全 文 ：超高效液相色谱-串联质谱法测定香草兰
中多菌灵和甲霜灵残留
乐 渊1, 尹桂豪1， 刘春华1， 宗 迎2， 万 瑶1, 徐 志1
（1.中国热带农业科学院分析测试中心， 海南 海口 571101； 2.中国热带农业科学院香料饮料研究所， 海南 万宁 571533）
摘 要：建立了香草兰样品中多菌灵和甲霜灵残留的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测方法。 样品用乙腈溶液
提取，经氨基活性碳复合固相萃取柱净化，以多离子反应监测（MRM）模式进行测定。 多菌灵和甲霜灵的最低检出限均为 2.0
μg/kg，在 10.0 ~ 500.0 ng/mL 的线性范围内，相关系数均大于 0.99。多菌灵在香草兰中的添加回收率为 84.2%~100.3%，相对标准偏
差（RSD）为 1.3%~5.4%；甲霜灵在香草兰中的添加回收率为 80.4%~100.0%，相对标准偏差（RSD）为 1.7%~6.2%。 该方法灵敏度高、
准确性好、分析时间短，适用于香草兰样品中多菌灵和甲霜灵残留量的检测。
关键词：超高效液相色谱-串联质谱法； 多菌灵； 甲霜灵； 香草兰
中图分类号：TS207.7； O657 文献标识码：A 文章编号：1004-874X（2012）19-0098-04
Determination of carbendazim and metalaxyl in vanilla by ultra
performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
LE Yuan1, YIN Gui-hao1, LIU Chun-hua1, ZONG Ying2, WAN Yao1, XU Zhi1
(1.Analysis and Testing Center, Academy of Tropic Agriculture Science, Haikou 571101, China;
2.Beverage and Spice Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agriculture Science, Wanning 571533, China)
Abstract: An analytical method was developed for the determination of carbendazim and metalaxyl in vanilla by using ultra
performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）. The pesticides were extracted by acetonitrile,
and cleaned up by carbon/NH2 solid phase extraction (SPE) column, then quantified with multiple reactions monitoring (MRM). The limits
of detection (LOD) for both pesticides were 2.0 μg/kg. Calibration curves exhibited good linearity over the concentration range from 10.0
to 500.0 ng/mL, with their correlation coefficients above 0.99. Average recoveries for carbendazim spiked at 3 levels ranged from 84.2% to
100.3%, with a relative standard deviations（RSD） range from 1.3% to 5.4%. Average recoveries for metalaxyl spiked at 3 levels ranged
from 80.4% to 100.0%, with a RSD range from 1.7% to 6.2%. The developed method was sensitive, rapid and reliable. As a result, it can
