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蒙古口蘑菌丝体凝集素性质初步研究



全 文 :2014年 1月 内蒙古大学学报(自然科学版) Jan. 2014
第45卷第1期 Journal of Inner Mongolia University(Natural Science Edition) Vol.45 No.1
  文章编号:1000-1638(2014)01-0038-05    DOI:10.13484/j.nmgdxxbzk.20140107
蒙古口蘑菌丝体凝集素性质初步研究

孟建宇1,杨 燕1,刘佳杰1,郝建华2
(1.内蒙古农业大学生命科学学院,呼和浩特010018;
2.中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东青岛266071)
摘要:通过液体摇瓶培养蒙古口蘑菌丝体,用磷酸盐缓冲液浸提,得到菌丝体的凝集素粗提
物.分析表明:蒙古口蘑菌丝体凝集素对牛血和羊血都能凝集;D-果糖、β-葡萄糖、半乳糖和
木糖对菌丝体凝集素均具有抑制作用;弱酸或弱碱性浸提液有利于凝集素的提取;菌丝体凝集
素具有一定的热稳定性,直到60℃以后凝集红细胞的活力才丧失;其凝集活性对Ca2+、Mg2+、
Mn2+和Fe3+这四种离子有不同程度的依赖.
关键词:蒙古口蘑;菌丝体;凝集素;糖抑制;稳定性
中图分类号:Q935  文献标志码:A
  真菌凝集素是食用菌中重要的药理成分,目前已成为继蘑菇多糖之外的另一活性物质而被加以
研究.食用菌凝集素有的只在子实体内分布,而有的则在发酵菌丝体和子实体中都有分布,且不同菌
种来源的凝集素其结构组成、分子量、对糖和血细胞的专一性、等电点等物化性质都会有所差异[1].当
今,真菌凝集素仍以子实体和菌丝提取居多,其中菌丝提取比例有所增加,成为真菌凝集素提取的一
大趋势.Wang等[2]推测,大型真菌凝集素在菌丝发育和形态建成中起重要作用.全世界已经纯化的
凝集素约有100多种,而在具有商业价值的60多种凝集素中只有1种是由真菌(双孢蘑菇)分离
的[3],因此真菌凝集素还具有广阔的开发前景.大型真菌凝集素已经应用于胚胎学、分类学、细菌学研
究以及癌症形成、膜和血清复合糖质的分离、细胞分化和突变肿瘤细胞的鉴别.
蒙古口蘑(Tricholoma mongolicumImai)是我国北方草原出产的名贵野生食药兼用菌.现代医
学研究表明,蒙古口蘑具有增强免疫、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、降低血糖、抗溃疡、抗衰老、抗辐射等多
方面的生物活性和生理功能[2].但目前还没有驯化栽培成功,是一种稀缺资源.由于菌丝体可大量培
养,可在实验室条件下标准化生产,品质可控,所以可以通过大量培养蒙古口蘑菌丝体来替代难以获
得的子实体用于研究和应用.对蒙古口蘑菌丝体凝集素的性质进行测试与分析,可为进一步开发蒙古
口蘑提供基础资料.
1 材料与方法
1.1 主要材料
蒙古口蘑(Tr-12)采自锡林浩特市,新鲜血液(牛血、羊血)由呼和浩特市屠宰场提供.
1.2 主要试剂及仪器
1.2.1 磷酸盐缓冲液(PBS):将 NaCl(80g)、KCl(2g)、Na2HPO4(11.5g)和 KH2PO4(2g)混合,调
pH值为7.4,定容至1000mL,用时稀释10倍.
* 收稿日期:2013-04-27;修回日期:2013-10-08
基金项目:内蒙古自治区自然科学基金资助项目(2010BS0506)
作者简介:孟建宇(1977-),男,内蒙古乌兰察布人,讲师,硕士.E-mail:meng_jianyu@imau.edu.cn.
1.2.2 主要仪器:研钵,96孔微量V型血凝板(姜堰市荣飞器械厂),TDL-40B高速离心机(上海安
亭科学仪器厂),SP-01生物化学培养箱(湖北省黄石市恒丰医疗器械有限公司),HZS-H水浴振荡
器(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司).
1.3 2%红细胞悬液的制备
取牛血和羊血各100mL,加入抗凝剂(EDTA 0.1g),用0.9%的生理盐水反复洗涤5次,每次
2000r/min离心5min,去上清,按红细胞压积用生理盐水配成2%的红细胞悬液备用.
