全 文 ：92 Zo cZ o V. 2 l 8, Nd
.
04 口品科字 城基础研究
醉马草提取物的抑菌特性研究
张 伟 ’ ,2 , 李 冠 ’ , 田 聪 ,
l(
.新疆大学生命科学学院 , 新疆 乌鲁木齐 83 00 4 6 ;
2
. 新疆农科院微生物所 , 新疆 乌鲁木齐 830 00() )
摘 要 : 用 95 % 食用乙醉采用回流浸煮法提取醉马草各成分 , 提取物分为总生物碱和非生物碱两部分 , 总生物碱
部分按极性大小又分 4 个部分。 以此为供试液对大肠杆菌等 6 个菌种做抑菌谱 、 不同 p H 值下抑菌活性的变化和提
取物热稳定性等实验 。 结果表明供试液对供试菌均有不同程度的抑制作用 , 得到的各供试液的最低抑菌浓度
(M cl )
, 提取物热稳定性比较好 , 各供试液不同 p H 值下的抑菌活性发生一定的变化 .
关健词 : 醉马草 ; 提取物 ; 抑菌实验
S tU d y o n nA it而“ 曲 l ia A e it vi yt o f A c h an het ~ ien basn
(H an e )K e n g E x u妞 c st
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中图分类号 : 09 49 .7 1.4 2 文献标识码 : A 文章编号 : 1X() 2一 6 3仪 2X() 7扣今 X( 拍 2一 03
醉马草M ` h n a r h e r u m i n e b r i a n s ( H a n e e ) K e n g . ]
别名为醉马友友 、 毒草等 , 为友草属 ( A c h n a ht e ; “ m
B e a u v
.
)禾本科 多年生草本植物 。 醉马草原产于欧
亚 , 广泛分布于我国西北地 区 。 醉马草多生于高 山
及 亚 高 山草 原 、 山坡 草地 、 田 边 、 路 旁 、 河滩 ,
海拔 1 7 0 0 ~ 4 2 0 0 m `” 。 它是哈萨克医常用的药材 ,
具有 消肿止痛 、 清热解 毒等功效 , 对于腮腺 炎和
关节炎的治疗 有很好 的效果 。 由于其具有抗高寒 、
耐干 早等 优势 , 因而分布广 、 适应性 强 , 尤 其是
近些年来 由于过度放牧造成草场退化 , 而醉马草乘
机 蔓延 , 成为畜牧业 一 大危 害 , 其 毒性可能是 由
于 内生真菌引起的川 。 据调查 , 在新疆 维吾尔 自治
区 , 醉马草广 泛分布于 天山南北 , 攫盖度 最高可
达 8 5 % ` 3 , 。 醉马草己是我国北方尤其是西北草原上
主要毒草之一 。 本文的 目的在于调查研 究醉马草各
成分的抑菌特性 , 希望能为这一资源 的开发利用提
供理论依据 . 礴 ] 。
材料与方法
L l 仪器 、 试剂 、 材料
L ^ B O R O T ^ 4 0 0 0 型旋转蒸发仪 海道夫公司 : 培
养箱 、 天平等 国产 。
9 5% 乙醇 (食用级 ) 国产 : 石油醚 (3 0 ~ 6 0 ℃ ) 、 抓
仿 、 硫酸 、 氨水 、 正丁醇等 (均为 A R 级 ) 国产 ;
7 3 2 强酸性树脂 上海汇脂树脂厂 。
醉马草采自新强乌鲁木齐县天山北坡 , 由新祖农业
大 学林 学 院 周 贵玲 老 师 鉴 定 。 供试 用 大 肠 杆 菌
伍c h 。 , i e人i a e o l i ) 、 枯草杆菌 (B a c i l l u : , u b t i l i s ) 、 金黄
色葡萄球菌 ( s t a p 人夕 zo e o c c u , a u r e u s ) 、 酵母 、 青霉
(p e n i c i l l i u m s p )
、 黑曲霉 ( A印 e馆 i l zu s s p )等 6种菌种均
由本实验室保存 .
12 方法
1
.
