全 文 ：玉蜀黍赤霉的营养亲和性及其对多菌灵的抗性
在菌丝融合过程中的遗传
袁善奎 , 周明国＊
(南京农业大学植物保护学院 , 江苏 南京 210095)
摘要:利用硝酸盐营养缺陷突变体 (nit)标记 , 对采自浙江 、 江苏 、 上海等地的 33 个玉蜀黍赤霉菌株的营养亲和性进
行研究。结果发现 , 这些菌株分别属于 30 个不同的营养亲和群 (VCGs), 表明中国玉蜀黍赤霉自然群体的遗传变异较
大。用药剂驯化法获得了 6株 ZF43 菌株的多菌灵 (MBC)室内抗药突变体 , 并研究了其中 2 株抗药突变体的营养亲和性
能。结果表明 , 玉蜀黍赤霉对多菌灵产生抗药性后不会改变其营养亲和性能。但发现在营养亲和的两菌株之间发生菌丝
融合以后 , 不能或很少能进行细胞核遗传物质的交换和重组 , 因此 , 菌丝融合在该菌对多菌灵的抗药群体发展中的作用
较小。
关键词:玉蜀黍赤霉;菌丝融合;多菌灵抗药性
中图分类号:S448.2　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000 2030 (2004)02 0039 04
Vegetative compatibility of Gibberella zeae and genetic study
on its resistance to carbendazim in hyphal fusion
YUAN Shan-kui , ZHOUMing-guo＊
(College of Plant Protection , Nanjing Agricultural University , Nanjing 210095 , China)
Abstract:Thirty-three isolates of Gibberella zeae collected from Zhejiang , Jiangsu and Shanghai belonged to 30 vegetative compatibility
groups (VCGs)with nitrate-nonutilizing mutants (nit).It indicated that the highly degree of genetic diversity existed in natural popula-
tion of G.zeae in China.Six laboratory carbendazim (MBC)-resistant mutants of ZF43 were obtained by fungicide-taming method , two
of which were focused on the vegetative compatibility.The results revealed that the vegetative compatibility of G.zeae couldn′t change in
the process of mutation for MBC-resistance.However , the nuclear gene couldn′t be exchanged or could exchange with very low chance be-
tween two vegetative compatible isolates after hyphal fusion.Therefore , hyphal fusion took very little effect on the development of MBC-re-
sistant population in G.zeae.
Key words:Gibberella zeae;hyphal fusion;carbendazim-resistance
菌丝融合 (hyphal fusion or anastomosis)是真菌形成异核体的途径之一 , 而异核体的形成是真菌进行
准性生殖 , 发生无性重组的必要条件。许多真菌 , 尤其是那些缺乏有性阶段的真菌如尖孢镰孢菌
(Fusarium oxysporum)[ 1] , 准性生殖是菌株之间进行遗传物质交换的重要途径。
营养缺陷型标记被广泛用于观察真菌在菌丝融合过程中所形成的异核体 , 从而研究真菌的营养亲和
性[ 2] 。硝酸盐用于缺陷突变体 (nitrate nonutilizing mutant , nit)标记因其诱导方法简便 、 成功率高 、 突
