全 文 ：　　收稿日期：２０１１－１１－０５
　　基金项目：新疆生产建设兵团博士资金专项（２００９ＪＣ０７）；教育
部新世纪优秀人才支持计划（ＮＣＥＴ－１１－１０７１）；国家自然科学
基金资助项目（３１２６００２６）
　　作者简介：任晓镤（１９８５－），男，硕士。
　　＊通讯作者
甘草及醉马草水煎液对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响
任晓镤１，陈　伟１，２＊，张利莉１　（１．新疆生产建设兵团 塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，新疆 阿拉尔
８４３３００；２．新疆生产建设兵团 塔里木畜牧科技重点实验室，新疆 阿拉尔８４３３００）
摘要：采用微量板半定量法研究新疆南疆地区特色中草药甘草及醉马草水煎液对表皮葡萄球菌的生长及其生物膜形
成的影响。结果显示，较高浓度（１５％及以上）的甘草水煎液能够通过抑制菌株的生长来影响表皮葡萄球菌生物膜的
形成；而低浓度（７．５％）的醉马草水煎液在不影响菌株生长的情况下对表皮葡萄球菌生物膜的形成有抑制作用。
关键词：甘草；醉马草；表皮葡萄球菌；生物膜
中图分类号：Ｓ８５２．６１；Ｓ８５３．７４　　　文献标志码：Ａ　　　文章编号：１００５－４５４５（２０１３）０１－０１２５－０４
Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｇｌｙｅｙｒｒｈｉｚａ　ｐｈｙｓｉｃ　ｌｉｑｕｏｒ　ａｎｄ　Ｇｌａｂｒｏｕｓ　ｃｒａｚｙｗｅｅｄ　ｈｅｒｂ　ｌｉｑｕｏｒ　ｏｎ　ｂｉｏ－
ｆｉｌｍ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ
　 ＲＥＮ　Ｘｉａｏ－ｐｕ１，ＣＨＥＮ　Ｗｅｉ　１，２＊，ＺＨＡＮＧ　Ｌｉ－ｌｉ　１　（１．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　＆ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ｉｎ　Ｔａｒｉｍ　Ｂａｓｉｎ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　＆Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｇｒｏｕｐ，Ａｌａｒ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ
８４３３００，Ｃｈｉｎａ；２．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｔａｒｉｍ　Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ｐｒｏ－
ｄｕｃｔｉｏｎ　＆Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｇｒｏｕｐ，Ａｌａｒ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ８４３３００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｅ　ｅｘｐｌｏｒｅｄ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｓｐｅｃｉａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｈｅｒｂｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ，Ｇｌｙｃｙｒ－
ｒｈｉｚａａｎｄ　Ｇｌａｂｒｏｕｓ　ｃｒａｚｙｗｅｅｄ　ｈｅｒｂ，ｏｎ　ｂｉｏｆｉｌｍ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ　ｉｎ　ｏｒｄｅｒ
ｔｏ　ｇｅｎｅｒａｔｅ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｆｏｒ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　ｃａｕｓｅｄ　ｂｙ　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ，ｅｓｐｅ－
ｃｉａｌ　ｆｏｒ　ｄａｉｒｙ　ｃｏｗ　ｍａｓｔｉｔｉｓ　ｉｎ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ．Ａ　ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　ａｓｓａｙ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｂｉｏｆｉｌｍ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｂｙ
