全 文 ：书收稿日期:2013-10-08
基金项目:国家自然科学基金资助项目(J1103606) ;辽宁省教育厅一般项目(L2012357)
作者简介:季彬(1990-) ，女(锡伯族) ，辽宁凤城人，本科，E-mail jibin0723@ 162． com;* 通讯作者:郭兴杰(1956-) ，
女(汉族) ，辽宁葫芦岛人，教授，博士，博士生导师，主要从事药物分析研究，Tel． 024-23986285，E-mail syykdx410@
163． com。
文章编号:1006-2858(2014)05-0379-05
HPLC-ＲID法测定腺梗豨莶药材中豨莶精醇等
4 种化合物的含量
季 彬，宋佳新，赵允凤，姜 珍，叶小霞，郭兴杰*
(沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016)
摘要:目的 建立测定腺梗豨莶中豨莶精醇、16β，17-二羟基-贝壳杉烷-19-羧酸、16α 氢-贝壳杉
烷-17，19-二羧酸和 3，4 －二甲氧基槲皮素含量的高效液相色谱示差折光检测方法(HPLC-ＲID)。
方法 以十八烷基硅烷键合相为固定相，流动相为体积分数 0. 3%甲酸溶液-乙腈(体积比 42∶ 55) ，
流速为 1. 0 mL·min －1，示差检测器光学元件温度为 40 ℃，柱温 30 ℃。结果 豨莶精醇的线性范围
为 0. 202 ～ 2. 02 g·L －1，16β，17-二羟基-贝壳杉烷-19-羧酸的线性范围为 0. 510 ～ 5. 10 g·L －1，16α
氢-贝壳杉烷-17，19-二羧酸的线性范围为 0. 298 ～ 2. 98 g·L －1，3，4-二甲氧基槲皮素的线性范围
为 0. 100 ～ 1. 00 g·L －1，4 种化合物线性关系良好(r ＞ 0. 999) ;平均加样回收率在 99. 2% ～ 104. 9%
内;ＲSD 小于 3. 4%。结论 该方法简便、准确、重复性良好，适用于腺梗豨莶中4 种成分的同时测
定。
关键词:腺梗豨莶;含量测定;HPLC-ＲID
中图分类号:Ｒ 917 文献标志码:A
豨莶草为菊科植物豨莶(Siegesbeckia orien-
talis L．)、腺梗豨莶(S． pubescens Makino)和毛梗
豨莶(S． glabrescens Makino)的干燥地上部分［1］。
腺梗豨莶，其茎直立、粗壮，上部多叉状分枝，基部
叶片宽卵形或卵状三角形，也似苍耳［2 － 3］。具有
抗炎、镇痛、抗风湿、舒张血管、抑制血栓形成
等［4 － 7］功效，临床上主要用于治疗风湿麻痹、腰膝
酸软、四肢麻痹、半身不遂、风疹湿疮等症。据目
前的文献报道，测定腺梗豨莶中化合物含量的方
法有 HPLC-UV［8］、HPLC-ESI /TOF-MS［9］、HPLC-
ESLD［10］等方法。本实验室在前期研究中，从腺
梗豨莶中分离得到了 4 种化合物，分别为豨莶精
醇、16β，17-二羟基-贝壳杉烷-19-羧酸、16α 氢-贝
壳杉烷-17，19-二羧酸和 3，4-二甲氧基槲皮素。
由于 4 种化合物紫外吸收很弱，因此本文作者建
立了 HPLC-ＲID 方法测定其含量。HPLC-ＲID 对
所有物质都具有响应且 ＲID 对被测物没有破坏
性，该方法准确、稳定、重复性好，为腺梗豨莶的质
量控制提供了依据。4 种化合物的化学结构式见
图 1。
Fig. 1 Darutigenol (a)，16β，17-dihydroxy-kauran-19-
oic acid(b)，16α H-kauran-17，19-dioic acid(c)and 3，
4-dimethoxy quercetin(d)
图 1 豨莶精醇(a)，16β，17-二羟基-贝壳杉烷-19-羧酸
(b)，16α氢-贝壳杉烷-17，19-二羧酸(c)和 3，4-二甲氧
基槲皮素(d)的化学结构式
1 仪器与材料
LC-10A 高效液相色谱仪、Shodex ＲI-201H
第 31 卷 第 5 期
2 0 1 4 年 5 月
沈 阳 药 科 大 学 学 报
Journal of Shenyang Pharmaceutical University
Vol. 31 No. 5
May 2014 p. 379
DOI:10.14066/j.cnki.cn21-1349/r.2014.05.010
检测器(日本岛津公司) ，N2000 色谱工作站(浙
大智达)。
自制 4 种化合物精制品，并用归一化法测定
含量:豨莶精醇(含量质量分数 ＞ 97. 5%) ，16β，
17-二羟基-贝壳杉烷-19-羧酸(含量质量分数 ＞
98. 9%) ，16α氢-贝壳杉烷-17，19-二羧酸(含量质
量分数 ＞ 99. 0%) ，3，4-二甲氧基槲皮素(含量
质量分数 ＞ 98. 2%)。甲醇、乙腈(色谱纯，天津康
科德科技有限公司)，其他试剂(分析纯，市售)。
两批药材(批号 1 和 2)购自河北省安国振宇
中药饮片有限公司，经沈阳药科大学孙启时教授