变特性稳定及不需要诱变剂等优点而被广泛用于研究真菌的营养亲和性。Bowden等[ 3 ,4]和McCallum等[ 5]
均采用 nit 标记研究了美国和加拿大等地区的玉蜀黍赤霉 (Gibberella zeae)的营养亲和性 。玉蜀黍赤霉
是引起中国小麦赤霉病的主要致病菌 , 以多菌灵为代表的苯并咪唑类杀菌剂是目前生产上防治该病的主
要药剂 , 但生产上已经出现了严重的抗药性问题[ 6] 。袁善奎等[ 7]研究发现 , 该菌对多菌灵的抗药基因可
以通过有性杂交在菌株之间进行交换 , 这无疑可以提高抗药菌株的遗传多样性和生存竞争能力 ,
　　收稿日期:2003 07 30
　　基金项目:国家自然科学基金项目 (30070510);教育部高等学校骨干教师资助计划项目
　　作者简介:袁善奎 (1976 ), 现为中国农业大学博士后。＊通讯作者 Corresponding author:周明国 (1954 ), 教授, 从事植物病理学研
究。 E-mail:mgzhou@njau.edu.cn
　南京农业大学学报　2004 , 27 (2):39～ 42
Journal of Nanjing Agricultural University
有利于抗药群体的发展。但目前尚无直接的证据表明无性重组在该菌的遗传与变异中的地位和作用。本
研究旨在了解采自浙江 、 江苏 、上海等地的玉蜀黍赤霉菌株间的营养亲和性 , 并探明菌丝融合在该菌对
多菌灵的抗药群体发展中的作用。
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　供试菌株　用于玉蜀黍赤霉菌丝融合群 (VCGs)鉴定的 S01 ～ S33号菌株 , 均分离自不同田块的
小麦赤霉病病穗 , 田块间距离 1 km以上。其中 S01 ～ S22号菌株采自江苏通州地区 , S23 ～ S27号采自上
海凇江地区 , S28 ～ S33号采自浙江嘉兴地区 , 均为单分生孢子纯培养菌株 , 且都对多菌灵敏感 (S)。
ZF43为采自浙江海宁的田间野生敏感菌株 。R01 ～ R31为室内保存的田间抗性菌株 , 均采自浙江省 , 且
都对多菌灵表现中抗 (MR)。
1.1.2　药剂　将 98%多菌灵 (carbendazim , MBC)原药 (上海吴淞化工厂生产)溶于 0.1 mol·mL-1的盐
酸溶液中 , 配制成 5 000μg·mL-1的母液 , 保存于 4 ℃冰箱中备用 。
1.1.3　培养基 　马铃薯蔗糖琼脂培养基 (PSA), 用于菌株的纯化 、 保存及对 MBC 的敏感性测定;
MMC 、 MM 、MO2 、 MH及MA培养基用于 nit 突变体的诱导和突变型鉴定[ 8] ;水琼脂培养基 (WA)(18 g
琼脂粉 , 1 000 mL去离子水)用于单孢后代的分离 。上述培养基均在 121 ℃下灭菌 20 min。
1.2　方法
1.2.1　多菌灵室内抗药突变体的诱导　将 ZF43菌株在 PSA平板上预培养 2 d , 然后取直径为 2 mm的菌
丝块接种到含多菌灵1 μg·mL-1的 PSA平板 (直径9 cm)上 , 每皿接种 3块 , 共接种 50皿。25 ℃培养 ,
挑取菌落边缘快速生长的扇形角突变体于无药 PSA 平板上复壮培养 , 将能够保持抗性的抗药突变体保
存备用。
1.2.2　菌株间的营养亲和性测定　参考Correll等[ 8]的方法诱导待测病菌的 nit 突变体 , 并鉴定出突变类
型。将带不同 nit标记的两菌株在以硝酸盐为唯一氮源的MM 培养基[ 8]上进行对峙培养 , 菌丝块间距离
3 ～ 5 mm。25 ℃培养 15 d后观察两菌株的菌落交界处是否出现表现野生型生长的融合带 。每处理重复 3
次。
1.2.3　玉蜀黍赤霉VCGs鉴定　按照 1.2.2的方法 , 测定S01 ～ S33号菌株间的营养亲和性 , 将相互之间
能够发生营养亲和的菌株划分为同一VCG , 并计算 VCGs的总数在测试菌株中所占的比例。
1.2.4　抗药性变异对营养亲和能力的影响　选取两株由ZF43诱导的抗多菌灵突变体 , 按照 1.2.2的方
法测定突变体与亲本菌株之间的营养亲和性 , 然后分析玉蜀黍赤霉对多菌灵的抗药性发生突变以后 , 是
否会改变其营养亲和性能 。
1.2.5　抗药性在菌丝融合过程中的遗传与变异　按照 1.2.2的方法测定 R01 ～ R31菌株之间的营养亲和
