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南美蟛蜞菊挥发油的抑菌活性及成分分析



全 文 :南美蟛蜞菊挥发油的抑菌活性及成分分析
林碧芬1,黄志坚2
(1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州 350013;2.福建农林大学动物科学学院,福建福州 350002)
摘要:本试验旨在研究南美蟛蜞菊挥发油对畜禽、水产养殖中常见致病细菌的抑菌效果。采用水蒸气蒸馏法提取南美蟛
蜞菊挥发油,研究测定了其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、葡萄球菌、沙门氏菌、耶尔森氏菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌的抑制效
果,并用GC-MS分析了其化学成分。结果表明,南美蟛蜞菊挥发油对7种供试菌种都具有显著的抑制效果,且随着挥发油浓
度的增大,其抑菌活性增强;利用气相-质谱联用法(GC-MS)从南美蟛蜞菊挥发油中鉴定出了48种组分,主要含有庚烷(1,
3,3-三甲基-三环(2,2,1,0(2,6))、3-蒈烯、α-水芹烯、氧化石竹烯和丁香烯等。
关键词:南美蟛蜞菊挥发油;抑菌作用;GC-MS
中图分类号:S816.73   文献标识码:A     文章编号:1671-7236(2011)11-0069-04
  南美蟛蜞菊(Wedelia trilobata(L.)Hitchc.)
为菊科(compositae)蟛蜞菊属(wedelia)植物,又名
三裂蟛蜞菊,多年生草本,原产于热带美洲,具有超
强的繁殖能力,能够通过化感作用抑制其它植物的
生长而发展成单优种群,已被列为“世界上最有害的
100种外来入侵物种”之一(武美兰等,2008)。20世
纪70年代作为绿化地被植物引进中国,由于其极强
的入侵性,目前已成为华南地区危害性严重的杂草。
研究结果表明,南美蟛蜞菊具有保肝、抗菌、抗癌抗
肿瘤和杀虫等功效,其主要化学成分为萜类化合物
(Bohlmann等,1981;Huang等,2003)。近年来,抗生
素的不合理使用导致了肠道菌群失衡、毒副作用、耐
药性及其传递转移等负效应,这迫使人们探索与研制
安全、有效的饲料抗生素替代品。已有研究结果证
明,精油(essential oil)的活性成分具有较强的表面活
性和脂溶性,能迅速穿透病原微生物的细胞膜,使其
内容物流失,并能有效阻止线粒体内的呼吸氧化过
程,使病原微生物丧失能量供应而死亡。目前,精油
收稿日期:2011-04-13
作者简介:林碧芬(1984-),女,福建人,硕士生,研究方向:动物
营养添加剂。
通信作者:黄志坚(1963-),男,福建人,教授,研究方向:临床兽
医学,动物保健品。E-mail:huangzj1999@sina.com
已作为饲料添加剂被应用于畜牧生产中,围绕各种
精油进行的试验成为当前饲料添加剂研究的热点之
一(Hayashi等,2007;Chen等,2008);但是有关南
美蟛蜞菊挥发油作为抗生素替代品应用于饲料中的
研究较少。本研究以7种病原菌为对象,研究了南
美蟛蜞菊挥发油的抑菌效果,同时利用 GC-MS技
术分析了挥发油的化学成分,为南美蟛蜞菊挥发油
作为饲料添加剂的开发利用提供了理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
1.1.1 原材料 南美蟛蜞菊地上部分于2009年9
月采自福州福建农林大学。
1.1.2 供试菌种 大肠杆菌(Escherichia coli)、金
黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus osenbach)、
葡萄球菌(Staphylococcus)、耶尔森氏菌(Yersinia
enteric olitica)、鳗弧菌(V.anguillarum)、嗜水气
单胞菌(Aeromonas hydrophila)、沙门氏菌(Sal-
monella)购于中国药品生物制品鉴定所。
1.1.3 主要试验设备和药品 挥发油水蒸气提取
装置,正茂玻璃仪器厂;5973N/5973I型气相色谱—
质谱联用仪,美国安捷伦公司;LRH-150生化培养
箱,上海一恒科技有限公司;SW-CJ-2FD型双人单
面净化工作台(洁净度100级),
櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅
苏州净化设备有限
molar ratio method,respectively.That al the phase solubility diagrams showed a typical AL-type in various temperature
aqueous solutions,suggested the formation of a inclusion complex of 1∶1molar ratio.The change in the thermodynamic
parameters suggested that the inclusion could proceed spontaneously along with the release of heat and the increase of entropy.