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ａ　ｈｉｇｈ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　１５％ｏｒ　ａ－
ｂｏｖｅ　ｏｆ　Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｐｈｙｓｉｃ　ｌｉｑｕｏｒ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｃｅｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　ｂｉｏｆｉｌｍ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｂｙ
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ａ　ｌｏｗ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　７．５％ｏｆ　Ｇｌａｂｒｏｕｓ　ｃｒａｚｙｗｅｅｄ　ｈｅｒｂ
ｌｉｑｕｏｒ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｂｉｏｆｉｌｍ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｓｉｇｎｉｆｉ－
ｃａｎｔ　ｃｅｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ；ｇｌａｂｒｏｕｓ　ｃｒａｚｙｗｅｅｄ　ｈｅｒｂ；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ；ｂｉｏｆｉｌｍ
＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ
　　奶牛乳房炎一直是影响和制约奶牛业健康发展
的重要因素之一。葡萄球菌在引起奶牛乳房炎病原
菌中的分离率达到５０％以上［１］。表皮葡萄球菌
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）是一种条件致病菌，
能够形成生物膜是其重要的致病因子之一。形成的
生物膜对治疗药物的抵抗力增强导致病原菌在感染
组织持续存在是生物膜感染难以治愈的重要原因。
通过对葡萄球菌引发的急性和慢性奶牛乳房炎的乳
腺组织进行显微观察，表明病原菌聚集成簇的地点
主要位于一些突起和输送乳汁的通道中，这为生物
膜的形成提供了条件［２］。因此以表皮葡萄球菌生物
膜为研究对象，从表皮葡萄球菌生物膜形成的影响
因素出发，研究不同物质对生物膜形成的影响可为
解决表皮葡萄球菌耐药性及治疗生物膜感染性疾病
提供新的思路。
新疆是我国一个重要的中草药产区，其特殊的
“三山夹两盆”的地理特征和明显的温带大陆性气候
特征，蕴育着丰富的中草药资源。而新疆南疆地区
以其独特的帕米尔高原地理位置和气候，生长着一
些特殊而又丰富的中草药资源，且品质优良。其中
５２１　中 国 兽 医 学 报　２０１３年１月　第３３卷　第１期　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｖｅｔ　Ｓｃｉ　Ｊａｎ．２０１３　Ｖｏｌ．３３　Ｎｏ．１　
DOI:10.16303/j.cnki.1005-4545.2013.01.026
甘草、醉马草等最为丰富。为了从生物膜形成角度
防制奶牛乳房炎，本试验以新疆南疆地区的甘草及
醉马草作为研究对象，检测２种中草药水煎液对表
皮葡萄球菌生物膜形成的影响，为充分利用新疆南
疆特色中草药资源、寻找新的防制奶牛乳房炎的策
略奠定理论基础。
１　材料与方法
１．１　主要器材　９６孔板，酶标仪，恒温培养箱，超
净工作台，电磁炉，烘箱，瓷量杯，移液器，粉碎机，纱
布，ｐＨ试纸等。
１．２　主要药品　甘草和醉马草均采自新疆南疆某
市周边地区，甘草为胀果甘草（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ　ｕｒａｌｅｎ－
ｓｉｓ　ｆｉｓｃｈ）；醉马草，又称小花棘豆（Ｏｘｙｔｒｏｐｉｓ　ｇｌａ－
ｂｒａ　ＤＣ．），棘豆属植物。胰蛋白胨大豆肉汤培养基
（ＴＳＢ），双蒸水，结晶紫染色液等。
１．３　菌株　表皮葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉ－
ｄｅｒｍｉｄｉｓ）ＡＴＣＣ　３５９８４（ＢＦ＋，ｉｃａ＋）、ＡＴＣＣ１２２２８
（ＢＦ－，ｉｃａ－）由上海复旦大学医学院惠赠；表皮葡萄
球菌５－６５－１、５－１２５－Ｃ由本实验室从患有隐性乳房炎
奶牛的乳样中分离获得。