性 , 以及分别与 S01 ～ S33之间的营养亲和性。结合 1.2.3和 1.2.4的研究结果 , 分别选择营养亲和的 、
对多菌灵敏感性相同或不同的代表菌株在MM培养基上进行营养缺陷型互补。
用接种针挑取融合带表面表现野生型生长的菌丝于 50 g·L-1绿豆汤[ 9]中产生分生孢子 , 25 ℃振荡
培养7 d (每天 12 h光照)后滤去菌丝 , 调节分生孢子浓度至 1×103mL-1;用微量加样器吸取200μL 孢
子悬浮液均匀涂布在直径为 9 cm的 2%水琼脂平板上 , 让孢子在 25 ℃萌发 10 h;最后在 4×10倍显微
镜下用灭菌的解剖刀挑取单个萌芽的分生孢子于无药 PSA平板上培养 , 每组合至少挑取 1 000个孢子 。
待长成菌落以后 , 分别测定各单孢菌株对多菌灵的敏感性[ 7]及其 nit 突变类型[ 10] , 并根据这两种性状在
后代的分离和重组情况观察有无除两亲本菌株以外的重组表型个体 。同时以配对菌株分别单独产孢建立
的无性后代作对照。
2　结果与分析
2.1　抗多菌灵的突变体诱导
ZF43菌株在 1μg·mL-1的多菌灵中培养 10 d后开始非常缓慢地生长 , 第 15天部分菌落边缘开始长
出快速生长的扇形角突变菌落 , 第 30天时共获得 6株能在 1.4μg·mL-1多菌灵浓度下生长稳定的抗药突
·40· 　　　　　　　　　　　　　　南　京　农　业　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　　第 27 卷
变体 。经药剂驯化得到的抗药突变体用 “亲本菌株 编号” 表示 , 如 “ZF43-02” 表示由 ZF43通过药剂
驯化获得的第 2个抗药突变体。ZF43-02突变体在 2μg·mL-1多菌灵浓度下生长非常缓慢 , 但经过在该药
剂浓度下继续驯化 , 获得了 1株能在 100μg·mL-1多菌灵中生长的高抗突变体 ZF43-02-05。
2.2　玉蜀黍赤霉营养亲和群 (VCGs)的鉴定
从S01 ～ S33中共获得 213个 nit 突变体 , 营养亲和性测试发现 , S02 、 S06 、 S09等 3个菌株的不同
nit 突变体之间 , S16与S22的不同 nit 突变体之间以及同一菌株的不同nit 突变体之间在MM 培养基上培
养7 ～ 15 d后 , 在菌落交界处能够形成表现野生型生长的融合带 , 并在培养基质上产生颜色较深的红色
色素 。在这33个菌株中共存在 30个 VCGs , 所占比例为 90.9%, 表明引起浙江 、 江苏 、 上海等地的小
麦赤霉病的玉蜀黍赤霉变异较大 , 存在遗传多样性。
2.3　抗药性变异对营养亲和能力的影响
研究表明 , ZF43 、 ZF43-02 、 ZF43-02-05等 3个菌株之间能够相互发生营养缺陷型互补 , 说明玉蜀黍
赤霉发生对多菌灵的抗药突变以后不会改变其营养亲和能力 , 控制对多菌灵抗性的基因与控制其营养亲
和能力的基因无关。
2.4　抗药性在菌丝融合过程中的遗传与变异
对采自浙江的 31个田间抗性菌株之间的营养亲和性进行测定 , 发现只有 R14与 R17之间能够发生
营养缺陷型互补 。而 31个抗性菌株与 33个敏感菌株之间 , 只有 R03与 S21之间具有营养亲和性 , 证明
田间抗性菌株可以与野生敏感菌株之间发生菌丝融合 。
本试验共设计了 6组营养亲和性配对组合 (表 1), 研究发现 , 所有配对菌株单独无性繁殖的单分
生孢子后代的 nit突变型和对多菌灵的敏感性与其亲本菌株完全一致。因此 , 在配对菌株之间形成的融
合带菌丝产生的无性后代中 , 如果出现了除双亲表型以外的重组表型个体 , 则表明两菌株之间发生了遗
传物质的交换。
结果在所有组合的融合带菌丝的无性后代中均只有双亲的两种表型 , 而且两种表型出现的频率不
同 , 均没有发现不同 nit 突变体之间 , 以及 nit与多菌灵抗性基因之间发生重组的后代 (表 1)。这说明
玉蜀黍赤霉菌株之间在发生菌丝融合以后不能或很少发生细胞核遗传物质的交换和重组 。同时也证明多
菌灵抗性基因不能通过菌丝融合在菌株之间进行传递 , 或者发生的概率非常低 。
表 1　融合带菌丝无性后代的 nit表型及对多菌灵的敏感性
Table 1　nit mutation type and sensitivity to MBC of asexual progeny of fused mycelia
配对菌株表型 (nit 突变类型-对MBC的敏感性)