be applied for determination of carbendazim and metalaxyl in vanilla.
Key words: UPLC-MS/MS; carbendazim; metalaxyl; vanilla
香草兰又名香荚兰、香子兰等，是一种名贵的多年生
热带藤本香料植物，原产于墨西哥东南部及洪都拉斯、马
达加斯加等热带岛屿国家和地区 [1]。 香草兰鲜豆荚经生
香加工后具有沁人心脾的独特香气，广泛用于高档食品、
香烟、酒、化妆品和医药等的配香原料，素有“天然食品
香料之王”的美誉。 自 1962 年中国热带农业科学院从斯
里兰卡引种试种成功后， 香草兰在我国海南省和云南省
等地有较大面积种植 [2]。 在种植过程中，为有效防治根
（茎） 腐病和细菌性软腐病等病害， 通常会施用各种农
药 [3]。 多菌灵又名棉萎灵、苯并咪唑 44 号，是一种广谱性
杀菌剂，对水稻、棉花、蔬菜和果树等作物由真菌引起的
病害有防治效果 [4-6]。 甲霜灵属低毒内吸性杀菌剂，可用
于防治黄瓜霜霉病和疫病 ，茄子 、番茄及辣椒的棉疫
病等 [7-8]。 多菌灵和甲霜灵可用于防治香草兰镰刀菌根
（茎）腐病和疫病等病害。
然而， 农药的不合理使用会影响农产品的质量安全，
进而有害于消费者的身体健康。目前有关香草兰中多菌灵
和甲霜灵的残留检测研究尚未见报道，本试验利用固相萃
取小柱净化，超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）
测定香草兰中多菌灵和甲霜灵的残留量。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验原料：香草兰豆荚由中国热带农业科学院香辛饮
料研究所提供。
试验试剂：多菌灵和甲霜灵标准品购自农业部环境保
护科研监测所；甲醇、乙腈购自美国 Fisher 公司，色谱纯；
甲苯购自上海国药集团， 分析纯； 试验用水为经 Milli-Q
净化系统 0.22 μm 过滤膜过滤的纯化水。
试验仪器和设备：Waters 超高效液相色谱-四极杆串
联质谱仪（ACQUITY UPLC/Quattro PremierTM XE），配有电
喷雾离子源 （ESI） 和 MasslynxTM 4.0 工作站， 购自美国
收稿日期：2012-07-16
基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项（200903024-03）
作者简介：乐渊（1985-），男，硕士，研究实习员，E-mail：leyuan06
@sina.com
通讯作者：徐志（1978-），男，硕士，副研究员，E-mail：honic@yeah.
net
广东农业科学 2012 年第 19 期98
C M Y K
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2012.19.039
药剂
多菌灵
甲霜灵
保留时间（min）
3.52
4.41
电离方式
ES+
ES+
母离子（m/z）
192.0
280.2
锥孔电压（V）
33
20
子离子 1（m/z）
160.1*
220.1*
碰撞能量
18
14
子离子 2（m/z）
132.1
192.1
碰撞能量
28
12
表 2 MRM 分析的质谱参数
注：带“*”为定量离子。
表 1 梯度洗脱程序
时间
（min）
0
1.0
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
A（%）
10.0
30.0
70.0
70.0
75.0
10.0
10.0
B（%）
90.0
70.0
30.0
30.0
25.0
90.0
90.0
梯度变化曲线
6
6
6
6
6
6
6
流动相
Waters公司；ACQUITY_ UPLCTM BEH C18（2.1 mm× 100 mm，
1.7 μm）色谱柱，购自美国Waters公司；氨基活性碳复合固
相萃取柱（500 mg/6mL），购自美国瓦里安公司；电子分析
天平，购自瑞典梅特勒托利多公司；离心机，购自上海安亭
科学仪器厂；超声仪，购自上海必能信超声有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 标准溶液的配制 将多菌灵和甲霜灵标准品用甲
