全 文 ：　遗 传 学 报　Acta Genetica Sinica , April 2004 , 31 (4):363 ～ 368 ISSN 0379-4172
收稿日期:2003-01-24 ;修回日期:2003-11-06
基金项目:国家自然科学基金(编号:30070510)和教育部高等学校骨干教师资助计划项目资助[ Supported by National Natural S cience Foundation of
China(No.30070510)and Program Foundation for the Outstanding Teachers by the Ministry of Education of China]
作者简介:袁善奎(1976-),男 ,现在中国农业大学从事博士后研究 ,研究方向:植物病原菌抗药性。 E-mail:skyuan76@sina.com
①　通讯作者。 E-mail:mgzhou@njau.edu.cn
Induction and Genetic Analysis of Laboratory Mutants
of Gibberella zeae Resistance to Carbendazim
YUAN Shan-Kui , ZHOUMing-Guo①
(Department of Plant Pathology , Nanjing Agricultural University , Nanjing　210095 , China)
Abstract:The mutants of wild-type Gibberella zeae resistance to carbendazim were generated in laboratory by ultra-violet(UV)ir-
radiating and fungicide taming.Two levels of resistance(low , LR;high ,HR)were identified among these mutants.LR mutants could
grow at the critical concentration of 1.4 μg/mL of carbendazim while completely inhibited above 10μg/mL concentration , but this
phenotype of isolates was not detected in the field.HR mutants could grow at 100 μg/mL and showed negative cross-resistance with
N-phenylcarbamate fungicides , such as N-(3 , 5-dichlorophenyl)carbamate(MDPC)whereas the LR mutants were not.Moderate re-
sistant(MR)mutants which could grow fast at 10μg/mL, but completely inhibited at 100 μg/mL , were not generated in laborato-
ry.HR mutants of field MR isolate were also generated by fungicide taming on 100μg/ mL of carbendazim , but these mutants didn
t express negative cross-resistance to MDPC.The genetic study suggested that the carbendazim-resistance in these mutants could be
steadily inherited by asexual and selfed reproduction , and the resistance was controlled by the same single major gene both in labo-
ratory mutants and field resistant isolates , the different levels of resistance or the same resistant level in different strains maybe con-