phenotype of paired isolates
(nit mutant type &sensitivity to MBC)
配对菌株 1　Paired isolate 1 配对菌株 2　Paired isolate 2
无性后代总数
Total number of
asexual progeny
不同配对菌株表型在后代中的分离数
Phenotype number of pai red isolates
segregated in asexual progeny
配对菌株 1 Paired isolate 1 配对菌株 2 Paired isolate 2
S06(nit1-S)＊ S09(nitM-S) 1 021 268 753
S16 (nit3-S) S22 (nit1-S) 1 009 697 312
R14(nit1-MR) R17 (nit3-MR) 1 004 474 530
R03(nit3-MR) S21 (nit1-S) 1 152 383 769
ZF43 (ni t1-S) ZF43-02 (nit3-LR) 1 006 641 365
ZF43-02 (nit3-LR) ZF43-02-05(nit3-HR) 1 013 723 290
　　注:＊S06:菌株代号;nit1:nit 突变生理型;S:对多菌灵敏感;LR:对多菌灵低抗;MR:对多菌灵中等抗性;HR:对多菌灵高
抗。S06 is the number of isolate;nit1 is the physiological type of nitrate-nonuti lizing mutat ion;S:Sensitivie to MBC;LR:Low resistant to
MBC;MR:Moderately resi stant to MBC;HR:Highly resistant to MBC.
3　讨　论
由于营养亲和性与真菌的遗传背景密切相关 , 反应了两菌株间的亲缘关系 , 因此营养亲和群的鉴定
常常被用于研究病菌群体的遗传变异程度和深入了解病菌的群体结构[ 2] 。本研究发现 , 采自浙江 、 江
苏 、上海等 3个地区的 33个玉蜀黍赤霉菌株中存在 30个 VCGs , 说明在我国引起小麦赤霉病的玉蜀黍
赤霉的VCGs变异较大 , 存在遗传多样性 , 这与美国 、 加拿大等国家的研究结果类似[ 3～ 5] 。
已有研究证明 , 在玉蜀黍赤霉中多菌灵抗药性状和 nit 性状均由细胞核基因控制 , 且这 2个性状在
·41·第 2期　　　　　　袁善奎等:玉蜀黍赤霉的营养亲和性及其对多菌灵的抗性在菌丝融合过程中的遗传
有性重组后代中不存在连锁关系[ 7] , 因此 , 融合带菌丝的无性后代中如果出现了这 2个性状重组的个
体 , 即表明两配对菌株之间发生了细胞核遗传物质的交换 。本研究证明营养亲和的玉蜀黍赤霉菌株之间
虽然能够发生胞质的融合形成异核体 , 但没有进一步发生细胞核的融合或进行准性生殖。这与 Adams
等[ 11]的研究结果类似 。由于发生了细胞质的融合 , 因此不能排除发生胞质遗传物质交换的可能 , 这可
以通过胞质遗传因子控制的性状结合核基因标记进行验证 。
徐雍皋等[ 12]观察发现 , 玉蜀黍赤霉的菌丝之间 , 不同子囊孢子或分生孢子萌发的芽管之间 , 同一
孢子不同细胞萌发的芽管之间的融合是极其常见的现象 , 故推测菌丝融合可能是引起该菌变异的主要原
因。但本研究发现 , 一方面玉蜀黍赤霉的VCGs变异较大 , 菌株之间发生菌丝融合的概率较低;另一方
面虽然亲和的菌株间发生了菌丝融合并形成了异核体 , 但不能或很少发生染色体基因的交换。因此认
为 , 菌丝融合不是引起玉蜀黍赤霉的一些由核基因控制的性状产生变异的主要原因 。已证明玉蜀黍赤霉
的菌株之间可以发生杂交[ 7] , 故有性重组或自发突变才是导致该菌核基因遗传多样性的主要原因 。以上
说明菌丝融合在玉蜀黍赤霉对多菌灵的抗药群体发展中的作用较小 , 而遗传重组可以使有利病菌生长繁
殖的遗传物质通过交换传递给抗性菌株 , 增强抗性菌株在田间的生存竞争能力 。
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责任编辑:夏爱红
·42· 　　　　　　　　　　　　　　南　京　农　业　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　　第 27 卷