全 文 ：收稿日期:2015-12-11; 修订日期:2016-04-20
基金项目:甘肃省中药药理与毒理学重点实验室开放课题(No． ZDSYS －
KJ － 2013 － 001);
甘肃省医学科学研究院中青年科技人才创新工程项目(No． ykz
－ 2013 － 3)
作者简介:马趣环(1980-)，女(汉族)，甘肃静宁人，甘肃省医学科学研究
院药物研究所助理研究员，硕士学位，主要从事天然药物研究工作．
* 通讯作者简介:石晓峰(1964-)，男(汉族)，甘肃张掖人，甘肃省医学科
学研究院药物研究所主任药师，学士学位，主要从事天然药物研究工作．
糙叶败酱中总环烯醚萜苷的含量测定
与超声提取工艺研究
马趣环2，石晓峰1，2* ，沈 薇2，范 彬2，王新娣2，刘东彦2
(1．甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730030;
2．甘肃省医学科学研究院药物研究所，甘肃 兰州 730050)
摘要:目的 建立糙叶败酱中总环烯醚萜苷的含量测定方法，并优化确定其超声提取工艺。方法 采用紫外分光光度法，
以莫诺苷为对照品，在波长 240 nm处测定糙叶败酱中总环烯醚萜苷的含量;在单因素试验基础上，通过 3 因素 3 水平的
Box － Behnken中心组合实验设计，对糙叶败酱中总环烯醚萜苷提取工艺的主要影响因素(甲醇浓度、提取时间、液料比)
进行考察并建立相应的数学模型，以总环烯醚萜苷的含量为响应值进行响应面分析(ＲSA)。结果 莫诺苷在 0． 005 ～
0． 035 mg·ml －1(Ｒ2 = 0． 9996)浓度范围内线性关系良好，加样平均回收率和 ＲSD 分别为 101． 14%和 2． 76%(n = 6);
最佳工艺条件为 63%甲醇，液料比 21∶ 1(ml /g)，超声提取 53 min，提取次数为 2 次;在此最佳工艺条件下，总环烯醚萜苷
的含量为 82． 7349 mg·g －1，结果与模型预测值相符。结论 所建立的含量测定方法简便、准确、重复性好，可用于糙叶败
酱中总环烯醚萜苷的含量测定和质量控制，优选得到的最佳工艺条件经验证合理可行。
关键词:糙叶败酱; 总环烯醚萜苷; 含量测定; 提取工艺; 紫外分光光度法; Box － Behnken中心组合设计; 响
应面分析
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2016． 08． 021
中图分类号:Ｒ284． 2 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2016)08-1853-04
糙叶败酱 Patrinia scabra Bunge为败酱科败酱属多年生草本
植物，异名鸡粪草、箭头风、臭罐子等，俗名脚汗草，药用部位为根
与根茎，具有清热解毒、消痈排脓、祛瘀止痛等功效，民间用于治
疗伤寒、温症、跌打损伤、妇女崩中、赤白带下等症［1］;现代研究
证实，糙叶败酱具有抑菌、抗肿瘤、止血、免疫调节及镇静等多种
生理活性，其主要化学成分为挥发油、环烯醚萜及其苷类、黄酮
类、苯丙素类、生物碱类及多糖类等［2］。本实验室曾对糙叶败酱
的化学成分进行了系统研究，从糙叶败酱中分离鉴定出莫诺苷、
白花败酱醇、isopatriscabroside等多种环烯醚萜类成分［3 ～ 5］，而有
关文献报道糙叶败酱环烯醚萜苷元和总环烯醚萜苷元具有较好
的抗癌作用和免疫调节功能［6，7］。本实验采用紫外分光光度计
建立了糙叶败酱中总环烯醚萜苷的含量测定法，并以糙叶败酱总
环烯醚萜苷含量为考察指标，在单因素试验的基础上，采用响应
面设计方法优化糙叶败酱中总环烯醚萜苷超声提取的工艺，希冀
为糙叶败酱中环烯醚萜类成分的开发利用提供参考。
1 材料与仪器
1． 1 材料 糙叶败酱根及根茎于 2006 年采自甘肃省兰州市兴隆
山区，原植物经甘肃省医学科学研究院何福江研究员鉴定为败酱
科败酱属糙叶败酱 Patrinia scabra Bunge，标本存放于甘肃省医学