醇配制成浓度为 100 μg/mL 的混合标准储备液， 在-18℃
避光保存， 有效期 3 个月。 将上述标准储备液用流动相
（甲醇-水，体积比为 1∶1，下同）稀释成浓度为 10.0、20.0、
50.0、100.0、200.0、500.0 ng/mL 的系列混合标准溶液，现配
现用。
1.2.2 样品前处理 取香草兰豆荚（约 200 g），用干净纱
布轻轻擦去表面的附着物，切成小片段，粉碎后密封，制
成试样备用，常温下保存。 称取 5.00 g 样品于 50.0 mL 聚
四氟乙烯离心管中，加入 10 mL 乙腈，超声 15 min，随后
在离心机中以 4 000 r/min 的转速离心 5 min，将上清液转
移到蒸馏瓶中。 残渣再加入 10 mL 乙腈，重复提取 1 次，
合并上清液于蒸馏瓶中，35℃下浓缩至干。 加入 2 mL 甲
苯-乙腈（体积比为 1∶3，下同）溶解，待净化。 氨基活性碳
固相萃取小柱预先用 6 mL 甲苯-乙腈活化， 然后加入上
述提取液，用 20 mL 甲苯-乙腈洗脱，流速约为 1 滴/s，收
集全部洗脱液于蒸馏瓶中，35℃下浓缩至干。 用 1.00 mL
甲醇-水溶解，涡旋，过 0.2 μm微孔滤膜，待仪器测定。
1.2.3 仪器工作条件 UPLC 工作条件： 流动相 A 为甲
醇，流动相 B为含 1 mmol乙酸铵的水溶液；柱温：35℃；样
品室温度：10℃；进样体积：5 μL；流速：0.25 mL/min。 梯度
洗脱程序见表 1。
ESI-MS/MS 工作条件：正离子电离模式；毛细管电压：
3.00 kV；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：900 L/h；锥
孔气流量：50 L/h； 离子源温度：110℃； 碰撞气流速：0.21
mL/min。 MRM 分析的质谱参数见表 2。
2 结果与分析
2.1 固相萃取柱的选择
由于香草兰含有多种香气成份，基质较为复杂，直接
上机会对仪器测定造成干扰， 文献报道多采用固相萃取
柱净化的方法去除基质干扰[9-11]。 固相萃取柱的类型是影
响方法回收率的重要因素之一。 通过加标富集的方法测
试了费罗里硅土柱、氨基固相萃取柱、氨基活性碳复合固
相萃取小柱和中性氧化铝柱等 4 种固相萃取柱的净化富
集效果。费罗里硅土柱的回收率为 70.8%~75.9%（多菌灵）
与 56.5%~64.7%（甲霜灵 ）； 中性氧化铝柱的回收率为
54.6%~60.1%（多菌灵）与 37.9%~49.2%（甲霜灵）；氨基固
相萃取柱和氨基活性碳复合固相萃取柱的回收率达
79.1%~86.3%（多菌灵）和 90.0%~103.2%（甲霜灵）。 氨基
活性碳复合固相萃取柱的洗脱液为澄清透明， 另外 3 种
小柱的洗脱液呈深黄色， 说明氨基活性碳固相萃取柱去
除色素等杂质的效果好。 因此，选用氨基固相萃取柱作为
测定多菌灵和甲霜灵的前处理固相萃取柱。
2.2 提取溶剂和体积的选择
提取溶剂的种类也直接影响方法回收率的高低 。
良好的提取溶剂应对目标农药的提取效率高， 而对杂
质则会较少提取 [12-13]。 试验在空白香草兰样品中添加
20 μg/kg 水平的多菌灵与甲霜灵 ，分别用乙腈 、甲醇 、
丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯等溶剂提取。 结果表明，以
乙腈作提取溶剂时， 回收率最高、 分别达 87.7%（多菌
灵）和 97.6%（甲霜灵），且提取液颜色较浅，其他 4 种溶
剂的提取液呈棕黄色、颜色较深。 因此，选用乙腈作为
提取溶剂。
过少的提取溶剂因不能将目标农药从样品中完全提
取出来，会导致方法的回收率低；而过多的提取溶剂则会
使试验成本增高，并导致环境污染[14]。 在空白香草兰样品
中添加 20 μg/kg 水平的多菌灵与甲霜灵， 用不同体积的
乙腈进行提取， 测定结果见图 1。 当提取溶剂体积为 20
mL时，多菌灵和甲霜灵的回收率达 86.2%、94.9%，体积再
增加，回收率没有明显提高。 为减少溶剂的使用量，提取
溶剂体积选为 20 mL。
2.3 洗脱溶剂体积的选择
因甲苯-乙腈混合溶剂对多菌灵和甲霜灵有较强的
洗脱能力[15-16]，故选择甲苯-乙腈作为洗脱溶剂。 在空白香
草兰样品中添加 20 μg/kg 水平的多菌灵与甲霜灵， 用不
99