ferred by mutations at different sites or one site with different allelic mutations.The gene compensates for the sensitivity to MDPC
was allelic to that governs the carbendazim resistance , but the mutation for increasing sensitivity to MDPC in this gene could get the
pathogen highly resistant to carbendazim.
Key words:Gibberella zeae;carbendazim;resistant mutants;genetics
玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)对多菌灵的室内抗药
突变体的诱导及其抗药性遗传分析
袁善奎 , 周明国①
(南京农业大学植物病理学系 , 南京　210095)
摘　要:通过紫外线照射和药剂驯化的方法均获得了玉蜀黍赤霉野生敏感菌株对多菌灵(carbendazim ,MBC)的室
内抗药突变体。这些抗药突变体一部分表现低抗(low resistance , LR), 即能在临界致死剂量 1.4 μg/mL多菌灵浓度
下生长 ,但不能在 10 μg/mL浓度以上生长 , 且对二氯苯胺甲酸甲酯(N-3 , 5-dichlorophenyl carbamate,MDPC)不表现负
交互抗药性;另一部分表现高抗(high resistance ,HR), 即能在 100 μg/mL 多菌灵浓度下生长 , 并与田间高抗菌株一
样 ,对MDPC 表现负交互抗药性;没有获得类似田间的中抗(moderate resistance ,MR)菌株 ,即能在 10 μg/mL多菌灵浓
度下快速生长 ,在 100 μg/mL浓度以上被完全抑制的突变体。通过药剂驯化的方法还获得了田间中抗(MR)菌株的
高抗(HR)突变体 , 但这些突变体与MR一样对 MDPC 仍然不表现负交互抗药性。抗药性遗传研究表明 , 在所研究
的抗药突变体中 ,抗药性在自交和无性繁殖后代中能稳定遗传;室内抗药突变体和田间抗药菌株对多菌灵的抗药
性由同一个主效基因控制 ,但它们发生突变的位点不同或者同一碱基位点发生了不同的突变;对 MDPC 的敏感性
也是由单个基因控制的 ,该基因与控制多菌灵抗性的基因是等位基因 , 当该基因发生对 MDPC 的敏感性增加的突
变时会使病菌对多菌灵产生高水平抗性。
关键词:玉蜀黍赤霉;多菌灵;抗药突变体;遗传
中图分类号:Q75　　　文献标识码:A　　　文章编号:0379-4172(2004)04-0363-06
　　玉蜀黍赤霉[ Gibberella zeae(Schwein.)Petch] 无
性时 期为 禾 谷 镰 孢 霉 (Fusarium graminearum
Schwabe),是中国小麦赤霉病的主要致病菌 。近 30
年来 ,以多菌灵为代表的苯并咪唑类杀菌剂被广泛
用于该病的防治 ,使得部分田间已出现了严重的抗
药性问题[ 1] 。遗传学研究表明 ,该菌对多菌灵的田
间抗药菌株的抗性遗传方式[ 2]与灰霉病菌[ 3] 、苹果
黑星病菌[ 4]等对苯并咪唑类药剂的抗性遗传类似 ,
都是由单个主效基因所控制。但分子生物学研究表
明 ,该菌对多菌灵的抗性分子机制与目前已知的其
他真菌存在差异[ 5 , 6] 。
紫外线(UV)诱变和药剂驯化是室内诱导病原
菌抗药突变体的两种常用方法 。本研究采用了这两
种方法诱导玉蜀黍赤霉对多菌灵的室内抗药突变
体 ,并比较了这些突变体与田间抗药菌株对药剂的
敏感性和抗药性遗传背景 ,旨在了解室内诱导抗药
突变体与田间抗药菌株的差异 。
1　材料和方法
1.1　供试病菌
供试菌为玉蜀黍赤霉病菌 ,从小麦赤霉病病穗
上分离 ,其中菌株 ZF43为野生敏感菌株(S), ZF52
为田间对多菌灵的中等抗性菌株(MR), ZF04 为田
间高抗菌株(HR),均由本实验室王建新提供 。
1.2　供试药剂
98%多菌灵(carbendazim)原药(上海吴淞化工
厂生产)和 90%二氯苯胺甲酸甲酯(MDPC)原药(江
苏新沂农药厂生产),分别预溶于 0.1 mol/mL 的盐
