全 文 ：·论著·
覆盆子提取物联合唑类药物抗真菌活性研究
张石群1 林辉2 苗琦1 刘伟2 曹永兵1，2 姜远英1，2
(1．第二军医大学药学院药理学教研室，上海 200433;2．福建中医药大学药学院中药教研室，福州 350108)
【摘要】 目的 探讨中药覆盆子提取物联合唑类药物的体外抗真菌作用。方法 采用 CLSI公布的 M27-A 方案微量液基
稀释法和棋盘式微量稀释法，测定覆盆子提取物单用及联合唑类药物对不同念珠菌的 MIC 值和 FICI 指数。结果 覆盆子
不同溶液提取物与氟康唑均表现出协同关系，以覆盆子醇提物为例，单用对念珠菌的 MIC80测定值范围主要集中在 0． 16 ～
1． 25 mg /mL，与氟康唑合用后表现出协同关系 (FICI≤0． 5) ，且 MIC80测定值范围降至 0． 01 ～ 0． 04 mg /mL;合用后的氟康唑
抗真菌活性也明显增强。另外，覆盆子醇提物与不同唑类药物合用后均有协同关系，其 MIC80测定值由单用时大于 10 mg /
mL降至 0． 04 mg /mL。结论 覆盆子醇提物和唑类药物单用时对耐药念珠菌的抑菌作用较弱，但二者合用后表现出明显的
协同关系，对耐药念珠菌的抑菌作用明显增强。
【关键词】 覆盆子;醇提物;体外抗真菌活性;部分抑菌浓度指数 (FICI)
【中图分类号】 R 379 【文献标识码】 A 【文章编号】 1673-3827(2012)07-0004-04
Combination antifungal activity of ethanol extracts from Rubus idaeus and antifungal azoles
ZHANG Shi-qun1，LIN Hui2，MIAO Qi1，LIU Wei2，CAO Yong-bing1，2，JIANG Yuan-ying1，2
(Department of Pharmacology，School of Pharmacy，Second Military Medical University，Shanghai 200433;2． Department of
Chinese medicine，School of Pharmacy，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350108)
【Abstract】 Objective To investigate the antifungal activity of extracts from Rubus idaeus combined with azole drugs against
Candida spp． in vitro ．Methods The minimum inhibitory concentration (MIC) ，the fractional inhibitory concentration index (FI-
CI)of extracts from Rubus idaeus and combination with azole drugs against Candida spp． were determined by M27-A Microdilution
Method based on CLSI． Results All extracts from Rubus idaeus by different solution methods showed collaboration with fluconazole．
For example，the MIC80 of ethanol extracts from Rubus idaeus against Candida spp． mainly concentrated on 0． 16 ～ 1． 25 mg /mL，
while combined with fluconazole showed the collaboration (FICI≤0． 5) ，and the MIC80 reduced to 0． 01 ～ 0． 04 mg /mL． The anti-
fungal effect of fluconazole against Candida spp． was also strengthened． Besides，the MIC80 s of ethanol extracts from Rubus idaeus
were also reduced from 10 mg /mL to 0． 04 mg /mL when being combined with other azole drugs． Conclusion The antifungal effect of
ethanol extracts from Rubus idaeus or azole drugs against resistant Candidas was weaker，while the combination showed clear collabo-
ration and the effect against resistant Candida spp． significantly enhanced．
【Key words】 Rubus idaeus;ethanol extracts;in vitro antifungal activity;fractional inhibitory concentration index (FICI)
［Chin J Mycol，2012，7(1) :4-7］
近 10 a来，随着器官免疫抑制剂、广谱抗生素
的滥用，免疫功能低下者人数不断增多，真菌感染
发生率逐年剧增。目前治疗真菌感染的常用药物