鉴定为腺梗豨莶(Siegesbeckia pubescens Makino)。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件
色谱柱:Symmetry Shield TM ＲP18 column
(250 mm ×4. 6 mm，5 μm) ;示差检测器光学元件
温度:40 ℃;流动相:体积分数 0. 3%甲酸溶液-乙
腈(体积比 42∶ 55) ;流速:1. 0 mL·min －1;进样量:
20 μL;柱温:30 ℃。
2. 2 溶液的制备
2. 2. 1 对照溶液
取豨莶精醇、16β，17-二羟基-贝壳杉烷-19-羧
酸、16α氢-贝壳杉烷-17，19-二羧酸和 3，4-二甲
氧基槲皮素精制品适量，精密称定。以甲醇溶解
并定量稀释制成豨莶精醇、16β，17-二羟基-贝壳
杉烷-19-羧酸、16α 氢-贝壳杉烷-17，19-二羧酸和
3，4-二甲氧基槲皮素质量浓度分别为 10. 1、
20. 4、9. 93 和 10. 0 g·L －1的对照储备液。取各化
合物对照储备液适量，置同一 10 mL 量瓶中，用
甲醇稀释至刻度，制成质量浓度分别为 1. 01、
3. 06、0. 496 和 0. 200 g·L －1的混合对照溶液。
2. 2. 2 供试溶液
取过 380 μm 筛的腺梗豨莶干燥粉末约20 g，
精密称定。加甲醇 200 mL，回流提取 3 次，每次
1 h，合并提取液，滤过，滤液在 45 ℃水浴中减压
浓缩至小体积，浓缩液置于 10 mL 量瓶中，用甲
醇稀释至刻度，摇匀，过 0. 45 μm 滤膜，4 ℃储存
待用。
2. 3 系统适用性试验
取供试溶液在“2. 1”条色谱条件下进样，记
录色谱图。待测物的色谱峰与供试品中其他色谱
峰完全分离。理论塔板数以 16α 氢-贝壳杉烷-
17，19-二羧酸峰计算不低于 9 800。对照溶液及
供试溶液色谱图见图 2。
1—Darutigenol;2—16β，17-Dihydroxy-kauran-19-oic acid;3—16α H-Kauran-17，19-dioic acid;4—3，4-Dimethoxy quercetin
Fig. 2 Typical chromatograms of standard solution (A)and sample solution (B)
图 2 对照品(A)和供试品(B)高效液相色谱图
2. 4 线性关系考察
精密吸取豨莶精醇、16β，17-二羟基-贝壳杉
烷-19-羧酸、16α氢-贝壳杉烷-17，19-二羧酸和 3，
4-二甲氧基槲皮素对照储备液 4. 0、5. 0、6. 0 和
2. 0 mL，置同一 20 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻
度，得各化合物质量浓度分别为 2. 0、5. 0、3. 0 和
1. 0 g·L －1的混合对照溶液。精密吸取混合对照
溶液 8. 0、4. 0、2. 0 和 1. 0 mL，分别置于 10 mL 量
瓶中，用甲醇稀释至刻度得系列标准溶液。精密
吸取系列标准溶液与混合对照溶液各 20 μL，注
入液相色谱仪，记录峰面积，以各对照品质量浓度
(ρ)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，进行线性回
归，各化合物的线性方程和相关系数计算结果见
表 1。
083 沈 阳 药 科 大 学 学 报 第 31 卷
Table 1 Linear ranges，linearity equations，correlation coefficients for the 4 compounds of Siegesbeckia pubescens M．
under chromatographic condition
表 1 腺梗豨莶中 4 种化合物的回归方程、线性范围和相关系数
Compound Ｒegression equation ρ(linear range)/(g·L －1) r
Darutigenol A = 95. 0ρ + 2. 63 0. 202 － 2. 02 0. 999 5
16β，17-Dihydroxy-kauran-19-oic acid A = 109. 5ρ + 4. 39 0. 510 － 5. 10 0. 999 8
16α H-Kauran-17，19-dioic acid A = 595. 9ρ + 33. 3 0. 298 － 2. 98 0. 999 4
3，4-Dimethoxy quercetin A = 482. 7ρ + 8. 86 0. 100 － 1. 00 0. 999 1
2. 5 重复性试验
取同一批药材粉末 6 份，精密称定，按
“2. 2. 2”条方法制备供试溶液，在“2. 1”条色谱条
件下测定含量。豨莶精醇、16β，17-二羟基-贝壳
杉烷-19-羧酸、16α 氢-贝壳杉烷-17，19-二羧酸和
3，4-二甲氧基槲皮素含量的 ＲSD 在 1. 7% ～