.2 1 供试液的制备 l,l
取醉马草干粉 5 0 0 9 采用回流浸煮法 , 样品分三次
按 l : 4 、 1 :3 、 1 :3 的样重与 9 5% 食用乙醇`质量体积比) ,
收稿日期 : 2X( 场~ 04 一 2 9 * 通讯作者
作者简介 : 张伟 ( 19 7 3 一 ) , 男 , 硕士研究生 , 主要从事分子生物学与植物化学研究 。
城基础研究 砚品皿字 2 0 7, Vo L 28, 川口. 04 夕 J
采用牛津杯法 。 取试管数支 , 以无菌水将待测液进
行一系列对倍稀释 , 浓度分别为 1 0 0 、 5 0 、 2 5 、 1 2 . 5 、
6
.
25 m gl ml
, 同时以乙醉做阳性对照 。 在各皿中均匀
摆放 6 只牛津杯并编号后加入对映的稀释好的待测液
5 0 “ l 。 培养后卡尺测量抑菌圈 , 每一实验重复 3 次 ,
并计算平均值 。
2 结果与分析
非生物碱部分对大肠杆菌 、 枯草杆菌 、 金黄色荀
萄球菌 、 醉母菌 、 青霉 、 黑曲霉都有抑菌活性 。 生
物碱的水溶部分和正丁醉部分对以上 6 种菌都有抑菌活
性 。 生物碱的氛仿和石油醚部分仅对大肠杆菌 、 枯草
杆菌 、 金黄色葡萄球菌有抑菌活性 。
衰 1 不同 pH下醉马草乙醉提取物抑二的变化飞b行e 1 C h a n ge s o f AhC an ht e n “ m 仍 . 七月匕an (H a n ce )K e n g
a le o h o l e xt ar 以 5 . in h ib耽jo n d ia m e t e r a t d if e er n t PH v a lu e s
菌名 测试液
p H 值
6 6
.
5 7 7
.
5 8
抑曹圈的变化
I + + O 一 一
n 一 一 0 0 一
000大肠杆菌
O
0
00+
0
枯草杆菌
O
0
O
O
O
0
O
0
一01000+一0+
lIlV>n1mIVn11vl
于 6 5 ℃回流煮沸 3 h 的方法处理 。 每次浸煮完后抽滤浸煮
液 , 合并 3 次抽滤出的浸液于 6 5 ℃水浴旋转浓缩成浸
膏 , 用 0 . 5% 的硫酸多次少量溶解抽滤 。 将滤过液反复
缓慢通过提前处理好的 7 3 2 型强酸性阳离子树脂 , 直到
流出液检测不到生物碱 , 此流出液即是醉马草非生物碱
部分 。 然后用 p H 值为 10 的蒸馏水 (氨水调 )反复缓慢流过
装有吸附有生物碱的 7 3 2 型树脂柱 , 回收所得流出液就
是醉马草总生物碱 , 适当浓缩后依次用等体积石油醚 、
氛仿 、 正丁醉反复多次萃取 , 所得物质既是醉马草不同
极性的生物碱 。 以上五种供试液于 65 ℃水浴旋转浓缩成
浸膏后 , 称重并用适当溶剂 (非碱部位 、 生物碱的水和
正丁醇部位用水溶 , 生物碱的抓仿 、 石油醚部位就用乙
醇 、 石油醚溶 )溶解配制成 p H 7 的 10 0 m gl m l溶液备用 。
1
.