1.4 蒙古口蘑菌丝体的培养
将蒙古口蘑(Tr-12)菌种接种到PDA固体培养基上,27℃恒温培养7天.用无菌水洗下孢子,
将孢子悬浮液转入PDA液体培养基中,置恒温摇床(110r/min,27℃)上培养3~5天.将长好的菌丝
过滤之后用蒸馏水反复冲洗,使培养基组分和孢子去净.最后将处理好的菌丝自然晾干并置-20℃下
保存备用.
1.5 蒙古口蘑菌丝体凝集素的抽提
将晾干的菌丝体研碎至粉末后按20mL PBS/g比例加入PBS工作液,置4℃冰箱中48h.再将其
用3层纱布挤压过滤,将滤液离心(4000r/min)2.5min,取上清,即得凝集素粗提液.
1.6 血凝活性测定[4]
在96孔V型血凝板上用40μL凝集素溶液与等量的生理盐水系列倍比稀释,即:各孔中分别加
入40μL 10mmol/L的NaCl溶液,在第1排孔加40μL菌丝体凝集素粗提液混匀,即为2
0;将第1排
孔内稀释为20 的液体取40μL,加入第2排孔内混匀,即为2
1;以此类推,直到倍比稀释至26;第8排
孔内不加样品,只滴加40μLNaCl溶液做空白对照.稀释完毕后,每孔内边振荡边加入等体积(40μL)
2%红细胞悬液,振荡1min,将V型板室温静置1~1.5h后观察结果,判断凝集活性.如果凝集孔中红
细胞呈膜状,血球相互集聚形成一片网络,用牙签可以挑起即为有凝集活性;如果凝集素无凝集现象,
则红细胞沉淀于“V”型孔底部,呈一红色清晰圆斑.红细胞形成薄层凝集,均匀分布整个孔底(强凝集
的边缘可出现皱缩),判断为全凝集,记“++++”.孔内凝集范围大于孔面积的一半、未遍及全孔的,
判断为多半凝集,记为“+++”.红细胞少许沉淀于中部,周围有浑浊带、约占孔面积的50%,外周液
澄清者,判断为半凝集,记为“++”.红细胞大部分沉积于孔中心,凝集点边缘模糊者,判为少许凝集,
记为“+”.若凝集素无凝集现象则红细胞将沉积在V型孔底部形成清晰的小红点状,记为“-”.凝集
效价的计算以“26”为终点,血凝活力以凝集素的最大稀释倍数2n表示.
1.7 糖抑制实验
先将40μL 0.9% NaCl溶液加入96孔血凝板各孔中后,在1号孔中加入40μL蒙古口蘑菌丝体
凝集素粗提液,然后将凝集素做系列倍比稀释至第7号孔.第8号孔以 NaCl溶液为对照.将40μL
0.15mol/L的D-果糖、β-葡萄糖、D-半乳糖和木糖溶液分别加入不同浓度的凝集素混合液中,静
置30min后,再分别加入40μL 2%牛血和羊血细胞悬液,静置1h后观察凝血效果.
1.8 温度对凝集活力的影响
用0.9%生理盐水将凝集素样品配置成浓度为1000μg/mL的溶液.将150μL该溶液加入容积为
1.5mL的小管中,恒温水浴锅中(40~80℃)保温处理5min,取出冷却至室温后,在96孔血凝板上检
测其活性.同时与室温样品做对照.
1.9 酸碱性抽提缓冲液对凝集活力的影响
将0.1g菌丝体粉末分别加入2mL 0.05mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液(pH3.0)、醋酸钠缓冲液
(pH5.0)、磷酸缓冲液(pH7.4)、Tris-HCl缓冲液(pH8.0)和甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH10.0),
置冰箱中抽提48h后过滤,4000r/min离心10min,取上清液,即得三种不同pH值缓冲液抽提的凝集
素抽提液.分别在96孔V型血凝板每排的第1~8孔加入与各凝集素抽提液相同的缓冲液各40μL,
每排第1孔加入各由不同pH值缓冲液抽提的凝集素抽提液40μL,依次进行倍比稀释,第8孔为空
白对照.然后加入血样40μL静置1h后观察血凝活性.
93第1期 孟建宇 等 蒙古口蘑菌丝体凝集素性质初步研究
1.10 金属离子对凝集活力的影响
分别取10mmol/L CaCl2、MgCl2、FeCl3 和 MnCl2 溶液40μL,在血凝板上对生理盐水进行倍比
稀释后,每孔加入经20mmol/L EDTANa2 处理过的凝集素40μL振挡摇匀后,分别加入40μL 2%红
细胞悬液,室温放置2h.对照组为未经EDTANa2 处理的凝集素以及经EDTANa2 处理但不加金属
离子的凝集素两组.
