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微波处理对醉马草内生真菌的杀灭效果及发芽活力的影响



全 文 :核 农 学 报 2016,30(9):1792 ~ 1797
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
收稿日期:2015-06-19 接受日期:2015-10-26
基金项目:高等学校博士学科点专项科研基金(20126504110001),新疆农业大学草业科学国家重点学科博士研究生创新基金研究项目(XJCYB
- 2011 - 01),新疆维吾尔自治区研究生教育创新计划科研创新项目(XJGRI2015092)
作者简介:张蕊思,女,主要从事草地资源与生态研究。E-mail:787055914@ qq. com
通讯作者:安沙舟,男,教授,主要从事草地资源与生态教学与研究。E-mail:xjasz@ 126. com
文章编号:1000-8551(2016)09-1792-06
微波处理对醉马草内生真菌的杀灭效果
及发芽活力的影响
张蕊思 安沙舟 施 宠 卡斯达尔·努尔旦别克
(新疆农业大学草业与环境科学学院 /新疆草地资源与生态重点实验室,新疆 乌鲁木齐 830052)
摘 要:为探索构建禾草内生真菌不感染试验种群的方法,选用醉马草为材料,以 150W和 300W 微波功
率分别处理醉马草种子 30、40、50 和 60s,研究不同微波处理强度下内生真菌的致死情况,同时考察微波
对醉马草发芽活力的影响。结果表明,150W 和 300W 处理 40s 以上,醉马草带菌率分别显著降到
19. 38%、5. 22%以下,300W处理 60s,醉马草内生真菌可完全致死;150W处理 30、40s和 300W处理 30s
后,醉马草的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数与对照(未经微波处理,CK)相比均无显著差异,其他
处理下上述指标随处理强度的增加出现不同幅度的下降;150W 或 300W 处理 30s 和 40s 的醉马草芽
长、根长和生物量与 CK无显著差异,其他处理下各指标均受到不同程度的抑制。因此,150W处理 40s
为剔除醉马草种传内生真菌的最佳方法。本研究为探索无毒醉马草作为饲料及优良牧草的选育提供了
技术支持。
关键词:内生真菌;微波处理;醉马草
DOI:10. 11869 / j. issn. 100-8551. 2016. 09. 1792
感染内生真菌的植物在自然界普遍存在[1]。据
报道,内生真菌和植物共生在多数情况下是互利
的[2]。内生真菌一方面不仅可以积极影响宿主植物
的生长和对干旱等非生物胁迫的抵抗能力,而且还
可起到阻止食草动物和昆虫的采食、抑制病原真菌
侵染的作用[3];另一方面内生真菌在禾草体内产生
的生物碱致使采食带菌禾草的马、牛、羊、鹿等家畜
产生中毒症状,每年给美国、新西兰等国家造成严重
的经济损失[4]。美国学者 1994 年首次在采自我国
新疆的醉马草(Achnatherum inebrians)种子中发现了
内生真菌[5];1996 年新西兰学者 Miles 等[6]也从采
自新疆的醉马草种子和幼苗中检测到了内生真菌,
并分离得到了纯培养。李学森等[7]报道我国新疆醉
马草种子带菌率为 98%、幼苗内生真菌带菌率
85%;2004 年 Li 等[8]对我国青海、新疆、内蒙古、甘
肃等主要牧区醉马草内生真菌进行了系统的调查,
从醉马草中分离并正式发表了 1 个内生真菌新
种———甘肃内生真菌(Neotyphodium gansuense Li et
Nan),且将分离于我国新疆的醉马草内生真菌命名
为甘肃内生真菌醉马草变种。此后相关研究主要围