１．４　中草药水煎液的制备　参考文献［３］，将所采
集的中草药进行打碎，打成直径约１ｍｍ大小的颗
粒，进行水煎处理，称取１００ｇ粉末至瓷量杯中，并
加入一定量的ｄｄＨ２Ｏ（水浸过药面２～３ｃｍ），浸泡
３０ｍｉｎ，大火煮开，文火熬２０ｍｉｎ，纱布过滤药液，滤
渣再进行同样处理，合并２次药液，１１５℃灭菌１５
ｍｉｎ，４℃保存备用。
１．５　中草药水煎液对菌株生物膜形成的影响　采
用微量板半定量法，采用文献［４］方法并略做改动。
按照１∶１００比例接种对数期生长的菌液至ＴＳＢ液
体培养基中（此时加入不同浓度的中草药水煎液，将
培养液与水煎液混合均匀再上样至９６孔板中），混
匀，再吸取２００μＬ混合液于９６孔板中，每个处理５
孔，同时设不加菌液的中草药药液对照组。每个９６
孔板上均设空白对照、阳性对照和阴性对照组。
３７℃培养２４ｈ，取出后测定菌株生长浊度Ｄ６５５值，吸
出菌液，无菌水洗涤４次，５６℃固定１ｈ，０．５％结晶
紫溶液染色５ｍｉｎ，流水冲去染液，室温晾干后测定
Ｄ４９０值。将所得数据进行处理分析。
２　结果
２．１　甘草水煎液对表皮葡萄球菌生长及其生物膜
形成的影响　随着甘草水煎液浓度的增大，表皮葡
萄球菌 ＡＴＣＣ３５９８４的生长逐渐减弱，说明甘草水
煎液对表皮葡萄球菌的生长有明显抑制作用。与之
相一致的是，菌株生物膜形成能力也呈下降趋势。
当甘草水煎液浓度达到１５％以上时，明显抑制该菌
株的生长，同时生物膜形成能力几近消失（图１）。
甘草水煎液对表皮葡萄球菌临床分离株５－６５－１和
５－１２５－Ｃ的生长及生物膜形成能力也有相同的影
响。在加入１５％浓度的甘草水煎液后，菌株５－６５－１
和５－１２５－Ｃ的生长受到明显抑制，生物膜形成能力
几乎完全消失（图２Ａ、Ｂ）。该试验结果表明，高浓
度的甘草水煎液通过抑制表皮葡萄球菌生长、降低
菌体数量来影响细菌生物膜的形成。
图１　不同浓度甘草水煎液对菌株ＡＴＣＣ３５９８４生长及其生
物膜形成的影响
图２　不同浓度甘草水煎液对表皮葡萄球菌５－６５－１（Ａ）及５－１２５－Ｃ（Ｂ）生长及其生物膜形成的影响
６２１ 　中 国 兽 医 学 报　２０１３年１月　第３３卷　第１期　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｖｅｔ　Ｓｃｉ　Ｊａｎ．２０１３　Ｖｏｌ．３３　Ｎｏ．１　
２．２　醉马草水煎液对表皮葡萄球菌生长及其生物
膜形成的影响　醉马草水煎液在浓度为０％～４０％
范围内对表皮葡萄球菌ＡＴＣＣ３５９８４的生长无明显
影响（图３）。但对菌株生物膜的形成却有明显的抑
制作用。当醉马草水煎液的浓度达到５％以上时，
生物膜的形成几乎被完全抑制（图３）。为了得到醉
马草水煎液抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的最低抑
制浓度（ＭＩＣ），在５％～１０％的范围内确定了７．５％
浓度的醉马草水煎液为抑制菌株生物膜形成的最低
抑制浓度（图４、５）。以确定的 ＭＩＣ值，检测了醉马
草水煎液对临床分离株５－６５－１及５－１２５－Ｃ生物膜形
成的影响，结果表明醉马草水煎液浓度为７．５％时，
其生长不受影响，但生物膜形成却被大大抑制（图
６、７），说明醉马草水煎液在不影响细菌生长的前提
下，能明显抑制细菌生物膜的形成。
图３　０％～４０％醉马草水煎液对表皮葡萄球菌ＡＴＣＣ３５９８４
的生长及其生物膜形成的影响
图４　０％～１０％醉马草水煎液对表皮葡萄球菌ＡＴＣＣ３５９８４
生物膜形成的影响
图５　７．５％醉马草水煎液对表皮葡萄球菌 ＡＴＣＣ３５９８４生
物膜形成的影响
图６　７．５％醉马草水煎液对表皮葡萄球菌５－６５－１生物膜形
成的影响
图７　７．５％醉马草水煎液对表皮葡萄球菌５－１２５－Ｃ生物膜
形成的影响
７２１　中 国 兽 医 学 报　２０１３年１月　第３３卷　第１期　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｖｅｔ　Ｓｃｉ　Ｊａｎ．２０１３　Ｖｏｌ．３３　Ｎｏ．１　
３　讨论
甘草和醉马草是具有新疆特色的中草药。一直
以来，人们对这２种中草药的利用率很低。为了深
入研究这２种特色中草药的活性成分及其功能，本
试验从新疆南疆某地区采集野生甘草及醉马草，研
究二者对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响，取得明
显效果，为下一步有效开发利用甘草和醉马草，奠定
理论基础。
本试验结果表明，低浓度的甘草水煎液对菌株
的生长没有明显影响，同时对表皮葡萄球菌生物膜
的形成也没有明显抑制作用。当甘草水煎液浓度升
高到１５％及以上时，表皮葡萄球菌的生长受到明显
抑制，同时生物膜形成能力大大降低。因此，甘草水
煎液具有抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的作用，且
该作用是通过抑制菌株的正常生长而实现的。甘草
