量分布进行
了初步的研究。
1 材料与仪器
九牛造药材采自陕西太白山 ,经西北农林科技
大学植物标本馆吴振海教授鉴定为大戟科植物湖北
大戟(EuphorbiahylonomaHand.-Mazz.)。高效液相
色谱仪 (SPECTRA SYSTEM P2000, SpectraSE-
RIESUV100,美国);紫外光栅分光光度计(上海第
三分析仪器厂);AE240S型电子分析天平(Metler-
ToledoGroup);CQ-120型超声波清洗机 (上海跃进
医用光学器械厂);没食子酸对照品(天津市大茂化
学试剂厂 , 050205);甲醇为色谱纯;其它试剂均为
分析纯 。
2 方法与结果
2.1 总鞣质含量测定 〔11 ～ 13〕
2.1.1 对照品溶液制备:精密称取没食子酸对照
品 50 mg,置 100 ml棕色量瓶中 ,加水溶解并稀释至
刻度 ,精密量取 5 ml,置 50 ml棕色量瓶中 ,用水稀
释至刻度 ,摇匀 ,作为对照品溶液 。
2.1.2 标准曲线的制备:精密量取对照品溶液
1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml,分别置 25 ml棕色量瓶
中 ,各加入磷钼钨酸试液 1.0 ml,再分别加入水 11、
10、9、8、7 ml,用 29%碳酸钠溶液的上清液稀释至刻
度 ,摇匀 。以相应的试剂为空白 ,按照分光光度法
(2005版药典一部 ,附录ⅤA), 30 min后 ,在 760 nm
处测定吸收度 ,以吸收度为纵坐标 ,浓度为横坐标
(单位为 10-2mg/ml),绘制标准曲线 ,线性方程为 Y
=0.511X+0.0571, r=0.9661。
2.1.3 重复性试验:取样品 5份 ,按 2.1.5.1的水
提样品方法制备九牛造根药材全粉末供试品的溶
液 ,进行鞣质含量测定 。结果平均含量为 4.375%,
RSD为 0.90%(n=5)。
2.1.4 回收率试验:取同一样品 5份 ,分别精密称
取 100 mg,置 250 ml棕色量瓶中 ,分别精密加入鞣
酸溶液(以没食子酸计含量 ,为 62.26%)50 ml,加
水 150ml,按供试品溶液制备方法制备 ,并按总酚和
不被吸附的多酚分别测定含量 ,计算回收率。平均
回收率为 97.0%, RSD为 1.12%(n=5)。
2.1.5 供试品溶液制备:
2.1.5.1 超声提取样品的制备:水提取样品制备:
分别取九牛造根 、根的木质部(简称木质部)和根的
皮部(简称皮部),粉碎 ,过 80目筛 ,分别精密称定
100 mg,置 250ml棕色量瓶中 ,加水 150 ml,放置过
夜 ,超声处理 10 min,放冷 ,用水稀释至刻度 ,摇匀 ,
静置(使固体物沉淀),滤过 ,弃去初滤液 ,精密量取
1399中 药 材 JournalofChineseMedicinalMaterials 第 30卷第 11期 2007年 11月
续滤液 10ml,置 50 ml棕色量瓶中 ,用水稀释至刻
度 ,摇匀 ,作为供试品溶液备用 。
乙醇 、丙酮提取样品制备:精密称取九牛造根过
80目筛的药材粉末 100 mg两份 ,分别置 250 ml量
瓶 ,加入 70%乙醇和丙酮各 150 ml, 称重 , 放置过
夜 ,超声 30 min,滤取提取液 ,减压浓缩至干 ,用水溶
解残留物并转移至 250 ml容量瓶 ,定容至刻度线 ,
滤过 ,弃去初滤液 ,取续滤液 10 ml,用水稀释至 50
ml作为供试品溶液备用 。
2.1.5.2 热回流提取样品的制备:水提取样品制
备:精密称取九牛造根过 80目筛的药材粉末 100
mg一份 ,置烧瓶中 ,加水 250 ml,称重后 ,于 50℃水
浴锅中热提取 30 min,放冷 ,用水补足减失重量 ,过
滤 ,弃去初滤液 ,取续滤液 10 ml,置 50 ml棕色量瓶
中 ,用水稀释至刻度 ,摇匀 ,作为供试品溶液备用。
醇提取 、丙酮提取样品制备:分别精密称取九牛
造根过 80目筛的药材粉末 100 mg两份 ,置烧瓶中 ,
各分别加丙酮 、70%乙醇 250 ml,称重后 ,于 50℃水
浴锅中热回流提取 30min,放冷 ,分别用各自溶剂补
足减失重量 ,滤取提取液 ,减压浓缩至干 ,用水溶解
残留物并转移至 250 ml容量瓶 ,定容至刻度线 ,滤
过 ,弃去初滤液 ,取续滤液 10 ml,用水稀释至 50 ml
作为供试品溶液备用 。
2.1.6 含量测定:总酚测定:精密量取供试品溶液
2.0ml,置 25 ml棕色量瓶中 ,照标准曲线下方法 ,自
“加入磷钼钨酸试液 1.0 ml”起 ,加水 10 ml,同法测
定吸收值 ,从标准曲线中读出供试品溶液中没食子
酸的含量(mg),再根据稀释倍数计算 ,即得 。