酸溶液和甲醇中制成 1×104 μg/mL的母液备用。
1.3　抗药突变体的诱导
1.3.1　紫外线诱变
将ZF43菌株在 5%绿豆汤(50 g绿豆+1000 mL
水)中振荡培养 7 d(25℃、12 h光照/d),滤去菌丝 ,
将滤液在 3000 r/min下离心 10 min ,去掉上清液 ,调
节孢子浓度至 106 ～ 108个孢子/mL。然后将 0.1 mL
孢子悬浮液涂布在含 1μg/mL 多菌灵的马铃薯蔗糖
琼脂(PSA)平板( 9 cm)上 ,共 10个平板 ,25℃下萌
发 6 h后在黑暗条件下将平板置于距离紫外灯(25
W)下 30 cm 处照射45 s(使 90%～ 95%的孢子致死
的剂量),诱变后于黑暗条件下培养 7 d ,将平板上长
出的菌落转移到无药 PSA 平板上复壮培养 ,保存待
用[ 7] 。
1.3.2　药剂驯化
将 ZF43菌株在 PSA平板上预培养 2 d ,然后打
取直径为2 mm 的菌丝块接种到含 1 μg/mL多菌灵
的 PSA 平板( 9 cm)上 ,每皿接种 3块 ,共接种 50
皿 ,置于 25℃下培养 。挑取菌落边缘快速生长的扇
形角突变体于无药 PSA平板上复壮培养 ,并在 100
μg/mL浓度的 PSA平板上驯化ZF52的高抗突变体。
将1.3.1 和 1.3.2获得的抗药突变体 ,在 PSA
平板上连续转移培养 10代 ,然后对抗性稳定的突变
体进行单孢纯化 ,建立起各抗药突变体的单分生孢
子菌株 ,用于以下研究 。
1.4　抗药突变体对多菌灵和MDPC的敏感性测试
将各抗药突变体及其亲本菌株在分别含不同浓
度多菌灵和MDPC的PSA平板上25℃培养3 d ,测定
对这两种药剂的敏感性 ,并与田间不同抗性水平的
菌株进行比较。参考文献[ 2 ] 中的方法划分抗药
突变体对多菌灵的抗性水平。根据各菌株对MDPC
的敏感性差异分析抗多菌灵的突变体对MDPC 有无
交互抗药性 。
1.5　抗药性在自交和无性后代的遗传稳定性
随机挑取不同抗性水平的抗药突变体各 1株 ,
在 5%绿豆汤中诱导分生孢子产生 ,并参考 Bowden
等[ 8]的方法让各突变体在胡萝卜培养基上自交产生
子囊壳 。最后建立各突变体的无性单分生孢子后代
和自交单子囊孢子后代各 30株 ,并测定对多菌灵和
MDPC的抗药表型。分析抗药突变体的抗药性状在
自交和无性繁殖后代是否稳定。
1.6　抗药性遗传研究
1.6.1　遗传标记
364 遗传学报　Acta Genetica Sinica　Vol.31　No.4　2004
参考Correll等[ 9]的方法诱导用于遗传杂交菌株
的 nit 突变体 ,并鉴定出突变类型。
1.6.2　菌株杂交
所有杂交在直径为 9 mm的胡萝卜培养基平板
上进行 。分别挑取带不同类型 nit 标记的两菌株的
菌丝块 ,对峙接种在胡萝卜培养基平板上 ,菌丝块间
相距 5 mm ,25℃培养 7 d后 ,参考 Bowden等[ 8]的方
法让菌株杂交产生子囊壳 。
1.6.3　杂交后代的建立及后代表型鉴定
对不同的杂交组合 ,分别随机挑取菌落交界处
的单个子囊壳 ,参考文献[ 2]中的方法筛选出由亲本
菌株间杂交产生的子囊壳 ,并建立杂交单子囊孢子
后代 。
按照 1.4的方法鉴定后代对多菌灵和MDPC 的
敏感性 ,根据不同表型在后代中的比例分析对这两
种药剂的抗性遗传规律。
2　结　果
2.1　抗药突变体的诱导
2.1.1　紫外线诱变
用于紫外线诱变的 ZF43菌株的分生孢子的最
终浓度是 4.7×107 个孢子/mL ,共获得 18 株能在
1.4μg/mL 多菌灵浓度下生长的稳定的抗药突变
体。因此在紫外线照射下该菌的分生孢子发生抗药
突变的频率为 1/(2.6×106)。此方法获得的抗药突
变体用“UV-ZF43-编号”表示 ,如“UV-ZF43-06”表示
由ZF43菌株通过紫外线诱变获得的第 6个抗多菌
灵的突变体。
2.1.2　药剂驯化
ZF43菌株在 1 μg/mL 多菌灵浓度下培养 10 d
后开始非常缓慢的生长 ,第 15 d部分菌落边缘开始
长出快速生长的扇形角突变菌落 ,到第 30 d时共获
得6株能在 1.4 μg/mL多菌灵浓度下生长的稳定的
抗药突变体 。药剂驯化得到的抗药突变体用“亲本
菌株-编号”表示 ,如“ZF43-02”表示由ZF43通过药剂
驯化获得的第 2个抗药突变体。
ZF43-02突变体在含 2 μg/mL 多菌灵浓度下生