酸和甘草黄酮类物质是甘草中主要活性物质。据报
道，这２种活性物质对球菌和杆菌均有较明显的抑
制作用［５－６］。甘草酸具有水溶性，甘草黄酮的脂溶性
较强，因此本试验所用的甘草水煎液中的活性物质
主要为甘草酸。对表皮葡萄球菌生长的抑制作用也
可能是甘草酸所表现出的抑菌活性所致。另据报
道，甘草酸还能增强机体免疫功能，这可能使它在体
内抗细菌感染中发挥着一定的作用，但具体的抗菌
抑菌机理尚不清楚［７］。
醉马草水煎液对表皮葡萄球菌生物膜形成的影
响与甘草水煎液有本质的区别。在所测定的浓度范
围内（０％～４０％），醉马草水煎液对表皮葡萄球菌的
生长没有明显影响（数据未显示），但对其生物膜形
成能力却有较大影响。当醉马草水煎液浓度达到
７．５％及以上时，生物膜的形成已被完全抑制，这说
明醉马草水煎液中含有的活性物质在不影响表皮葡
萄球菌生长的情况下能抑制菌株生物膜的形成。醉
马草中含有的活性物质———苦马豆素是目前研究较
多的一种生物碱类物质，它属于吲哚里西啶生物碱，
也是一种极强的α－甘露糖苷酶竞争性抑制剂，能够
通过抑制肿瘤细胞表面糖蛋白的表达发挥抑制肿瘤
细胞生长与转移的作用；与此同时还能刺激机体免
疫系统，提高机体免疫机能，促进免疫细胞增生，增
强杀灭肿瘤细胞的能力［８－９］。苦马豆素这种很好的
抗肿瘤活性及免疫增强作用，已引起国内学者的广
泛关注，并将其作为抗肿瘤后备药物进行深入研究。
本试验结果证明，醉马草含有的活性成分也能强烈
抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成，具有抗生物膜感
染的应用潜力，从另一个角度展现出醉马草广阔的
应用前景。
生物膜的形成一般包括２个阶段———初始黏附
阶段和聚集阶段，而多糖是形成生物膜的重要物质。
胞外多糖黏附素由ｉｃａ基因编码，在表皮葡萄球菌
生物膜形成过程中发挥重要作用［１０］。本试验所用
的临床分离株５－６５－１和５－１２５－Ｃ为非ｉｃａ依赖型生
物膜形成菌株［１１］，但也能形成胞外多糖，且通过
ＴＬＣ试验证明醉马草水煎液确实影响这２株菌胞
外多糖的合成（数据未显示）。
在进行上述２种中草药水煎液对奶牛乳房炎来
源的表皮葡萄球菌生物膜影响试验的过程中，考虑
到甘草和醉马草水煎液含有复杂的化学物质，可能
会对培养基的理化性质产生影响，尤其是培养基的
ｐＨ值。在整个试验过程中，加入水煎液的体积最高
可达４０％，会影响菌株生长的ｐＨ值，从而可能造成
菌株生长状况或生物膜形成能力的改变。据此本试
验又检测了不同ｐＨ环境下菌株生长及其生物膜形
成状况（试验结果已另文发表）。结果表明，ｐＨ值在
６．５～７．０之间时，菌液生长及生物膜形成能力均达
到最大值，即表皮葡萄球菌生物膜形成最适ｐＨ 值
为６．５～７．０之间［１２］。当培养基中甘草水煎液体积
达到２０％、醉马草水煎液体积达到４０％时，培养液
最终ｐＨ 值均在６．５～７．０之间，说明加入水煎液
后，培养基的ｐＨ 值没有发生明显变化。此结果更
进一步证明甘草及醉马草水煎液对表皮葡萄球菌生
长及其生物膜形成能力的影响不是通过改变生长环
境的ｐＨ值来实现，而是其植株中含有的某些活性
成分能够抑制菌株的生长或者影响其生物膜形成。
据报道［１２］，碱性条件不利于表皮葡萄球菌生物膜的
形成，即ＯＨ－对菌株生物膜的破坏作用很强，这为我
们抗生物膜感染防制提供了一个新的思路：在治疗
由生物膜阳性菌株引起的各种感染时，尤其是各类
奶牛乳房炎疾病中，可以通过改善病原菌的生存环
境，例如将其生长环境调为略偏碱性，此时生物膜的
形成能力较差，再使用各种药物进行治疗，或许能够
对生物膜形成菌有更好的杀灭能力，同时还能够解
决各种感染反复发作治疗不彻底的问题，为奶牛乳
房炎的治疗提供了新的思路。
参考文献：
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（下转１４９页）
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ｉｎｔｅｒｃｅｌｕｌａｒ　ａｄｈｅｓｉｎ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｂｙ　ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ　ｉｎ　ａ
ｄｅｖｉｃｅ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｍｏｄｅｌ［Ｊ］．Ｉｎｆｅｃｔ　Ｉｍｍｕｎ，
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９４１　中 国 兽 医 学 报　２０１３年１月　第３３卷　第１期　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｖｅｔ　Ｓｃｉ　Ｊａｎ．２０１３　Ｖｏｌ．３３　Ｎｏ．１