不被吸附的多酚测定:取供试品溶液 12.5 ml,
加入已盛有 0.3g干酪素的 50ml具塞锥形瓶中 ,密
塞 ,置 30℃水浴中保温 1 h,时时振摇 ,取出 ,放冷 ,
摇匀 ,滤过 ,弃去初滤液 ,精密量取续滤液 2.0 ml,置
25 ml棕色量瓶中 ,照标准曲线制备项下的方法 ,自
“加入磷钼钨酸试液 1.0 ml”起 ,加水 10 ml,同法测
定吸收值 ,从标准曲线中读出供试品溶液中没食子
酸的含量(mg),再根据稀释倍数计算 ,即得 。试验
结果见表 1。
鞣质含量 =总酚量 -不被吸附的多酚量
2.2 没食子酸含量测定〔14〕
2.2.1 色谱条件:KormailC18色谱柱 (4.6 mm×
200mm, 5 μm);流动相:甲醇 -0.1%磷酸水溶液(15
∶85);流速 0.8 ml/min;检测波长 273 nm;柱温:室
温 。在上述色谱条件下九牛造中没食子酸与其它干
扰成分分离良好 。柱效以没食子酸的理论塔板数计
不得低于 2000。
表 1 九牛造根及根中不同部位总鞣质
含量测定结果( x±s, n=3)
提取方法 溶剂 含量(%) RSD(%)
超声提取 水 4.375±0.1054 2.41
70%乙醇 7.240±0.1093 1.51
丙酮 3.958±0.004472 0.11
热回流提取 水 3.773±0.1571 1.61
70%乙醇 2.503±0.08310 3.32
丙酮 1.59±0.09263 0.68
根木质部 水 /超声 0.8350±0.04503 5.39
根皮部 水 /超声 3.068±0.1364 2.69
2.2.2 对照品和供试品溶液的制备:
2.2.2.1 对照品溶液的制备:精密称取 0.11 mg
没食子酸 ,用 20%甲醇溶解并定容至 25 ml的容量
瓶中 ,得 0.0044mg/ml没食子酸对照品溶液。
2.2.2.2 供试品溶液的配制:九牛造原药材中没
食子酸含量测定供试液的制备:九牛造根粉碎 ,过
80目筛 ,精密称取 0.5g于三角烧瓶中 ,精密加甲醇
100 ml,称定(准确至 0.01 g),超声处理 30 min,补
足损失的甲醇重量 ,滤过 ,精密吸取续滤液 5 ml,用
水准确稀释至 25 ml即得。
2.2.3 专属性试验:按 2.2.1项所示色谱条件 ,分
别量取对照品 、样品 、阴性样品溶液 10μl,分别注入
液相色谱仪 ,记录色谱图 ,从图可知在此色谱条件
下 ,阴性样品无干扰 ,方法专属性较好。
2.2.4 标准曲线的绘制:精密吸取没食子酸对照
品溶液(0.0044mg/ml)5、10、15、20、25μl测定色谱
峰面积 ,以进样量为横坐标 ,峰面积为纵坐标绘图 ,
得回归方程为 Y=544055X+9459.4, r=0.9963,在
0.022 ～ 0.11 μg线性关系良好。
2.2.5 重现性试验:样品溶液按色谱条件重复进
样 5次进行测定 ,外标法定量 ,测得没食子酸含量为
0.04512%, RSD=2.16%(n=5)。
2.2.6 回收率实验:取已知含量的样品液 5份 ,准
确加入一定量的标准品溶液 ,按色谱条件测定 ,并计
算回收率 ,结果平均回收率为 98.3%, RSD=1.12%
(n=5)。
2.2.7 供试品测定:分别精密量取对照品 、样品溶
液 10 μl,进样 ,记录色谱图 ,以外表法计算没食子酸
含量 ,结果见表 2。
表 2 九牛造根中没食子酸含量测定结果(n=3)
样品批号 含量(%) RSD(%) 平均含量(%)
040901 0.0463±0.01 2.16
040902 0.0440±0.04 1.05 0.0476±0.02
051001 0.0525±0.02 2.10
1400 中 药 材 JournalofChineseMedicinalMaterials 第 30卷第 11期 2007年 11月
3 讨论
3.1 九牛造根中总鞣质含量测定时 ,样品制备以
超声提取方法优于加热回流方法 ,原因可能是其所
含的鞣质在加热情况下发生水解或其它变化所致 ,
加热会损失部分鞣质。不同溶剂提取方法中以
70%乙醇超声提取较好 ,鞣质提取率高 ,其次为水和
丙酮 ,这些结果将为九牛造中鞣质的提取提供参考
依据和方法 。
3.2 对九牛造根不同部位总鞣质含量分析结果显
示 ,皮部含量明显高于木质部含量 ,提示九牛造在以
鞣质作为主要成分应用时 ,应分取皮部作为药材入
药部位更为合理 。
3.3 HPLC法测定九牛造中没食子酸含量方法重
现性好 ,样品干扰小 ,可作为九牛造药材含量测定用
方法。
参 考 文 献
[ 1] 江苏新医学院.中药大辞典.上册 .上海:上海科学技
术出版社 , 1986:41.