长非常缓慢 ,但经过在该药剂浓度下继续驯化获得
了1 株能在 100 μg/mL 浓度下生长的高抗突变体
ZF43-02-05。由田间中抗菌株ZF52共获得 7株能在
100μg/mL 多菌灵浓度下生长的稳定的高抗突变
体 。
2.2　抗药突变体对多菌灵和MDPC的敏感性
由 ZF43和 ZF43-02诱导的抗药突变体中 ,ZF43-
06 、ZF43-02-05 、UV-ZF43-06 、UV-ZF43-17等 4株突变
体能在 100μg/mL多菌灵浓度下生长 ,故将其对多
菌灵的抗性水平划分为高抗(HR ,high resistance);其
余 21株突变体虽然都能在 1.4 μg/mL 浓度下生长 ,
但在≥10 μg/mL 浓度时生长受到完全抑制 ,对多菌
灵的抗性为低抗(LR , low resistance);没有得到类似
田间的中抗突变体(MR)。由中抗菌株 ZF52获得的
高抗突变体 ,都能在 100 μg/mL多菌灵浓度下生长 。
另外发现诱导的 4株高抗突变体与田间高抗菌
株ZF04 类似 , 它们比 ZF43 、ZF52 及其他突变体对
MDPC更敏感 ,表现负交互抗药性;但其他抗药突变
体及田间敏感菌株和中抗菌株对MDPC不表现负交
互抗药性。
2.3　抗药突变体的抗药性状在自交和无性后代的
稳定性
　　以 ZF43-02(CLRMR)、ZF43-02-05(CHRMS)、UV-
ZF43-6(CHRMS)、ZF52-07(CHRMR)等为代表菌株 ,研
究发现各突变体对多菌灵(C)和MDPC(M)的敏感性
在自交和无性繁殖后代中能稳定遗传 ,抗药表型未
发生变异 ,说明对这两种药剂的抗性由可稳定遗传
的因子所控制。
2.4　抗药性在有性杂交后代中的遗传
根据 Bowden 等[ 8]的研究结果 ,两个带不同 nit
突变类型(如 nit1 和nit3)的玉蜀黍赤霉菌株之间杂
交 ,其后代中会出现野生型重组体 ,且 nit 突变体与
野生型后代之比理论上应为 3∶1。本研究统计分析
表明 ,研究的 6个不同组合的单子囊壳后代中 , nit
和野生型后代之比均符合 3∶1(表 1),说明这几个子
囊壳都是由亲本杂交产生 ,而不是亲本之一自交的
结果。此外 , 各杂交后代的子囊孢子萌发率均在
95%以上 ,说明随机分析的杂交后代中应包含了所
有的基因型 。
365YUAN Shan-Kui et al.:Induction and Genetic Analysis of Laboratory Mutants of Gibberella zeae Resistance to Carbendazim
表 1　nit标记在不同杂交组合的子囊孢子后代中的重组情况
Table 1　Recombination of nit marker in the ascospore progeny of different crosses
杂交编号
No.of crosses
亲本菌株代号
Number of parental
i solates
亲本菌株
nit表型
nit mutant type of
parental isolates
子囊孢子
萌发率
Ascospore
viability(%)
后代总数
Observed progeny
nit和野生型后代数目
Number of nit and
wild-type progeny
nit-type Wild-type
χ2(3∶1)a)
Chi-square
testsa)
a ZF43×ZF43-02 nit3×nit1 96 99 77 22 0.2727
b ZF43×ZF43-02-05 nit1×nit3 95 59 43 16 0.0508
c ZF43-02×ZF43-02-05 nit1×nit3 99 100 81 19 1.6133
d ZF52＊×ZF43-02-05 nit1×nit3 96 96 70 26 0.1251
e ZF04＊×ZF52-07 nit1×nit3 97 100 71 29 0.6533
f UV-ZF43-6×ZF43-02 nit3×nit1 96 102 81 21 0.8373
　a):χ20.05 ,1=3.84;“ ＊”为田间抗药菌株。
　a):Expected value for a 3∶1 ratio at P=0.05 is 3.84;Isolates marked with `＊ is field resistant type.