An 1∶1molar ratio inclusion complex of TMP with HP-β-CD could be formed spontaneously and the solubility of TMP in
aqueous solution increased.Appropriate temperature probably favor the progress of inclusion procedure.
Key words:Trimethoprim;Hydroxypropyl-β-cyclodextrin;inclusion constant;inclusion molar ratio;thermodynamic
parameters
·96·中国畜牧兽医  2011年第38卷第11期 生理生化
公司;LDZX-30KBS型立式压力蒸气灭菌器,上海
申安医疗器械厂;TGL-16G台式高速冷冻离心机,
上海安亭科技仪器厂;JEM--1010型透射电电子显
微镜,日本电子株式会社。乙醚、95%乙醇、氯化钠、
硫酸钠等,以上药品均为分析纯。
1.1.4 培养基配制 肉汤培养基:肉汤培养基
1.1g,50mL蒸馏水,121℃灭菌30min备用;琼脂
培养基:琼脂培养基4.5g,100mL蒸馏水,121℃
灭菌30min备用。
1.2 试验方法
1.2.1 南美蟛蜞菊挥发油的提取 准确称取
2000.0g新鲜南美蟛蜞菊地上部分,切成1~2cm
碎片,置于挥发油水蒸气提取装置中,按水蒸气蒸馏
法进行蒸馏4h,收集挥发油,经 NaCl饱和后用乙
醚萃取3次,萃取液用无水硫酸钠干燥过夜,蒸馏回
收乙醚后冷藏备用。
1.2.2 气相/质谱联用仪及测定条件 气相色谱条
件:色谱柱为美国安捷伦公司19091S-433HP-5MS
交联石英毛细管柱(0.25mm ×30m ×0.25μm);
柱初温60℃,保持2min,以10℃/min升温速率
升至250℃,保持10min;气化室温度为250℃,
GC-MS接口温度为230℃;载气为高纯 He气体,
柱流量1.0mL/min;进样量1.0μL。质谱条件:电
离方式EI,电子能量70eV,离子源温度230℃,质
量扫描范围29~500amu。
1.2.3 抑菌活性的测定 取南美蟛蜞菊挥发油,用
95%乙醇溶解稀释成含挥发油50mg/mL的药液,
抑菌原液样品,滤菌备用。将直径为6mm的圆滤
纸片经高压灭菌后在50mg/mL的挥发油药液中
浸渍10min备用。将浓度为l05 CFU/mL的各试
验菌悬液0.2mL在相应的固体培养基上均匀涂
布,制成含菌平板。取浸渍过的滤纸片贴于不同的
含菌平皿上,用稀释10-4倍的庆大霉素作阳性对
照,用95%乙醇作阴性对照,将各培养皿置于37℃
生化培养箱中培养24h后。精确量取抑菌圈直径,
结果取4次重复试验的平均值。将南美蟛蜞菊挥发
油加入到2mL 1.0×l05 CFU/mL各试验菌悬液
中,使挥发油最终稀释浓度为70、60、50、40、30mg/
mL,同时设细菌对照组和空白对照组,置于37℃生
化培养箱中培养24h后观察结果,以无菌生长的最
低浓度作为该供试菌种的最小抑菌浓度。
从 MIC试验无菌生长的试管中吸取0.05mL
液体加入到0.15mL肉汤培养基中混和均匀(通过
稀释法解除残留药物的抑菌作用),吸取0.1mL到
固体培养基中涂布均匀。将培养皿正面向上放入
37℃生化培养箱中培养约0.5h后,待表面干燥将
培养皿倒扣继续培养至24h,以完全无菌生长的最
低浓度作为该供试菌种的最低杀菌浓度。
2 结果与分析
2.1 南美蟛蜞菊挥发油的抑菌活性 由表1可知,
南美蟛蜞菊挥发油对7种供试细菌都有较好的抑制
作用,特别是对嗜水气单胞菌,表现出良好的广谱抗
菌作用,参照刘洋等(2009)方法,测得南美蟛蜞菊挥
发油对供试菌种的 MIC都介于7.81~250g/L,为
中度敏感。
表1 南美蟛蜞菊挥发油对7种供试菌的抑菌圈和 MIC、MBC
菌种
抑菌圈直径(mm)
南美蟛蜞菊挥发油
对照
稀释10-4倍庆大霉素 95%乙醇
MIC值(mg/mL) MBC值(mg/mL)
大肠杆菌 14.3  18  6  50  70
沙门氏菌 14.3  17.5  6  40  60
金黄色葡萄球菌 13.3  17.75  6  50  60
葡萄球菌 12.8  17.5  6  50  60