[ 2] 中国科学院西北植物研究所.秦岭植物志.北京:科学
出版社 , 1976:160.
[ 3] 郭增军 , 李延 ,倪磊 , 等.九牛造根抗肿瘤作用的初步实
验研究 .中草药 , 2001, 32(S0):146-147.
[ 4] 郭增军 ,吕居娴 , 李映丽 ,等 .Brineshrimp致死率生测法
筛选九牛造抗癌活性部位 .西北药学杂志 , 1996, 11
(2):70-71.
[ 5] 原春兰 , 郭进宝.九牛造杀虫活性成分研究.植物资源
与环境学报 , 2005, 14(3):59-60.
[ 6] 原春兰 , 李宗孝 .九牛造活性成分的提取分离及活性
检测 .西北农业学报 , 2005, 14(3):127-129.
[ 7] 郭增军 , 朱蓉 ,吕居娴 , 等.九牛造化学成分的研究.中
国中药杂志 , 1995, 20(12):744-745.
[ 8] 阮汉利 , 张悦 ,张勇慧 , 等.湖北大戟化学成分研究.中
国中药杂志 , 2006, 31(9):742-744.
[ 9] 徐勤 .鞣质的研究进展 .华夏医学 , 2004, 17(1):113-
115.
[ 10] 李肖玲 , 崔岚 ,祝德秋 .没食子酸生物学作用的研究进
展 .中国药师 , 2004, 7(10):767-769.
[ 11] 罗文毓.中药中鞣质含量测定方法的比较研究.药物
分析杂志 , 1990, 10(4):249-251.
[ 12] 王坤 ,鲁静 .中药材中鞣质含量测定方法的研究 .中
国药事 , 2004, 18(6):361-364.
[ 13] 国家药典委员会 .中华人民共和国药典 .一部 .北
京:化学工业出版社 , 2005:附录 XB57.
[ 14] 叶蕻芝 ,叶蕻蒨 , 林薇 ,等 .三白草没食子酸含量的测
定.福建中医学院学报 , 2004, 14(1):15-16.
(2007-04-23收稿)
藏药材石榴籽超临界 CO2萃取成分的 GC-MS分析
魏立新 ,杜玉枝
(中国科学院西北高原生物研究所藏药现代化研究中心 ,青海西宁 810008)
摘要 目的:用新方法提取藏药材石榴籽油 , 并对其进行化学成分分析 ,为石榴籽的药理研究和应用提供实验
依据。方法:采用超临界 CO2萃取方法提取石榴籽的可溶性成分 ,并用气相色谱-质谱联用法对提取部位进行化学
成分分析 , 峰面积归一化法计算各组分的相对含量。 结果:共分离鉴定了 10种化合物 , 主要成分含量为亚油酸
40.0%、油酸 22.7%、棕榈酸 17.5%、硬脂酸 9.0%及共轭亚油酸 5.7%。结论:藏药材石榴籽的主要化学成分为亚
油酸和油酸 , 两者含量共占全部提取物的 62.7%。
关键词 藏药材;石榴籽;超临界 CO2萃取;GC-MS
中图分类号:R284.1/R284.2 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2007)11-1401-03
作者简介:魏立新(1967-),男,理学博士 ,从事藏药成分分析及药理作用研究;电话 0971-6143668, E-mail:lxwei@nwipb.ac.cm。
石榴籽为安石榴科植物安石榴 Punicagranatum
L.的干燥种子 ,作为常用的藏药材被收载于 《中华
人民共和国卫生部药品标准 ·藏药 》(第一册),主
治培根寒症 , 胃寒症及一切胃病〔1〕。藏药名称为
“赛珠” ,在著名的经典藏医学著作《四部医典》和经
典藏药学著作《晶珠本草 》中均有详尽记载 ,是藏医
(中医用石榴皮)最常用的驱寒 、提升胃火的药材。
“石榴籽是消除一切寒病之君王 ,多数寒证是因胃
火衰弱而引起 。提升胃火石榴籽的效果最佳 ,其他
药无法与其相比 ,故称为君王方 ”〔2〕。在这些君王
方中 ,以 “石榴”命名的有 30种以上 。上述部颁标
准收载的 200种常用藏药制剂中 ,含石榴籽的有 45
1401中 药 材 JournalofChineseMedicinalMaterials 第 30卷第 11期 2007年 11月