3. 7%内，表明方法重复性良好。
2. 6 稳定性试验
取“2. 5”条下的供试溶液，4 ℃放置，分别在
0、8、12、24 和 36 h进样测定，记录峰面积，将各时
间点下被测组分峰面积与 0 h 峰面积比较，ＲE 值
在 1. 3% ～3. 8%内，表明供试溶液至少在 36 h内
稳定。
2. 7 回收率试验
取批号 1 的药材粉末(过 380 μm 筛)约
10 g，精密称定。分别加入一定量的豨莶精醇、
16β，17-二羟基-贝壳杉烷-19-羧酸、16α氢-贝壳杉
烷-17，19-二羧酸和 3，4-二甲氧基槲皮素对照储
备液(约相当于 10 g 药材中所含各化合物的量) ，
按“2. 2. 2”条方法制备供试溶液，在“2. 1”条色谱
条件下进样，记录峰面积，计算回收率及 ＲSD 值。
结果见表 2。
Table 2 Ｒecoveries of the compound 1-4 of Siegesbeckia pubescens M． under chromatographic condition(n =6)
表 2 腺梗豨莶中 4 种化合物的回收率结果(n =6)
Compound moriginal /mg madded /mg mfound /mg Ｒecovery /% Average recovery /% ＲSD /%
3. 17 3. 03 6. 43 107. 5
3. 22 3. 03 6. 35 103. 2
Darutigenol
3. 34 3. 03 6. 53 105. 4
104. 9 3. 4
3. 15 3. 03 6. 46 109. 3
3. 20 3. 03 6. 38 105. 0
3. 28 3. 03 6. 28 99. 1
5. 95 6. 12 11. 993 98. 8
6. 05 6. 12 12. 021 97. 6
16β，17-Dihydroxy-kauran-19-oic acid
6. 26 6. 12 12. 239 97. 7
99. 2 1. 9
5. 91 6. 12 12. 103 101. 2
6. 00 6. 12 12. 238 102. 0
6. 15 6. 12 12. 149 98. 0
1. 69 1. 69 3. 462 104. 6
1. 72 1. 69 3. 427 100. 9
16α H-Kauran-17，19-dioic acid
1. 78 1. 69 3. 453 98. 9
102. 5 2. 3
1. 68 1. 69 3. 454 104. 8
1. 71 1. 69 3. 461 103. 7
1. 75 1. 69 3. 474 102. 0
1. 04 1. 00 2. 083 103. 9
1. 06 1. 00 2. 041 98. 0
3，4-Dimethoxy quercetin
1. 10 1. 00 2. 085 98. 7
99. 6 2. 8
1. 04 1. 00 2. 058 102. 1
1. 05 1. 00 2. 037 98. 4
1. 08 1. 00 2. 043 96. 4
183第 5 期 季 彬等:HPLC-ＲID 法测定腺梗豨莶药材中豨莶精醇等 4 种化合物的含量
2. 8 样品含量测定
取批号 1 和批号 2 样品，按“2. 2. 2”条方法
制备供试溶液，在“2. 1”条色谱条件下进样测定，
以外标法计算药材中 4 种组分的含量，结果表 3。
Table 3 The contents (c)of compound 1-4 in Siegesbeckia pubescens Makino under chromatographic condition from
different sources(n =6)
表 3 两批药材粉末中 4 种组分的含量(n =6)
Batch No．
Darutigenol
c /(mg·g －1) ＲSD /%
16β，17-Dihydroxy-kauran-
19-oic acid
c /(mg·g －1) ＲSD /%
16α H-Kauran-17，
19-dioic acid
c /(mg·g －1) ＲSD /%
3，4-Dimethoxy
quercetin
c /(mg·g －1) ＲSD /%
1 0. 322 1. 0 0. 604 1. 5 0. 172 2. 6 0. 106 2. 1
2 0. 462 1. 8 0. 708 1. 3 0. 170 1. 5 0. 094 2. 3
3 讨论
3. 1 流动相的选择
选择乙腈-水作为流动相时，16β，17-二羟基-
贝壳杉烷-19-羧酸和 16α 氢-贝壳杉烷-17，19-二
羧酸色谱峰峰形不好，其原因是这 2 种化合物分
子中含有羧基，在 pH 中性的流动相中部分呈离
子状态。当流动相中添加体积分数 0. 3%甲酸溶
液时，色谱峰形得到改善，4 种化合物与样品中其
他成分达到基线分离。继续增加甲酸浓度，对色