嗜水气单胞菌 15.5  18.5  6  50  60
鳗弧菌 12.8  17.25  6  50  70
耶尔森氏菌 12.3  20.5  6  40  50
2.2 南美蟛蜞菊挥发油成分分析 由表2可知,通
过GC-MS对南美蟛蜞菊挥发油的化学成分进行分
析,共分离出50个峰,利用色谱峰面积归一法测得
各组分的相对含量,所得质谱图经 NIST05质谱数
据库检索,结合参考有关质谱图文献,从中鉴定出
48种成分,占挥发油总量的92.12%。
南美蟛蜞菊挥发油中含量大于1%的化学成分
有14种,主要有1,3,3-三甲基-三环(2,2,1,0(2,
6))庚烷(21.35%)、3-蒈烯(20.89%)、α-水芹烯
(10.85%)、(S-(E,E))-1-甲基-5-次甲基-8-(1-甲基
乙基)-1,6-环癸二烯(4.47%)、(-)-匙叶桉油烯醇
(3.47%)等。
·07· 生理生化 中国畜牧兽医  2011年第38卷第11期
表2 南美蟛蜞菊挥发油化学成分及相对百分含量
序号 保留时间(min)  化合物名称 相对百分含量(%) 符合度(%)
1  5.07  2-甲基-5-(1-甲基乙基)-双环(3,1,0)已-2-烯 0.25  91
2  5.33  3-蒈烯 17.21  89
3  5.51 莰烯 0.23  97
4  5.86  4-甲基-1-(1-甲基乙基)-双环(3,1,0)已-2-烯 1.24  87
5  5.98  3-蒈烯 2.64  83
6  6.09 β-月桂烯 1.85  90
7  6.49 α-水芹烯 10.85  53
8  6.91  1,3,3-三甲基-三环(2,2,1,0(2,6))庚烷 21.35  64
9  7.04 (z)-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯 0.44  97
10  9.43  8-松油烯醇 0.20  91
11  9.88  2-甲氧基-4-甲基-1-(1-甲基乙基)-苯 0.20  92
12 10.20  4,5-二氢-甲基-1-丙基-1H-吡唑 0.84  38
13  11.26  2-乙酰环戊酮 0.31  53
14  11.32  1-丁酰基-2-环已烯-1-醇 0.46  38
15  12.06 α-荜澄茄烯 0.28  98
16  12.19 (1S(1α,3aα,3bβ,6aβ,6bα))-十氢-3a-甲基-6-次甲基-1-(1-甲基乙基)-环丁基(1,2:
3,4)二环戊烯
0.26  91
17  12.22 (1S-(1α,2β,4β))-1-乙醚基-1-甲基-2,4-双-(1-甲基醚)-环己烷 0.32  81
18  12.28 顺-3-甲基戊烯-3-烯-5-醇 0.33  27
19  12.58  4-(3-甲基丁基)-1,3-环戊二酮 0.24  43
20  12.70 丁香烯 2.93  99
21  13.17 Z,Z,Z-1,5,9,9-四甲基-1,4,7-Cycloundecatriene  2.67  83
22  13.35  2-异丙烯基-4a,8-二甲基-1,2,3,4,4a,5,6,7-octahydronaphthalene  0.70  93
23  13.50 (S-(E,E))-1-甲基-5-次甲基-8-(1-甲基乙基)-1,6-环癸二烯 4.47  87
24  13.54  2-异丙基-5-甲基-9-次甲基-二环(4,4,0)dec–1-烯 0.26  90
25  13.59 (1aR-(1aα,4aα,7α,7aβ,7bα))-十氢-1,1,7-三甲基-4-次甲基-1H-环丙基(E)甘菊环烃 0.40  99
26  13.67 γ-榄香烯 2.73  80
27  13.89 (1S-顺)-1,2,3,5,6,8a-六氢-4,7-二甲基-1-(1-甲基乙基)-萘 1.42  97
28  14.35 (E)-3,7,11-三甲基-1,6,10-十二碳三烯-3-醇 0.45  91
29  14.58 小蠹二烯醇 0.23  90
30  14.69 (-)-匙叶桉油烯醇 3.47  93
31  14.76 氧化石竹烯 1.23  70
32  14.86 愈创(木)醇 0.33  99
33  14.99 别香橙烯氧化物 0.20  91