.2 2 供试菌和供试菌培养皿的准备
将滤纸片 、 镊子 、 装有蒸馏水的试管 、 培养皿等
提前灭菌处理备用 , 固体培养基灭菌后倒好 。 细菌用
L B 培养基 , 霉菌用察氏培养基 16 , 酵母菌用麦氏琼脂
培养基 l6] 。 将供试的各种菌种进行液体和斜面两次复壮
活化 , 取一定量 己活化的供试菌于装有无菌水的试管
中 , 制成适当浓度菌悬液 , 霉菌做成抱子悬液 (约 10一
10 , 个 /m l , 可以用显微镜直接记数法测菌体个数或分光
光度法测 O D 值 ) 。 将每种菌悬液 2 0 0时 分别用移液枪加
入制备好的培养皿中 , 并用刮铲涂匀 。 细菌培养皿置
于 3 7 ℃培养箱培养 3 h , 霉菌和酵母培养皿置于 2 8 ℃培
养箱培养 s h 后用做以下实验 。
1.2 3 抑菌谱的确定
琼脂扩散纸片法 16 。 用镊子夹取滤纸片 (直径 7m m )
在待测液中浸湿 , 吸去多余的液体在无菌操作台里晾干
备用 。 用镊子夹取晾干的滤纸片顺次放在含菌平板上 ,
每平板中待测液滤纸片各一片 , 无待测液的滤纸片做空
白对照 。 细菌于 3 7 ℃温箱培养过夜 , 霉菌和酵母置于
2 8℃温箱培养过夜 ( 以下的培养方法与此都相同 ) , 每一
实验重复 4 次 , 观察结果 。
1
.
.2 4 抑菌活性的 p H 范围和热稳定性的实验
用氨水和盐酸把 1 0 o m gl m l 的各待测液分别调制成
6
、
6
.
5
、
7
、
7
.
5
、
8 的五个 p H 梯度 , 然后处理和培
养方法与 1 . 2 . 3 相同 , 观察比较不同 p H 下抑菌圈和 p H
为 7 的抑菌圈的变化 , 大于 p H 为 7 的抑菌圈视为抑菌
活性增强 , 小于 p H 为 7 的抑菌圈视为抑菌活性减弱 。
每一实验重复 3 次 ; 将各测试液的 l o m gl inl 的待测液分
为 3 部分 , 并分别置于 6 5 ℃ 、 8 0℃水浴和 10 0 ℃湿热条
件下处理 , 处理后的待测液用来做抑菌活性变化的实
验 , 方法与 1 . .2 3 节相同 , 并用 p H 为 7 的未加热处理的
待测液做对照 , 培养后观察比较其抑菌效果 。
1
.
2
.
5 最低抑菌浓度 (M l e )测定 17 ]
金黄色葡
萄球菌
n 一 0 0 一 一
醉母苗 m 一 0 0 0 一
】V 0 0 0 0 0
V 0 0 0 0 0
I 一 一 0 0 +
n + + O 一 一
青霉 m + 0 0 - 一
IV 0 0 0 0 0
V 0 0 0 0 0
I 一 一 0 0 +
n + + O 一 一
黑曲霉 nI + 0 0 - -
VI 0 0 0 0 0
V 0 0 0 0 0
注 : I 为非生物玻成分 , n 为生物碱水溶成分 , 1 为生物城正丁阵成分 .
I v 为生物碱的抓仿成分 , V 为生物碱石油醚成分 。 + 为抑菌圈增人 , 一
为抑菌圈减小 , O 为无变化 。
4 2 907, vo .l 28, N d
. 例 口品职字 嵌基础研究
通过醉马草提取物的热稳定性实验发现 , 提取物的
各个部分处理完后抑菌效果并无明显变化 , 可能的原因
是起到抑菌活性的物质对热不敏感 , 或者提取方法本来
就是加热回流法 , 再加热后对其抑菌活性影响变化不
大 . 但是待测液的 p H 改变却使大部分待试液的抑菌能
力发生了变化 。 其中非生物碱部位在酸性条件下对大肠
衰 2
飞 b l6 2
醉马草各成分对各洲试 , 的抑 , 活性和 M CI 洲定
An Um ic or b ia! a tC扮 iyt a n d M IC o f e Xt ar c tio n f or m
AhC
月 a ht e们Um 仍 e b alf n , ( Ha n c . )eK gn a ga ln at tes t一ab d e血 m
提取物的浓度 (m创回 )