绕醉马草内生真菌的生物学与生理学特性[9]以及内
生真菌致病性[10]和抗性[11]等方面展开。为了阐明
内生真菌对宿主植物的作用,首先必须获得内生真
菌感染和非感染的试验植物种群,而在自然界中,禾
本科植物内生真菌的感染率往往比较高,有时甚至
达到 100%[12]。要获得不感染内生真菌的醉马草种
群只有通过人工灭菌的方法,主要有杀真菌剂法、高
温法和湿热法。研究指出,微波是安全、可靠、高效
的一种灭菌方法,也是一种表面消毒方法[13]。本试
验首次采用微波的方法杀灭醉马草种子内生真菌,
研究微波处理后醉马草种子发芽活力指标和带菌率
的变化,探索内生真菌的最佳去除方法,旨在为获取
不感染内生真菌的其他禾草提供理论依据。
2971
9 期 微波处理对醉马草内生真菌的杀灭效果及发芽活力的影响
1 材料与方法
1. 1 材料
试验材料为醉马草,于 2014 年 8 月在乌鲁木齐市
南山(43. 49°N、87. 10°E)野外采集,经过镜检以及室内
培养后检测带菌率均在90%左右。选取大小一致、籽粒
饱满、无破损的醉马草种子作为研究载体。
1. 2 方法
1. 2. 1 微波功率与时间的设置 微波源为 WG750 格
兰仕微波炉(佛山顺德区格兰仕微波炉电器有限公
司),额定电压 220 V -50 Hz,额定波频 2 450 MHz,额
定输出功率 1 180 W,微波输出功率 750 W,其中低火
档位输出功率为 150 W,中低火档位输出功率为 300
W。试验将微波功率设置为 150、300 W,分别进行 30、
40、50 和 60s的处理。将未经微波处理的种子作为对
照组(CK),处理组和对照组均设 3 个平行。
1. 2. 2 微波处理种子 将保存于 4℃的种子取出后
均匀摆放在直径 9 cm玻璃培养皿内,然后将培养皿置
于设定好微波档位的微波炉的正中央。具体操作:将
待处理种子每次都置于直径 9 cm 的同一个玻璃培养
皿中,培养皿的中心(直径 2 cm 内均为中心)空出不
放置种子,种子均匀的摆放在中心的四周形成圆环,每
个处理结束后待微波炉内条件(温度等条件)恢复至
初始状态方可进行下一个处理。
1. 2. 3 内生真菌的检测 达到预定微波处理后,对种
子先进行预处理[14],后进行消毒处理[15],之后每个处
理随机选取 50 粒种子置于等距离含有 100 mg·L -1链
霉素和 100mg·L -1氯霉素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基
上,每个处理 3 次重复,30 d后统计菌落数并计算带菌
率。试验期间用到的漂洗对照、印记(迹)对照和环境
对照参照文献[14]进行。
1. 2. 4 种子萌发 达到预定微波处理后,将种子从微
波炉取出,随机挑取 50 粒种子浸泡过夜后整齐摆放
于内置双层滤纸(提前用去离子水湿润)、直径为 11
cm的培养皿中,于 25℃培养箱暗处避光发芽,每个处
理 3 次重复。发芽试验采用 SPX -300I-G型光照培养
箱(上海双旭电子有限公司)进行种子萌发。从种子
置床之日起开始观察,以胚根长等于种子长、胚芽为种
子长的 1 /2 为发芽标准[16],逐日定时记载发芽种子
数,直到 18 d试验结束测定并统计发芽率、发芽势、发
芽指数、胚根长和胚芽长以及幼苗鲜重(试验期间若
发现个别种子霉变,要及时进行清洗消毒处理并更换
滤纸)。每重复随机选取 10 株,用精度 0. 01 mm 的
500 - 173 电子数显游标卡尺(日本 Mitutoyo)测量胚芽
长、胚根长,用精度为万分之一分析天平(上海友声衡
器有限公司)称取幼苗鲜重。
1. 3 测定项目与方法
醉马草种子的发芽率(germination rate,Gr)、发芽