34  5.08  3,5-二甲基环戊烯-1-烯-4-甲醛 0.78  64
35  15.25 (1α,4aα,8aα)-1,2,3,4,4a,5,6,8a-八氢-7甲基-4-次甲基-1-(1-甲基乙基)-萘 2.51  38
36  15.30 (3aR-(3aα,4β,7α))-2,4,5,6,7,8-六氢-1,4,9,9-四甲基-3H-3a,7-甲基奥 0.25  90
37  15.40 (1aR-(1aα,7α,7aα,7b))-1a,2,3,5,6,7,7a,7b-八氢-1,1,7,7a-四甲基-1H-环丙基(a)-萘 1.25  70
38  15.56 (1α,4aα,8aα)-1,2,3,4,4a,5,6,8a-八氢-7-甲基-4-亚甲基-1-(1-甲基乙基)-萘 0.83  70
39  15.63  1R,4S,7S,11R-2,2,4,8-Tetramethyltricyclo-5.3.1.0(4,11))-十一烷-8-烯 0.39  84
40  15.73  2-(1-Hydroxycycloheptyl)-呋喃妥因 0.34  46
41  15.80  5α-羟基-4α,8,10,11-tetramethyltricyclo-(6.3.0.0(2,4))-十一烷-10-烯 0.22  38
42  15.91  1,7-二甲基-4-(1-甲基乙基)-螺-(4.5)-dec-6-烯-8-酮 0.32  41
43  16.05  4,4,6-三甲基-环已胺-2-烯-1-醇 0.52  27
44  17.34 Longifolenaldehyde  0.45  76
45  19.23 雄甾-2,16-二烯 0.23  64
46  21.10 叶绿醇 0.33  83
47  21.86 (1R-(1R*,3E,7E,11R*,12R*)-4,8,12,15,15-五甲基-双环(9.3.1)十五环-3,7-
二烯-12-醇
0.30  30
48  22.28 (4α)-Kaura-9(11),16-二烯-18-oic acid  0.91  97
49  23.47 (5α)-Pregnan-20-酮 0.21  44
50  23.83 (5.alpha.)-)茂基-(二甲氨基)-苄基-o-庚基-镍 0.25  64
·17·中国畜牧兽医  2011年第38卷第11期 生理生化
3 讨论
本研究从南美蟛蜞菊挥发油中分离鉴定出48
个组分,但是与已分析的采自潮州的南美蟛蜞菊叶
挥发油在化合物组成和含量上有一定差异,不同的
分析结果可能与植株分析部位、样品产地、GC-MS
分析方法等不同有关(杨东娟等,2010)。萜类化合
物是本研究和相关研究中南美蟛蜞菊挥发油的主要
组分。研究报道,挥发性萜类是重要的化感物质,也
具有杀菌消毒功效,如氧化石竹烯、薁类等,这可能
是南美蟛蜞菊挥发油对7种供试细菌都有良好的抗
菌作用的原因。南美蟛蜞菊挥发油不仅对常见的畜
禽病原菌如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、
耶尔森氏菌具有良好的抑制效果,且对水产中常见
的鳗弧菌、嗜水气单胞菌也有较强的抑制作用。虽
然与抗生素相比,南美蟛蜞菊挥发油的抑菌效果较
差,但是抗生素添加剂在畜牧水产业生产中的滥用
造成的药物残留不仅严重影响到畜产品的质量,且
导致多重耐药与交叉耐药性,更严重威胁着人类的
健康。而植物本身所具有的低毒、低残留、低耐药性
等特性是抗生素所不具备的。因此,研究开发南美
蟛蜞菊挥发油作为饲料添加剂具有一定的生产意
义,但是其具体抗菌成分和抗菌机制尚未明确,需要
进一步深入研究。
参 考 文 献
1 刘洋,崔琳,赵志慧,等.50种中草药提取物对猪链球菌的体外抑
菌试验[J].东北农业大学学报,2009,40(7):90~93.
2 杨东娟,郭守军,陈远平,等.南美蟛蜞菊叶挥发油化学成分分析
[J].西北林学院学报,2010,25(1):131~134.
3 武美兰,张德志.入侵植物南美蟛蜞菊研究进展[J].今日药学,
2008,18(6):21~23.
4 Baczynskikm P,Pedersen L D.Phytochemical composition of
Wedelia trilobata(kaisnipata)[C].San Diego,CA,United