科学研究院标本室。
莫诺苷(morroniside)对照品(上海士锋生物科技有限公司，
批号:20140419，纯度≥98%);甲醇、乙醇均为分析纯;水为蒸馏
水。
1． 2 仪器与设备 UV － 240 紫外可见分光光度计(日本岛津公
司生产);AE260 万分之一分析天平(瑞士 Mettler Toledo 公司生
产);CP225D型十万分之一电子分析天平(德国 Sartorius 公司);
KQ2200B 超声清洗仪器(昆山市超声仪器有限公司生产)。
2 方法与结果
2． 1 溶液的制备
2． 1． 1 供试品溶液的制备 称取粉碎过筛(40 目)的糙叶败酱药
材粉末 0． 5g，加入甲醇 20 ml，超声(消耗功率:160 W，加热功率:
260 W，频率:59 kHz )提取 2 次，每次 1h，合并滤液，浓缩，用甲醇
定容至 25 ml，然后从中精密吸取 1 ml，再用甲醇定容至 25 mL，
摇匀，3 000 r /min离心 25 min，取上清液作为供试品溶液。
2． 1． 2 对照品溶液的制备 精密称取莫诺苷对照品 20． 1mg，置
于 10 ml 容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得对照品储备液;精
密吸取对照品储备液 0． 5ml 至 10ml 容量瓶中，用甲醇定容，摇
匀，即得浓度为每 ml含莫诺苷 0． 1mg的对照品溶液。
2． 2 标准曲线绘制［8 ～ 10］ 分别精密吸取上述莫诺苷对照品溶液
0． 25，0． 50，0． 75，1． 00，1． 25，1． 50，1． 75ml，分别置具塞试管中，
用甲醇补充体积至 5． 00ml;精密吸取甲醇 5． 00ml作为空白对照，
于 240nm测定吸光度(A)。以浓度(X，mg·mL －1)为横坐标，以
吸光度(Y)为纵坐标，绘制标准曲线。得线性回归方程:Y =
26． 893X + 0． 0035，Ｒ2 = 0． 9996。结果表明，莫诺苷溶液在0． 005
～ 0． 035 mg·ml －1浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系。
2． 3 方法学考察
2． 3． 1 精密度试验 精密吸取莫诺苷对照品溶液 6 份，每份 1． 0
ml，按“2． 2”项下操作方法测定吸光值，求得吸光值的 ＲSD 为
0． 13%(n = 6)，表明该仪器精密度良好。
2． 3． 2 重复性试验 按“2． 1． 1”项下方法制备供试品溶液 6 份，
每份精密吸取 1． 0 ml，按“2． 2”项下方法测定吸光值，计算总环
烯醚萜苷含量，求得其平均含量为 76． 70mg /g，ＲSD 为 2． 36%。
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表明本方法具有较好的重复性。
2． 3． 3 稳定性试验 精密吸取供试品溶液 1． 0ml，按“2． 2”项下
方法测定吸光值，每隔 5min 测定 1 次吸光值，求得其 ＲSD 值为
0． 31%(n = 12)，表明供试品溶液在 1h内稳定。
2． 3． 4 加样回收率试验 精密称取已知含量的糙叶败酱药材粉
末 6 份，分别加入 1． 9ml 浓度为 2． 00mg /ml 对照品溶液，按“2．
1． 1”项下方法制备供试品溶液。按“2． 2”项下方法测定吸收度，
计算加样回收率及 ＲSD。求得平均回收率和 ＲSD 分别为
101． 14%和 2． 76%(n = 6)。结果见表 1。
表 1 回收率试验结果
称样量 /g样品含量 /mg
加入量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均回收率
/%
ＲSD
/%
0． 0509 3． 84 3． 80 7． 55 97． 75
0． 0511 3． 84 3． 80 7． 75 103． 00