势(germination potential,Gp)、发芽指数(Gi)、萌发活
力指数(Vi),按照以下公式计算[17]:
Gr =发芽总数 /供试种子数 × 100%;
Gp =前 7d内的发芽数 /供试种子数 × 100%;
Gi =∑(Gt /Dt);
Vi = Gi × S;
式中,Gt为逐日发芽数,Dt为相应 Gt的发芽天数
(d),S为萌发后种子鲜重(g)。
第 30 天时记录每皿带菌种子数并拍照,根据下式
计算种子内生真菌带菌率:
种子带菌率 = 带菌种子数 /检测种子总数 ×
100%[18]。
1. 4 数据处理
应用 Excel 2007 和 SPSS 20. 0 进行数据整理与统
计分析。结果用平均值 ±标准误表示。
2 结果与分析
2. 1 微波处理对内生真菌带菌率的影响
由表 1 可知,相同功率不同处理时间或相同时间
不同微波功率的变化均会使醉马草内生真菌带菌率呈
极显著下降趋势(P < 0. 01)。与 CK相比,150 W处理
40 s 以及 300W处理 30 s 后,醉马草内生真菌带菌率
下降极显著,分别下降 72. 44% 和 68. 53% (P <
0. 01);150 W处理 50 s 和 60s以及 300W处理 40、50
和 60 s,醉马草内生真菌带菌率分别显著下降了
70. 51%、81. 38%、86. 6%、88. 92%、91. 25% (P <
0. 05)。微波处理后,种子的带菌率显著降低(图 1)。
2. 2 微波处理对种子萌发的影响
由表 2 可知,微波处理可使醉马草种子发芽率有
所降低,表现为在相同功率下处理时间的延长或者相
同处理时间下功率增加的条件下,发芽率均随之降低。
与 CK 相比,150W 处理 50、60s 及 300W 处理 40、50
和 60s 后,醉马草发芽率呈显著下降趋势(P < 0. 05),
发芽势、发芽指数和活力指数也呈相似的变化;与 CK
相比,150W处理 30、40s 及 300 W处理 30s 时对种子
活力有影响,但不显著,150W 处理 50s 以上或 300 W
处理 40s 以上即可对种子的生命力造成显著影响(P
< 0. 05)。
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核 农 学 报 30 卷
表 1 微波处理对内生真菌的影响
Table 1 The effects of microwave pretreatment on the Endophyte of Achnatherum inebrians seeds /%
功率 Power /W
时间 Time /s
CK 30 40 50 60
150 91. 82 ± 0. 01aA 60. 19 ± 0. 02bB 19. 38 ± 0. 03cC 21. 31 ± 0. 04cC 10. 44 ± 0. 02dCD
300 91. 82 ± 0. 01aA 23. 29 ± 0. 07cC 5. 22 ± 0. 01deD 2. 90 ± 0. 01deD 0. 57 ± 0. 01eD
注:同列数据后不同小写字母表示差异显著(P < 0. 05),不同大写字母表示差异极显著(P < 0. 01)。下同。
Note:In the same line,values with different small letter superscripts mean significant difference at 0. 05 level,with different capital letter superscripts mean
significant difference at 0. 01 level. The same as following.