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5 Bohlmann F,Zsiesche J,Robert M K,et al.Eudesmanolides and
diterpenes fromWedelia trilobata and an ent-kaurenic acid derivative
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rilolactone A and B in Wedelia trilobata by macroporous resin
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cea)against Leishmania (Viannia)braziliensis[J].Biomedica
revista del Instituto Nacional de Salud,2006,26(1):180~187.
Antimicrobial Activity and Chemical Composition of Essential Oil from
Wedelia trilobata(L.)Hitchc
LIN Bi-fen1,HUANG Zhi-jian2
(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350013,China;
2.Colege of Animal Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)
Abstract:The experiment was conducted to study the antimicrobial activity of essential oil from Wedelia trilobata(L.)
Hitchc.to the common pathogenic bacterias on livestock and aquaculture.The essential oil was extracted from Wedelia
trilobata(L.)Hitchc.by steam distilation,and then its antimicrobial activity and chemical composition were assayed.The
results showed the essential oil of Wedelia trilobata(L.)Hitchc.had significant inhibitory effect on 7kinds of bacteria tested,
and when the concentration of the essential oil was higher,the antibacterial activity was enhanced.Forty-eight ingredients were
identified from Wedelia trilobata(L.)Hitchc.by GC-MS,the maor components were Tricyclo[2,2,1,0(2,6)]heptane,1,3,3-
trimethyl-3-Carene,alpha.-Phlandrene,Caryophylene oxide,etc.
Key words:the essential oil of Wedelia trilobata(L.)Hitchc.;antimicrobial activity;
櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅






櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅







殯殯

GC-MS
书 讯
  2010、2009、2008年合订本(每册128元),并有少量2004、2005年合订本(每册70元),1999、2000、
2001、2002、2003年合订本(每册40元)。如有订购者,请汇款到:100193中国农业科学院北京畜牧兽医
研究所 《中国畜牧兽医》编辑部收。
·27· 生理生化 中国畜牧兽医  2011年第38卷第11期