2 结果与分析
2.1 蒙古口蘑菌丝体凝集素血凝活性
从表1可以看出,蒙古口蘑菌丝体凝集素对牛血的凝集素效价为23,对羊血的凝集素效价为24,
对羊血的凝集作用略强于牛血.
表1 蒙古口蘑菌丝体凝集素血凝活性
Table 1 Agglutination of lectin from mycelia of Tricholoma mongolicum
凝集素效价 20 21  22  23  24  25  26
牛血组 ++++ ++ + + - - -
羊血组 ++++ +++ ++ + + - -
2.2 蒙古口蘑菌丝体凝集素的糖抑制试验
表2可见,四种糖对蒙古口蘑菌丝体凝集素的血凝活性都有抑制作用,是蒙古口蘑菌丝体凝集素
的糖抑制剂,其中D-果糖与凝集素结合抑制凝血的程度尤为明显.
表2 蒙古口蘑菌丝体凝集素的糖抑制结果
Table 2 Sugar inhibition of lectin from mycelia of Tricholoma mongolicum
凝集素效价 未加糖 β-葡萄糖 D-果糖 半乳糖 木糖
20
21
22
23
24
25
26
空白
牛血 羊血
++++ ++++
++ +++
+  ++
-  +
-  -
-  -
-  -
-  -
牛血 羊血
+++ +++
+  ++
-  +
-  -
-  -
-  -
-  -
-  -
牛血 羊血
++ ++
-  +
-  -
-  -
-  -
-  -
-  -
-  -
牛血 羊血
+++ +++
- ++
-  +
-  -
-  -
-  -
-  -
-  -
牛血 羊血
+++ +++
+  ++
-  +
-  -
-  -
-  -
-  -
-  -
2.3 蒙古口蘑菌丝体凝集素的热稳定性
热稳定实验(表3)显示,蒙古口蘑菌丝体凝集素的血凝活性在室温至40℃时均能保持稳定,表明
这时温度变化并没有影响其活性基团.当温度上升到50℃时,菌丝体凝集素丧失了部分活性,在50~
60℃之间,菌丝体凝集素活性大部分丧失,到60℃时表现出微弱的凝集现象,直到失去活性.蒙古口
蘑菌丝体凝集素是高温条件下较稳定的凝集素.
表3 温度对蒙古口蘑菌丝体凝集素凝集活性的影响
Table 3 Effects of temperature on activity of lectin from mycelia of Tricholoma mongolicum
温度/℃ 室温 40  50  60  70  80
凝集程度 ++++ +++ ++ +/- - -
2.4 不同pH值的抽提缓冲液对凝集活性的影响
对不同pH值的浸提液抽提的凝集素的凝集活性进行对比,结果(表4)显示,蒙古口蘑菌丝体凝
集素在pH3.0-7.4之间凝集活性较高,pH5.0时凝集活性最高.在pH3.0时,活性仍然很高,可见,
蒙古口蘑菌丝体凝集素有很强的耐酸性.在pH10.0时,凝集活性大部分丧失,耐碱性不强.弱酸或弱
04 内蒙古大学学报(自然科学版) 2014年
碱性条件有利于蒙古口蘑菌丝体凝集素的提取.
表4 抽提缓冲液pH值对蒙古口蘑菌丝体凝集素凝集活性的影响
Table 4 Effects of extraction buffer pH on activity of lectin from mycelia of Tricholoma mongolicum
凝集素效价 pH3.0 pH5.0 pH7.4 pH8.0 pH10.0
20
21
22
23
24
25
26
空白
牛血羊血
+++ ++++
++ +++
+  ++
-  +
-  +/-
-  -
-  -
-  -
牛血羊血
++++ ++++
+++ +++
++  ++
+  +
-  +
-  -
-  -
-  -
牛血羊血
+++ +++
+  ++
+  +
-  +
-  -
-  -
-  -
-  -
牛血羊血
++++ ++++
++ ++
-  +
-  -
-  -
-  -
-  -
-  -
牛血羊血
+++ +++
+  ++
-  -
-  -
-  -
-  -
-  -
-  -
2.5 金属离子对凝集活性的影响
金属离子是蒙古口蘑菌丝体凝集素凝集活性的必需因子.对比试验(表5)发现,处理后的凝集素
凝集活性丧失;加入金属离子后,对活性有不同程度的恢复作用.牛血组的结果显示,Mn2+、Fe3+对凝
集活性的恢复作用大于Ca2+、Mg2+.羊血组的结果显示,Mn2+、Mg2+和Fe3+对凝集活性均有较强的
恢复作用,其中Fe3+对凝集活性的恢复作用最强,恢复后的效价可达24.