表 2 微波处理对种子萌发的影响
Table 2 The effects of microwave pretreatment on the seed germination of Achnatherum inebrians seeds
处理 Treatments
功率
Power /W
时间
Time /s
发芽率
Germination rate /%
发芽势
Germination potential /%
发芽指数
Germination index
活力指数
Vital index
150 30 31. 33 ± 0. 08abAB 24. 67 ± 0. 07abAB 24. 93 ± 7. 00abA 0. 18 ± 0. 06abAB
40 24. 67 ± 0. 03abcABC 19. 33 ± 0. 04abcABC 17. 34 ± 1. 93abcAB 0. 156 ± 0. 00bcAB
50 16. 67 ± 0. 08bcdABC 8. 67 ± 0. 05cdBC 8. 88 ± 4. 02cdAB 0. 10 ± 0. 04bcAB
60 18. 00 ± 0. 02bcdABC 14. 00 ± 0. 02bcdABC 11. 73 ± 1. 64bcdAB 0. 12 ± 0. 01bcAB
300 30 21. 33 ± 0. 04abcdAB 16. 00 ± 0. 03abcdABC 13. 30 ± 2. 71bcdAB 0. 17 ± 0. 03abAB
40 5. 33 ± 0. 01cdBC 4. 67 ± 0. 01cdBC 4. 17 ± 0. 55cdB 0. 04 ± 0. 00bcB
50 16. 67 ± 0. 03bcdABC 8. 67 ± 0. 03cdBC 7. 95 ± 1. 10cdB 0. 12 ± 0. 01bcAB
60 3. 00 ± 0. 01dC 1. 00 ± 0. 01dC 1. 97 ± 0. 15dAB 0. 01 ± 0. 00cB
2. 3 对种子幼苗生长的影响
由图 2 - A 可知,除 150W 处理 40s 时的芽长与
CK无显著差异外,其他处理时间均显著抑制了芽的生
长(P < 0. 05),但各处理之间无显著差异;300W 功率
下,芽长随着处理时间的延长出现缓慢下降趋势,60s
时显著抑制了醉马草芽长的生长(P < 0. 05)。醉马草
芽的生长对微波处理比较敏感,双因素方差分析表明,
功率和时间都会影响芽的生长,其中,300W 下醉马草
芽的芽长高于 150W,但均低于 CK。图 2 - B 表明,
150W 功率下,各处理之间醉马草根长均无显著差异;
300W 功率下,仅当处理时间延长到 60s时根长显著下
降(P < 0. 05),功率变化对根长的变化无显著影响,但
在高功率下处理时间过长,根的生长会受到明显影响。
由图 2 - C 可知,150W 功率下,幼苗鲜重随着处理时
间的延长出现缓慢下降趋势,除了 40s 外,其他处理时
间组与 CK相比均达到显著水平(P < 0. 05),300W 功
率下,幼苗鲜重随着处理时间的延长出现缓慢下降趋
势,当处理时间为 60s时显著下降(P < 0. 05),这与芽
长的变化表现出一致性。
3 讨论
目前国内外有许多关于剔除宿主内生真菌的研
究,大致可分为化学杀菌法和物理杀菌法 2 种。化学
杀菌法选择用杀菌剂进行杀菌,但化学药剂易造成环
境污染,且具有毒性[19]。物理杀菌法中被较多采用的
是水浴加热法,水浴加热的方法虽然能杀灭内生真菌,
但也显著影响种子的发芽和幼苗生长;较长时间湿热
作用对种子活力也有一定的破坏[20]。物理杀菌法中
的干热高温法也能有效剔除内生真菌,但其长达 4 周
甚至 6 周之久的处理周期较耗时[21]。本研究首次采
用微波辐射法去除种子内生真菌,达到了有效杀灭种
子内生真菌且对种子活力无负影响的效果,这不仅弥
补了国内微波辐射去除禾草种子内生真菌方面的空
缺,而且微波灭菌方法操作简单便捷,可以在实际生产
中推广应用。
本研究发现,微波处理能够有效降低醉马草种子
内生真菌带菌率。其中 150 W处理 40s以上可以将内
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9 期 微波处理对醉马草内生真菌的杀灭效果及发芽活力的影响
注:A:CK;B ~ E:150W处理 30 ~ 60 s;F ~ I:300W处理 30 ~ 60 s。
Note:A:CK. B to E:150 W power processing for 30 to 60 s. F to I:300 W power processing for 30 to 60 s.