谱峰峰形和分离度均无明显影响，且保留时间增
加，导致分析时间延长。故最终选择体积分数
0. 3%甲酸溶液-乙腈作为流动相。
3. 2 检测方法的选择
除 3，4-二甲氧基槲皮素外，本文研究的4 种
化合物在紫外光区均没有明显的吸收，因此选择
示差折光检测器进行检测。虽然该检测器为通用
型检测器，但灵敏度差是其缺点。此外，该检测器
对温度、流动相组成、流速波动均比较敏感，需要
严格控制温度并且不能使用梯度洗脱。在实验中
设定检测器温度 40 ℃，柱温 30 ℃，使用等度洗脱
分离 4 种化学成分，建立的分析方法准确、精密、
可靠。
参考文献:
［1］国家药典委员会．中华人民共和国药典:一部［M］．
北京:中国医药科技出版社，2010:345．
［2］李时珍．本草纲目(校点本) ［M］．北京:人民卫生出
版社，1995:998．
［3］居明秋，金玲，居明乔．豨莶草品种的考证［J］．中药
材，2000，23(9) :572 － 573．
［4］徐叔云．药理实验方法学［M］． 3 版．北京:人民卫生
出版社，2002:901．
［5］钱瑞琴，张春英，付宏征，等． 豨莶草活性部位抗风
湿作用机理研究［J］． 中国中西医结合杂志，2000，
20(3) :192 － 195．
［6］黄弘轩，李孝先，任国庆，等． 豨莶草的舒血管作用
［J］．白求恩医科大学学报，1979(3) :17 － 19．
［7］ KIM H M． Effect of Siegesbeckia pubescens on imme-
diate hypersensitivity reaction［J］． Am J Chin Med，
1997，25(2) :163．
［8］刘赞，侴桂新，王峥涛．高效液相色谱法测定酒豨莶
草中奇壬醇的含量［J］． 中国中药杂志，2010，35
(6) :729 － 731．
［9］ JIANG Zhen，YU Qing-hong，CHENG Yan，et al．
Simultaneous quantification of eight major constituents
in Herba Siegesbeckiae by liquid chromatography cou-
pled with electrospray ionization time-of-flight tandem
mass spectrometry［J］． Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis，2011(55) :452 － 457．
［10］HUO Li-nan，JIANG Zhen，LI Hui-ning，et al． Simul-
taneous determination of seven major diterpenoids in
Siegesbeckia pubescens Makino by high-performance
liquid chromatography coupled with evaporative light
scattering detection［J］． J Sep Sci，2012，35:2585 －
2591．
283 沈 阳 药 科 大 学 学 报 第 31 卷
Simultaneous determination of four major constitu-
ents in Siegesbeckia pubescens Makino by HPLC-ＲID
JI Bin，SONG Jia-xin，ZHAO Yun-feng，JIANG Zhen，YE Xiao-xia，GUO Xing-jie*
(School of Pharmacy，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China)
Abstract:Objective To establish an HPLC-ＲID method for simultaneous monitoring of four major constitu-
ents in Siegesbeckia pubescens Makino． Methods The separation of four compounds was achieved with a
Waters Symmetry ShieldTM ＲP18 column (250 mm × 4. 6 mm，5 μm)and the mobile phase was 0. 3% for-
mic acid-acetonitrile (V ∶ V = 42∶ 55)． The temperatures of the optical element and column were 40 ℃ and
30 ℃，respectively． The flow rate was 1. 0 mL·min －1 ． Ｒesults This method was linear for all the four com-