　　通过对多菌灵的抗性遗传研究表明(表 2),在
杂交 a和 b中 ,S分别与室内诱导的 LR和HR杂交 ,
后代中只有双亲的表型均表现出 1∶1的分离比例 ,说
明通过药剂驯化获得的低抗和高抗均是由单个主效
基因所控制;杂交 c 的后代中 , LR与 HR之比完全
符合 1对等位基因分离的孟德尔遗传规律 ,说明低
抗基因与高抗基因是等位基因;田间MR与室内诱
导的 HR的杂交 d 的后代中 ,也未出现表型重组的
个体 ,说明室内诱导的高抗基因与田间的中抗基因
也是等位基因;杂交 e的研究结果表明 ,室内由田间
MR诱导的高抗基因与田间的高抗基因为等位基
因;杂交 F 为紫外线诱变得到的 HR与药剂驯化得
到的 LR的杂交 ,后代中 HR与 LR之比符合1∶1的分
离比例 ,说明紫外线诱变得到的抗药基因与药剂驯
化得到的抗药基因是等位基因 。这些结论说明 ,无
论采用紫外线诱变还是采用药剂驯化方法均可获得
与田间抗药基因为等位基因发生突变的玉蜀黍赤霉
对多菌灵的室内抗药突变体 ,不同的抗性表型可能
是由于该基因发生突变的碱基位点不同或同一碱基
位点的突变方式不同造成的 。
表 2　对多菌灵和MDPC的抗性表型在杂交后代中的分离
Table 2　Segregation of carbendazim and MDPC resistance among progeny of different crosses
杂交编号
No.of crosses
亲本菌株抗药表型
Parental phenotypes
of fungicide
resistance
杂交后代中不同抗药表型的菌株数
Number of progeny with
different sensitivity to carbendazim andMDPC
CS
MS
CS
MR
CLR
MS
CLR
MR
CMR
M S
CMR
MR
CHR
MS
CHR
MR
χ2(1∶1)a)
Chi-square testsa)
C-抗性
C-resistance
M-抗性
M-resistance
a CSMR×CLRMR 0 47 0 52 0 0 0 0 0.1616 NS
b CSMR×CHRM S 0 29 0 0 0 0 30 0 0 0
c CLRMR×CHRMS 0 0 0 53 0 0 47 0 0.2500 0.2500
d CMRMR×CHRMS 0 0 0 0 0 41 55 0 1.7604 NS
e CHRMS×CHRMR 0 0 0 0 0 0 48 52 NS 0.0900
f CHRMS×CLRMR 0 0 0 48 0 0 54 0 0.2451 0.2451
　a):χ20.05 ,1=3.84;C和M 分别代表多菌灵和MDPC;S 、R、LR、MR、HR分别表示敏感 、抗性 、低抗 、中抗 、高抗;NS:没发生分离。
　a):Expected value for a 1∶1 ratio at P=0.05 is 3.84.C:Carbendazim;M:MDPC;S:Sensitive;R:Resistant;LR:Low resistant;MR:Moderate resistant;HR:
Highly resistant;NS:No segregation.
　　此外 ,对 MDPC 敏感性相同的亲本杂交(杂交
a、d),其后代对 MDPC 的抗性表型不发生分离 ,只有
亲本的表现型;而对 MDPC 敏感性不同的亲本杂交
(杂交 b 、c 、e 、f),双亲表型在后代中发生了 1∶1的分
离 ,没有出现表现型重组的后代 ,说明玉蜀黍赤霉对
MDPC的敏感性也是由单个基因控制的。
3　讨　论
本研究发现通过紫外线诱变 ,玉蜀黍赤霉分生
孢子发生对多菌灵抗性突变的频率为 1/(2.6×
106),该频率低于灰霉病菌[ 10]和油菜菌核病菌[ 11]对