图 1 不同微波处理强度下醉马草内生真菌带菌的变化
Fig. 1 The situation of Endophyte of Achnatherum inebrians treated by microwave at different intensity
生真菌带菌率降到 10. 44% ~ 21. 31%,300 W 处理
40s以上可以把内生真菌带菌率降到 0 ~ 5. 22%,这与
徐艳阳等[22]发现微波辐射处理可以有效抑制菌类孢
子的生长,进而杀灭种子内部的内生真菌的结论一致。
本研究结果显示,处理时间内功率增加,或者相同功率
下延长处理时间,醉马草的带菌率均降低。这与曾淑
薇等[23]研究发现大米中霉菌致死率随着微波剂量和
处理总时间的增加而急剧增加的结果相吻合,表明微
波处理强度显著影响内生真菌的活力,种子内生真菌
带菌率随着微波处理强度的增大显著下降。此外,本
研究中,150 W 处理 40 s 可以把醉马草带菌率从
91. 82%显著降低到 19. 38%,且对醉马草种子发芽参
数无显著影响。这与王殿轩等[24]在研究微波处理对
米象致死效果及小麦发芽率的影响时发现微波处理有
效杀死米象成虫、蛹、幼虫和卵的同时也降低了小麦发
芽率的研究结果一致,说明适当强度的微波处理既可
以有效杀灭醉马草种子内的内生真菌,又不影响种子
活力,随着微波处理强度的增加,内生真菌在被杀灭的
同时醉马草种子发芽活力也受到了不同程度的影响。
本研究表明,150 W处理 30s和 40s或 300W处理
30s后,醉马草种子的发芽率、发芽势、发芽指数和萌
发活力指数以及芽长、根长和生物量与对照组相比无
显著差异,而随着微波强度的加大,上述发芽参数则显
著受到抑制。李一帆等[25]研究表明不同程度的微波
处理对刺槐种子的发芽率、发芽指数以及活力指数均
呈抑制作用,这与本试验结果一致,表明当微波辐射强
度过大时反而会抑制种子的萌发。而杨俊红等[26]发
现微波处理后多种植物种子的相对幼苗活力指数均显
著提高;刘金文等[27]也发现用微波处理大豆种子后其
发芽率、发芽势和发芽指数均显著提高。这可能与种
子自身特性有关,即使是对同一科植物种子的萌发,微
波处理也同时存在正、负效应[28],但具体的机理有待
进一步探讨。
4 结论
本研究表明,150 W 处理 40s 可以有效降低醉马
草带菌率而不影响种子活力,但微波强度较大时则会
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核 农 学 报 30 卷
图 2 不同微波处理强度下幼苗芽长(A)、根长(B)和鲜重(C)的变化
Fig. 2 The hypocotyls length(A),radical length(B)and seeding fresh weight(C)of
Achnatherum inebrians seedings treated by microwave at different power span and time
造成伤害,即显著影响醉马草的生命力。因此,150 W
功率处理 40s 为剔除醉马草种传内生真菌的最佳方
法。醉马草粗蛋白含量比较丰富,因此明确醉马草内
生真菌的去除方法为探索获取无毒醉马草作为饲料提
供了可能性。
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Germicidal Efficacy of Microwave Treatment Against Endophyte and Its
Effects on the Germinating Vigor of Achnatherum inebrians
ZHANG Ruisi AN Shazhou SHI Chong NUERDANBIEKE Kasidaer
(Key Laboratory of Grassland Resources and Ecology of Xinjiang /College of Pratacultural and
Environmental Science,Xinjiang Agricultural University,Urumqi,Xinjiang 830052)
Abstract:In order to explore and construct the method for endophyte-free populations of Achnatherum inebrians,
selecting A. inebrians as the test material and treating its seeds with the microwave power of 150W and 300W for 30,40,
50 and 60s to study the lethal situation of endophyte at different microwave treatment intensity and investigate the effect
of microwave to A. inebrians germination vigor. The results indicated that microwave treatment was effective in killing the
endophyte in the seeds. While the endophyte were treated 150W or 300W for 40s,the contamination rate significantly
dropped below 19. 38% and 5. 22%,respectively. After 300W for 60s treatment,seedlings were all uninfected. There
was no significant difference between CK and subjects’germination rate,germination potential,germination index and
vital index after 150W for 30s and 40s or 300 W for 30s. At the same time,the hypocotyls length,radical length and
seeding fresh weight were also suppressed after microwave processing,but 150 W or 300 W for 30s and 40s had no
significant effect compared with the control. The result showed that the solution of 150 W treated seeds in 40s was the
best way to eliminate fungal endophyte of A. inebrians. This study may provide technical support on exploring A.
inebrians as animal feed and quality forage.
Keywords:endophyte,microwave treatment,Achnatherum inebrians
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