pounds with correlation coefficients ＞ 0. 999 0． The calibration curve was constructed using four calibration
samples in the range of 0. 202-2. 02 g·L －1 for darutigenol，0. 510-5. 10 g·L －1 for 16β，17-dihydroxy-kauran-
19-oic acid，0. 298-2. 98 g·L －1 for 16α H-kauran-17，19-dioic acid and 0. 100-1. 00 g·L －1 for 3，4-dime-
thoxy quercetin． Accuracy was validated on the basis of quotient of the averaged measurements and the nom-
inal value and it ranged from 99. 2% to 104. 9% ． The ＲSD were within 3. 4% ． Conclusions The method
which affords simplicity，high accuracy and excellent precision is successfully applied to determine the four
major constituents in Siegesbeckia pubescens Makino simultaneously．
Key words:Siegesbeckia pubescens Makino;content determination;

HPLC-ＲID
(上接第 378 页)
Determination of paeoniflorin and ferulic acid in
Yangxue Qingnao capsule by HPLC
LIU Xiao-kun1，WANG Miao2，WANG Yi1，ZHAO Chun-jie1*
(1． School of Pharmacy，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China;2． School of Life
Science and Biopharmaceutics，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China)
Abstract:Objective To establish a method for simultaneous determination of contents of peoniflorin and
ferulic acid in Yangxue Qingnao capsule (traditional Chinese medicine)． Methods HPLC with Diamonsil
C18 column(250 mm ×4. 6 mm，5 μm)was used，acetonitrile － 0. 085% phosphoric acid (gradient elution)
was selected as a mobile phase． The detection wavelength was set at 240 nm． Flow rate was 1. 0 mL·min －1，
and column temperature was 30 ℃ ． Ｒesults The linear range of peoniflorin was 4. 96-19. 84 mg·L －1(r =
0. 999 6) ，the average recovery was 97. 1% (ＲSD = 1. 9%，n = 6)． The linear range of ferulic acid was
2. 52-10. 08 mg·L －1(r = 0. 999 0) ，the average recovery was 100. 1% (ＲSD = 2. 8%，n = 6)． Conclusions
The method is simple，accurate and reproducible for simultaneous determination of peoniflorin and ferulic
acid． It can be used for the quality control of compound Yangxue Qingnao capsule．
Key words:Yangxue Qingnao capsule;peoniflorin;ferulic acid;HPLC;content determination
383第 5 期 季 彬等:HPLC-ＲID 法测定腺梗豨莶药材中豨莶精醇等 4 种化合物的含量