366 遗传学报　Acta Genetica Sinica　Vol.31　No.4　2004
多菌灵的抗药突变频率 ,这可能是在使用多菌灵防
治小麦赤霉病近 20年之后才首次在田间检测到抗
药菌株的原因 ,而这类药剂一般在使用 1 ～ 3年之后
即可在田间检测到其他一些病原真菌的抗药菌
株[ 12 ,13] 。
由于只有从野生敏感菌株诱导的对多菌灵的
HR突变体和田间 HR菌株对MDPC 敏感 ,说明控制
MDPC敏感性的基因和多菌灵抗性基因是等位基
因 ,该基因发生对 MDPC敏感性增加的突变时可以
使病菌对多菌灵产生高水平抗性。另外 ,从杂交 e
中可以看出 ,虽然对多菌灵的抗性在杂交后代没有
分离 ,但是对 MDPC 的敏感性出现了 1∶1的分离比
例 ,这说明由田间 MR诱导的 HR突变体和田间的
HR菌株虽然都对多菌灵表现高抗 ,但由于发生突
变的方式不同 ,使得前者对MDPC 不表现负交互抗
性 ,同时也说明在该菌中至少有两种突变方式可以
导致对多菌灵表现高抗。
通常根据对室内获得的抗药突变体的适合度 、
抗性遗传规律等的研究来评估新药剂的抗性风险 ,
从而决定是否商品化或尽早制定抗性治理措施 ,因
此获得与田间抗性菌株一致的突变体对抗性风险评
估至关重要。而诱变(包括物理诱变如 UV 和化学
诱变如亚硝基胍)和药剂驯化是获得室内抗药突变
体的两种常用方法。但本文的研究发现 ,通过这两
种方法均没有得到田间的中抗突变体 ,而有田间所
没有的低抗突变体;而且即使获得了高抗突变 ,但多
菌灵对这些突变体的有效抑制中浓度(EC50)
(1.0738 ～ 4.7138 μg/mL)明显低于田间高抗菌株
ZF04(15.8533 μg/mL)。这说明在室内无论通过紫
外线诱变或药剂驯化均很难模拟复杂的自然条件而
获得与田间抗药菌株完全相同的抗药突变体 。因
此 ,如何在室内或温室条件下获得与田间完全相同
的抗药突变体是杀菌剂研究的一个重要课题 ,这对
于客观评价新药剂的田间抗性风险具有重要的意
义。
苯并咪唑类药剂的抗性分子机制研究表明 ,大
多数病菌的抗药性与编码其 β-微管蛋白的基因有
关[ 14] ,而最近报道在玉蜀黍赤霉对多菌灵的抗
性[ 5 ,6]和 Gibberella pulicaris[ 15]对噻菌灵的抗性中 ,抗
性菌株的 β-微管蛋白基因没有发生改变或者改变与
抗性无关。尽管用于遗传研究的抗药突变体有限 ,
不排除其他因子甚至胞质遗传基因与突变体的抗性
有关 ,但本文的研究证明在室内可以获得与田间抗
药菌株为等位基因发生突变的抗药突变体 。因此对
这些突变体的抗药基因的克隆有助于田间抗药菌株
的抗性分子机制的研究 。由于田间菌株的遗传背景
复杂 ,菌株间的遗传差异较大 ,而室内抗药突变体与
其亲本菌株间的遗传差异相对较小 ,采用现代分子
标记技术如 AFLP 、RFLP 等较易识别出抗药突变位
点 。因此 ,室内抗药突变体如 ZF43-02 、ZF43-02-05
等为抗药性分子机制的研究提供了一个很好的材
料 。
已报道灰霉病菌[ 3] 、梨黑星病菌[ 16]等对苯并咪
唑类药剂的高抗突变体反而对 MDPC 、乙霉威等 N-
苯氨基甲酸酯类药剂比野生敏感菌株更加敏感 ,呈
现负交互抗药性 ,并将 N-苯氨基甲酸酯类药剂用于
这些病菌对苯并咪唑类药剂的抗性治理。本研究发
现玉蜀黍赤霉对多菌灵的田间高抗菌株 ZF04也对
MDPC表现负交互抗性 ,这也说明了该菌对多菌灵
的抗性与其他病菌存在相似之处 。但由于目前田间
的抗性菌株主要是MR[ 2] ,因此不宜采用MDPC 治理
玉蜀黍赤霉对多菌灵的抗药性。
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(责任编辑:陈晓芳)
368 遗传学报　Acta Genetica Sinica　Vol.31　No.4　2004