表5 金属离子对蒙古口蘑菌丝体凝集素凝集活性的影响
Table 5 Effects of metal ions on activity of lectin from mycelia of Tricholoma mongolicum
凝集
效价
未经处理
的凝集素
凝集素经EDTA处理后
不加金属离子 加Ca2+ 加 Mg2+ 加 Mn2+ 加Fe3+
20
21
22
23
24
25
26
空白
牛血 羊血
++++ ++++
++ +++
+  ++
-  +
-  +
-  -
-  -
-  -
牛血 羊血
-  +/-
-  -
-  -
-  -
-  -
-  -
-  -
-  -
牛血 羊血
++ ++
+  +
-  -
-  -
-  -
-  -
-  -
-  -
牛血 羊血
++ +++
+  ++
-  +
-  -
-  -
-  -
-  -
-  -
牛血 羊血
+++ +++
++  ++
+  +
-  -
-  -
-  -
-  -
-  -
牛血 羊血
+++ ++++
++  +++
+  ++
-  +
-  +
-  -
-  -
-  -
3 讨论
糖结合特异性是凝集素的重要特征.凝集素的这种特异性与细胞表面糖残基结合的关系可类比
为酶与底物的“锁钥”关系.抑制剂是特殊的底物,与凝集素分子识别位点结合,从而阻止它与靶向供
体的结合[5].本文的糖抑制实验中果糖、半乳糖、葡萄糖、木糖都可以与蒙古口蘑菌丝体凝集素结合,
影响蒙古口蘑的凝血效果.说明蒙古口蘑菌丝体凝集素有与互补的单糖专一结合的位点.
利用不同pH浸提液抽提后,发现用弱酸或弱碱性浸提缓冲液有利于凝集素的提取,菌丝体凝集素
对酸具有一定的稳定性,但对强碱不稳定.这与香灰菇、银耳及松乳菇的菌丝体凝集素在碱性环境较稳
定不同[6-7].姚庆智等[8]对蒙古口蘑茵丝体凝集素提取工艺优化为0.01mol/L PBS溶液(pH7.4)浸泡
48h.我们发现,在pH3.0~7.4之间其凝集素表现出较强的凝集活性,而在碱性条件下(pH8.0~10.0),
凝集素活性则下降,说明蒙古口蘑菌丝体凝集素与糖基的结合部位可能有带正电基团的参与[6].
凝集素的热稳定性主要取决于其活性位点的性质,若活性位点为蛋白或多肽,由于肽链和蛋白质
14第1期 孟建宇 等 蒙古口蘑菌丝体凝集素性质初步研究
在受热情况下空间构象会发生改变而变性失活,所以这种凝集素的热稳定性就差,若活性位点为糖
链,由于糖链对热不太敏感,所以这种凝集素的热稳定性就强[9].也可能在于分子内二硫键使肽键的
折叠呈现较稳定的结构[10].蒙古口蘑菌丝体凝集素有很好热稳定性,温度在60℃处理后,才彻底失去
凝血活性,类似于银耳和树舌菌丝体凝集素[1,6],略低于蒙古口蘑子实体凝集素的热稳定性[4].
金属离子的存在对维持许多凝集素的功能至关重要,在去除金属离子后的蒙古口蘑菌丝体凝集
素中添加Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe3+等金属离子,即可使其凝集活性不同程度地恢复.这些金属离子可
以使去离子的凝集素活性恢复,说明金属离子对保持蒙古口蘑菌丝体凝集素的天然结构有重要作用.
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(责任编委 梁存柱)
A Primary Study on Characteristics of
Lectin from Mycelia of Tricholoma Mongolicum
MENG Jian-yu1,YANG Yan1,LIU Jia-jie1,HAO Jian-hua2
(1.College of Life Sciences,Inner Mongolia Agricultural University,
Hohhot 010018,China;2.Yellow Sea Fisheries Research Lnsititute,
Chinese Academy of Fishery Sciences,Qingdao 266071,China)
  Abstract:The mycelia of Tricholoma mongolicum were cultured by the shake-flask cultiva-
tion.The lectin was extracted from mycelia of Tricholoma mongolicumby phosphate buffer and its
properties were tested and analyzed.The results showed that the lectin was able to agglutinate cattle
erythrocytes and sheep erythrocytes.The agglutination activity could be inhibited by D-fructose,β
-glucose,galactose and xylose.It was beneficial to extract the lectin in the weak acidic or weak al-
kaline buffer.The lectin was stable in heat treatment,and it stil has partial activity at 60℃.Metal i-
ons were indispensable for the agglutination activity of lectin,the effects of Ca2+,Mg2+,Mn2+ and
Fe3+are varied.
  Key words:Tricholoma mongolicum;mycelia;lectin;saccharide inhibition;stability
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