0． 0501 3． 84 3． 80 7． 60 99． 00
0． 0518 3． 84 3． 80 7． 78 103． 75 101． 14 2． 76
0． 0506 3． 84 3． 80 7． 62 99． 50
0． 0513 3． 84 3． 80 7． 80 104． 25
2． 4 样品含量测定 准确称取不同批粉碎过筛(40 目)的糙叶败
酱药材粉末 0． 5g，3 份，依“2． 1． 1”项下方法操作制备供试品溶
液，然后精密吸取供试品溶液 1． 0ml，分别按“2． 2”项下方法测定
吸光度，并根据以下公式计算糙叶败酱中总环烯醚萜苷的含量。
结果糙叶败酱中总环烯醚萜苷的平均含量为 76． 55mg /g。结果
见表 2。
总环烯醚萜苷含量(mg /g)=供试品溶液中总环烯醚萜苷质
量(mg)/糙叶败酱粉末质量(g)× 100%
表 2 样品中总环烯醚萜苷的含量测定结果
样品编号
称样量
/ g
含量
/mg·g － 1
平均含量
/mg·g － 1
1 0． 5028 76． 62
2 0． 5107 76． 54 76． 55
3 0． 5033 76． 49
2． 5 单因素试验
2． 5． 1 提取溶剂的选择 准确称取糙叶败酱药材粉末 0． 5g，3
份，分别用乙醇、甲醇、水作为提取溶剂，固定液料比为 15 ∶ 1
(ml /g)、超声提取时间为 60 min、提取次数为 2 次，依“2． 1． 1”项
下方法操作制备供试品溶液。按“2． 2”项下方法测定其吸光值，
计算糙叶败酱中总环烯醚萜苷的含量，结果见图 1。由图可知，
甲醇作为提取溶剂时供试液中总环烯醚萜苷的含量最高，故选取
甲醇作为提取溶剂。
图 1 提取溶剂对总环烯醚萜苷含量的影响
2． 5． 2 甲醇浓度对糙叶败酱中总环烯醚萜苷提取率的影响 准
确称取糙叶败酱粉末 0． 5g ，6 份，选择不同浓度的甲醇(0%、
20%、40%、60%、80%、100%)作为提取溶剂，固定液料比为 15
∶ 1 (ml /g)、超声提取时间为 60 min、提取次数为 2 次，按“2． 1．
1”项下方法操作制备供试品溶液。按“2． 2”项下方法测定其吸
光值，计算糙叶败酱中总环烯醚萜苷的含量，结果见图 2。由图
可知，甲醇浓度在 60 %时供试液中总环烯醚萜苷的含量最高，提
示 60%甲醇可作为提取溶剂。
图 2 甲醇浓度对总环烯醚萜苷含量的影响
2． 5． 3 料液比对糙叶败酱中总环烯醚萜苷的影响 准确称取糙
叶败酱粉末 0． 5g ，5 份，选择不同液料比(5∶ 1、10∶ 1、15∶ 1、20
∶ 1、25∶ 1 ml /g)，固定甲醇浓度为 60%、超声提取时间为 60
min、提取次数为 2 次，按“2． 1． 1”项下方法操作制备供试品溶液。
按“2． 2”项下方法测定其吸光值，计算糙叶败酱中总环烯醚萜苷
的含量，结果见图 3。由图可知，液料比在 20∶ 1 时总环烯醚萜
苷提取率既达到最高，故初步认定液料比为 20 ∶ 1ml /g 比较合
适。
图 3 液料比对总环烯醚萜苷含量的影响
2． 5． 4 提取时间对糙叶败酱中总环烯醚萜苷含量的影响 准确
称取糙叶败酱粉末 0． 5g，6 份，选择不同超声提取时间(20，30，
40，50，60，70min)，固定甲醇浓度为 60%、料液比为 20:1 (ml /
g)、提取次数为 2 次，按“2． 1． 1”项下方法操作制备供试品溶液。
按“2． 2”项下方法测定其吸光值，计算糙叶败酱中总环烯醚萜苷
的提取率，结果见图 4。由图可知，随着提取时间提高总环烯醚
萜苷的含量也在提高，在 50 min 时达到最大值，之后呈下降趋
势，因此选择 50 min最好。
2． 6 Box － Behnken中心组合设计及响应面法优化试验
2． 6． 1 方案设计及试验结果 根据单因素试验得出最佳提取条
件为:甲醇浓度 60 %、液料比 20∶ 1 (ml /g)、超声提取 50 min ，
提取 2 次。在此基础上，固定提取次数，选取甲醇浓度(A)、液料