杆菌 、 枯草杆菌 、 金黄色葡萄球菌 、 酵母菌的抑菌活
性都增强 , 对青霉 、 黑曲霉的抑菌活性都减弱 , 可能
的原因是在酸性条件下提取物中的物质溶解释放发挥了
抑菌活性 , 但这些物质对真菌不敏感 。 生物碱部位无
论在酸性条件下还是在碱性条件下对大肠杆菌 、 枯草杆
菌 、 金黄色葡萄球菌 、 酵母菌的抑菌活性都无明显效
果 , 其中的变化都集中在 p H 6 或 8 时 , 变化可能是由
p H 值本身引起的 。 生物碱部位在酸性条件下对青霉 、
黑曲霉都有抑菌活性 , 可能是其中的生物碱对真菌有抑
菌活性 。 具体结果见表 l 。
醉马草各成分对大肠杆菌 、 枯草杆菌 、 金黄色葡
萄球菌 、 酵母菌 、 青霉 、 黑曲霉等菌的抑菌活性和 M I C
测定结果见表 2 。 研究表明: 醉马草粗提物的活性成分
对热具有良好的稳定性 , 这对于以后的提取分离具有重
要的意义 , 对提取物的长期贮存及实际应用也十分有
利 : 醉马草的乙醉提取物抑菌活性较为复杂 , 起码受到
两个方面的影响 , 即受试菌种的敏感性和提取物的不同
极性部位 ; 醉马草粗提物的抗菌谱广 , 对球菌 、 杆菌 、
霉菌等革兰氏阳性和阴性都有抑菌活性 。 我们的研究和
相关的资料表明 , 醉马草当中含有水溶性生物碱和黄酮
等多种成分 , 其中的生物碱是醉马草的有毒物质 (这是
我们把生物碱部分作为主要抑菌材料的原因 ) , 并且这
些成分的含量会随着醉马草的生长有很大的变化 。 天然
产物活性功能的机理很复杂 , 和其分子的结构有很大关
系 , 因此醉马草中主要成分的分子结构和功能还有待进
一步研究 。
参考文献 :
皿
徽曲 . nl
VI
v - - - - -
注 : I为非生物玻成分 , n 为生物胶水溶成分 , m 为生物碱正丁醉成分 ,
VI 为生物喊的级仿成分 , v 为生物胶石油醚成分 。 + 为有抑菌活性 ,
一为无抑菌活性 .
史志诚 . 中国草地重要有毒植物 IM I. 北京: 中国农业出版社 , 198 :7
l肠 . 17 6 .
BA C O N C W
.
T o x ic e n d创止y比 一访众` 囚 taU 殆SC u e an d 几旧召e g n比 8SC :
址s to ir c pe rs 户父 it v es l月. J A山m sc 礼19 5 , 7 3 : 86 1一87 0 .
于振 田 . 醉马草的防治及开发利用I IJ . 新祖畜牧业 , 19 3 (4) : 协23 .
李云森 , 陈子君 , 王峥涛. 从有毒植物中开发新药的探讨闭 . 中草药 ,
2 00 2
,
3 3 (5 ) : 4 7 6
.
4 7 7
.
车宗伶 , 维达里 G , 筱达菲因茨 P . 竹荪中弱极性及非极性有机物的
提取 、 分离和鉴定 J[ 1. 天然产物研究与开发 . 19 6 . 8 (4) : 5 1一5 .6
郑钧箱 , 王光宝 . 药品徽生物学及检侧技术「M】. 北京: 人民卫生出
版社 , 19 89 .
截自英 . 临床抗菌药学【M 】. 北京: 人民卫生出版社, 19 85 .
123[]l4j阎6I阴
菌名 侧试液 10 父 25 12 . 5 .6 25
抑菌活性
I + + + 一 一
n + + + + +
大肠杆苗 m 十 + 十 + 一
W + +
一 一 一
V + 一 一 一 一
I + + + + 一
n + + + 一 一
枯草杆菌 m + + + - -
VI
+ 一 一 一 一
V + 一 一 一 一
I + + + + 一
金黄色份 n + + + + 一
翻球菌 m 十 + + + 一
VI +
一 一 一 一
V + 一 一 一 一
I + + + 一 一
n + + + 一 一
醉母菌 m + + - - 一
VI
- - 一 _ _
V 一 一 _ _ _
I + + 一 一 一
n + + 一 一 一
青. m + 一 - 一 一
VI
- - - 一 _
V 一 一 _ _ _