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表 3 多菌灵和甲霜灵的标准曲线
药剂
多菌灵
甲霜灵
回归方程
y=5762.85x+41419.1
y=5721.91x+13168.2
相关系数
R2
0.9927
0.9979
线性范围
（ng/mL）
10.0~500.0
10.0~500.0
表 4 方法回收率及精密度试验结果 （n=5）
药剂
多菌灵
甲霜灵
标准加入量
（μg/kg）
2.0
10.0
20.0
2.0
10.0
20.0
回收率
（%）
86.4~100.3
86.0~90.5
84.2~87.7
80.4~95.1
92.6~100.0
93.2~97.6
平均回收率
（%）
94.7
87.8
85.8
88.5
97.2
95.9
相对标准偏差
（%）
5.4
2.0
1.3
6.2
3.2
1.7
保留时间（min）
图 3 甲霜灵和多菌灵的标准质谱峰
甲霜灵
甲霜灵
多菌灵
多菌灵
峰
面
积
峰
面
积
峰
面
积
峰
面
积
100
90
80
70
60
50
回
收
率
（ %
）
10 20 30 40
提取溶剂体积（mL）
图 1 提取溶剂体积对回收率的影响
甲霜灵
多菌灵
同体积的洗脱剂洗脱，结果见图 2。 当洗脱体积为 20 mL
时，多菌灵和甲霜灵的回收率达 87.5%和 94.5%，洗脱溶
剂体积再增加，回收率没有明显提高。 因此，洗脱溶剂体
积选为 20 mL。
2.4 仪器条件的优化
试验比较了甲醇-水（含 0.1%甲酸）、乙腈-水（含 0.1%
甲酸）和甲醇-水（含 1 mmol 乙酸铵）作为流动相时的效
果，结果表明，甲醇-水（含 1 mmol 乙酸铵）体系具有对多
菌灵和甲霜灵较好的分离能力与峰形， 加入的乙酸铵能
增加离子化效率，使质谱的灵敏度提高。
分别对多菌灵和甲霜灵进行质谱分析， 以优化质
谱分析条件，获得最佳灵敏度。 质谱检测采用正离子模
式，与负离子模式相比响应更好。 研究了不同参数，如
毛细管电压（2.0～4.5 kV）、脱溶剂气温度（250～450℃）、
脱溶剂气流量（350～900 L/h）和锥孔气流量（10～60 L/min）
等对测定结果的影响 ， 确定最佳参数分别为 3.0 kV、
350℃、900 L/h 和 50 L/min。 此条件下的标准质谱峰见
图 3。
2.5 标准曲线与检出限
分别配制浓度为 10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0
ng/mL 的多菌灵和甲霜灵混合标准溶液， 用上述方法测
定，经线性回归发现线性范围为 10.0~500.0 ng/mL。 分别
以多菌灵和甲霜灵峰面积为纵坐标、 质量浓度为横坐标
绘制标准曲线，其回规方程及相关系数见表 3。 以信噪比
S/N=3 计，方法中多菌灵和甲霜灵的最低检出限（LOD）均
为 2.0 μg/kg。
2.6 精密度与准确度试验
取空白香草兰样品，按 2.0、10.0、20.0 μg/kg 3 个水平
进行加标，按上述方法进行处理，平行测定 5次，作回收率
和精密度试验。 结果（表 4）显示，回收率在 80.4%～100.3%
之间， 相对标准偏差（RSD）在 1.3%～6.2%之间，符合方法
学要求。
3 结语
本研究结果表明，采用超高效液相色谱-串联质谱法
测定香草兰中多菌灵和甲霜灵的残留，分析时间短，只需
要 5.0 min，大大提高了工作效率。 采用氨基活性碳复合
固相萃取柱净化样品，具有回收率高、重复性好等优点。
多离子反应监测（MRM）模式抗干扰能力强，使得方法的
选择性好、灵敏度高，精密度和准确度都能达到定量分析
100
90
80
70
60
回
收
率
（ %
）
甲霜灵
多菌灵
10 20 30
洗脱溶剂体积（mL）
图 2 洗脱溶剂体积对回收率的影响
100
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剂量依赖关系。 当多糖浓度分别为 9 mg/mL时，菌丝体多
糖组分 M1、M2 和 M3 对·OH 的清除率分别为 61.67%、
43.59%和 37.02% ； 对 O2 -·的清除率分别为 64.63% 、
44.71%和 36.07%。
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