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比(B)、提取时间(C)为影响因子，应用 Box － Behnken 中心组合
进行 3 因素 3 水平的试验设计，因素及水平编码见表 3，依 Box －
Behnken 试验设计进行试验，以总环烯醚萜苷含量作为响应值进
行响应面分析。结果见表 4。
图 4 提取时间对总环烯醚萜苷含量的影响
表 3 响应面因素水平编码表
因素 代码
编码水平
－1 0 1
甲醇浓度 /% A 40 60 80
液料比 /ml∶ g B 15:1 20:1 25:1
提取时间 /min C 40 50 60
表 4 Box － Behnken 试验设计及试验结果
实验号
甲醇浓度
A
提取时间
B
液料比
C
响应值 Ｒ
/mg·g － 1
1 0 0 0 83． 6733
2 0 0 0 83． 2200
3 0 1 1 79． 4767
4 1 － 1 0 76． 2374
5 － 1 1 0 76． 0377
6 0 1 － 1 77． 6351
7 － 1 0 1 76． 1340
8 0 0 0 83． 4088
9 0 － 1 － 1 76． 8842
10 1 1 0 76． 1262
11 － 1 0 － 1 74． 5508
12 0 0 0 83． 7700
13 1 0 1 80． 1841
14 0 － 1 1 77． 2423
15 － 1 － 1 0 72． 0800
16 1 0 － 1 75． 7930
17 0 0 0 82． 9666
2． 6． 2 模型的建立及显著性检验 利用 Design － Expert 8． 0． 6 软
件对表 4 实验数据进行回归分析，得到总环烯醚萜苷含量(Y)对
甲醇浓度(A)、液料比 (B)、提取时间(C)的二元多项回归模型
为 Y = 83． 41 + 1． 19A + 0． 85B + 1． 02C － 1． 02AB + 0． 70AC +
0． 37BC － 4． 72A2 － 3． 57B2 － 2． 03C2，相关系数 Ｒ2 = 0． 9862，说明
回归方程拟合情况良好，结果可靠。见表 5。
表 5 回归统计分析结果
变异来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性
Model 213． 11 9 23． 72 68． 05 ＜ 0． 0001 ＊＊＊
A 11． 37 1 11． 37 32． 60 0． 0007 ＊＊＊
B 5． 83 1 5． 83 16． 72 0． 0046 ＊＊
C 8． 35 1 8． 35 23． 94 0． 0018 ＊＊
AB 4． 14 1 4． 14 11． 86 0． 0108 *
AC 1． 97 1 1． 97 5． 65 0． 0491 *
BC 0． 55 1 0． 55 1． 58 0． 2495 不显著
A2 93． 64 1 93． 64 268． 39 ＜ 0． 0001 ＊＊＊
B2 53． 71 1 53． 71 153． 96 ＜ 0． 0001 ＊＊＊
C2 17． 29 1 17． 29 49． 56 0． 0002 ＊＊＊
Ｒesidual 2． 44 7 0． 35
Lack of Fit 2． 01 3 0． 27 6． 21 0． 0550 不显著
Pure Error 0． 43 4 0． 11
Cor Total 216． 10 16
模型确定系数 0． 9887 模型的调整确定系数 0． 9742
＊＊＊P ＜0． 001，＊＊P ＜0． 01，* P ＜0． 05
由表 5 方差分析可知，试验所选模型的相关系数 Ｒ2 =
0． 9742，P ＜ 0． 0001，表明模型非常显著，失拟值 P = 0． 0550 ＞ 0．
05，没有显著性意义，说明数据没有异常点。由表可以看出一次
项 A，二次项 A2、B2、C2 对试验结果有极其显著性影响，一次项
B、C交互项有比较显著性影响，AB、AC有显著性影响，表明考察
因素对总环烯醚萜苷含量存在交互综合影响。模型的确定系数
Ｒ2 = 0． 9887，说明该模型的拟合程度较好，可以用此模型对总环
烯醚萜苷提取工艺进行分析和预测。
2． 6． 3 响应面分析 根据回归模型做出相应的响应曲面图和等
高图，考察拟合响应面的形状，分析超声提取各因素对糙叶败酱
总环烯醚萜苷含量的影响。见图 5 ～ 7。
图 5 Ｒ = f(A，B)的等高线和响应面图
等高线的形状可以反映交互作用的强弱，椭圆形表示两因素
交互作用显著，圆形则表示交互作用不显著。由图 5 ～ 7 可以看
出各因素间交互作用显著。由响应曲面图可知，甲醇浓度糙叶败
酱中总环烯醚萜苷含量的提取影响最为显著，表现为曲线较陡。
超声时间和液料比对糙叶败酱中总环烯醚萜苷含量的提取影响
显著，表现为曲线平滑，随其数值的增加或减少，响应值无显著性
变化。
2． 6． 4 验证试验 通过软件 Design － Expert 8． 0． 6 求解方程，得
出最优提取工艺条件:甲醇浓度 62． 70%、液料比 21． 16∶ 1(ml /
g)、超声提取 2 次、每次 52． 86 min。考虑到实验条件的可操作
性，将工艺参数调整为:甲醇浓度 63%、液料比 21∶ 1(ml /g)、超
声提取 2 次、每次 53 min。在此最优提取工艺条件下进行验证实
验，平行实验 3 次，计算得糙叶败酱中总环烯醚萜苷的平均含量
为 82． 7349mg /g，预测值为 83． 6837mg /g，相对误差为 1． 13%，表
明本实验设计工艺条件准确可靠，进一步验证回归模型的合理
性。
3 讨论
本实验采用紫外分光光度法对糙叶败酱中环烯醚萜类化合
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物在 190 ～ 500 nm 内进行全波长扫描，得到莫诺苷和样品的最大
吸收波长均为 240 nm，故本实验采用这个波长对糙叶败酱中总
环烯醚萜苷的含量进行检测。通过方法学考察，所建立的含量测
定方法简便、准确、重复性好，可用于糙叶败酱中总环烯醚萜苷的
含量测定和质量控制。
图 6 Ｒ = f(A，C)的等高线和响应面图
图 7 Ｒ = f(B，C)的等高线和响应面图
Box － Behnken 中心组合实验设计法是响应面设计法的一
种，因该方法使用方便、预测实验结果接近实际实验结果，被广泛
应用于药学实验中［11 ～ 13］。本试验以总环烯醚萜苷的含量为评测
指标，采用响应面设计法对糙叶败酱中总环烯醚萜苷含量的超声
提取工艺条件进行优化，获得最优提取工艺条件:甲醇浓度
63%、液料比 21:1(mL/g)、超声提取 2 次、每次 53 min。在此条
件下糙叶败酱中总环烯醚萜苷的含量为 82． 7349mg /g。其测定
方法简便、准确，优选出的最佳工艺条件经验证试验结果与模型
预测值相符。
环烯醚萜类化合物(Iridoids)是一类特殊的单萜化合物，具
有抗肿瘤、抗炎、保肝、抗氧化、收缩血管、增强免疫、保护神经及
治疗糖尿病及其并发症等诸多生理活性［14］。它也是糙叶败酱的
主要有效成分之一，文献报道［15］，墓头回醋酸乙酯提取物环烯醚
萜酯部位(PHEBB)对 KB、COLO － 205、SGC － 7901 等癌细胞均具
有显著抑制作用，IC50 在 2． 27 ～ 5． 49μg /ml;以 60 mg /kg ip 给予
荷瘤小鼠 PHEBB，对 S180 肉瘤和 H22 肝癌的抑制率分别为
45． 5%和 54． 2%，其抗肿瘤机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡及抑
制肿瘤微血管有关。由此，我们认为糙叶败酱环烯醚萜苷元和总
环烯醚萜苷元具有有进一步研究开发的价值。
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