为氟康唑、伊曲康唑、两性霉素 B 等，然而，随着抗
真菌药物的大量使用，真菌耐药现象越来越普遍，
耐药程度也越来越高，耐药性已成为临床抗真菌治
作者简介:张石群，男 (汉族) ，硕士研究生在读． E-mail:zhang-
shiqun1987@ 163． com;林辉，男 (汉族) ，硕士研究生在读． E-mail:
nuLi60tian@ 163． com
通讯作者:曹永兵，E-mail:ybcao@ vip． sina． com;姜远英，E-mail:
jiangyy@ smmu． edu． cn
疗失败的主要原因［1］。因此，人们考虑通过联合用
药的方式对抗耐药真菌，这种方式可以达到增强临
床疗效，降低耐药性产生，减少不良反应的效果［2］。
或使用其他药物，如中成药，可降低不良副作用的
发生率。覆盆子 (Rubus idaeus)为蔷薇科悬钩子
属植物掌叶覆盆子 (Rubus chingii Hu)的近成熟
干燥果实。覆盆子性微温，味甘、酸，归肝、肾经，具
补肝益肾、固精缩尿、明目之功效，主治肾阳虚惫、
宫冷不孕、尿频、遗尿、虚劳、须发早白等症［3］，暂未
发现其抗真菌作用。肖洪明等［4］通过硅胶柱色谱
等手段对覆盆子进行分离提取，发现了山柰酚、紫
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云英苷等 18 个化合物，其中化合物 2α，19α-di-
hydroxy-3-oxo-12-ursen-28-oic acid首次从该属植物
中发现。
本课题组前期从 30 余种中药提取物中进行活
性筛选，发现了覆盆子提取物可以联合抗真菌药物
有效抑制耐药真菌，并对其联合唑类药物的体外抗
真菌作用进行探讨。
1 材料与方法
1． 1 材料
受试菌种 白念珠菌 (Candida albicans)18
株、克柔念珠菌 (Candida krusei)1 株、近平滑念
珠菌 (Candida parapsilosis)1 株、烟曲霉菌
(Aspergillus fumigatus)1 株、热 带 念 珠 菌
(Candida tropical)1 株，其中标准株 2 株，白念珠
菌 sc5314 由 William A． Fonzi 教授惠赠，白念珠菌
ATCC10231 由长海医院菌种保存中心赠送;其余
均为长海医院真菌室提供的临床菌株。
供试中药 覆盆子，产地:浙江，批号:
2011030134。
1． 2 方法
中药提取方法 将中药覆盆子粉碎，称取 5 g
粉末加 70%乙醇，90℃水浴回流 2 h;回流液过滤
后用旋转蒸发仪 50℃减压蒸馏，至浓缩成流浸膏，
烧瓶内加蒸馏水至提取液为 5 g，分别用无水乙醇、
三蒸水、DMSO溶解得到覆盆子的醇提物、水提物、
DMSO提物，最后超声使其充分混匀，分别得到 0． 5
g生药 /mL，-20℃保存备用。
菌悬液的制备 用接种圈从 4℃保存的 SDA
培养基上挑取少量念珠菌，接种至 1 mL YEPD 培
养液，于 30℃，200 r /min振荡培养，活化 16 h 使真
菌处于指数生长期后期。取该菌液同样方法再次
活化，16 h 后用血细胞计数板计数，以 RPMI 1640
培养液调整菌液浓度至 1 × 103 ～ 5 × 103 CFU /mL。
药物敏感测试板的制备 取无菌 96 孔板，于
每排 1 号孔加 RPMI 1640 培养基 100 μL作空白对
照;3 ～ 12 号孔各加新鲜配制的菌液 100 μL;2 号
孔分别加菌液和受试药物，菌液和受试药物的总体
积为 200 μL。2 ～ 11 号孔逐级倍比稀释，12 号孔
只加菌液 100 μL，不含药物，作为阳性对照。
棋盘式微量稀释法［5］ 合用的两种药物于
96 孔板上以二维棋盘的纵 (A至 H)横 (2 至 11)
两方向分别进行 2 倍的倍比稀释。例如覆盆子提
取物与另一种抗真菌药物氟康唑合用后，使得氟
康唑的终浓度为 64、32、16、8、4、2、1、0． 5、0． 25
和 0． 125 g /mL，覆盆子提取物的终浓度为 10、5、
2． 5、1． 25、0． 625、0． 313、0． 16、0． 08、0． 04、0． 02
和 0． 01 mg /mL。与覆盆子提取物合用的其他抗
真菌药物 (酮康唑、咪康唑、伊曲康唑)的终浓度
为 0． 125 ～ 64 g /mL。
最低抑菌浓度 (MIC 值)的判定 在 35℃恒
温箱中，念珠菌培养 48 h 后用酶标分析仪于 630
nm测各孔 OD 值。根据 2009 年临床试验标准化
研究所 (CLSI)提出的 M27-A3 方案［6］:与阳性对
照孔比，以 OD值下降 80%以上的最低浓度孔中的
药物浓度为 MIC80(真菌生长 80%被抑制时的药物
浓度)。当药物的 MIC80值超过测定浓度范围时，
MIC80值高于最高浓度 64 μg /mL 时，计为“＞ 64
μg /mL”;MIC80值为最低浓度或在最低浓度以下
时，均计为“≤0． 125 μg /mL”。上述实验均平行操
作 2 ～ 3 次，当 MIC80值能准确重复或只差一个浓度
时才被接受，并以较高浓度作为 MIC80值;当 MIC80
值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合
要求为止。
联合用药的效果评价 部分抑菌浓度指数
(fractional inhibitory concentration index，FICI)是评
价联合用药的两药相互作用方式的主要参数。抑菌
浓度分数 (FIC)分别为每一种药物联合抑菌时所需
最低抑菌浓度 (MIC)与单用时 MIC 的比值，而 FIC
指数 (FICI)则等于两种药物 FIC 之和。本实验选
用目前国外期刊采用的标准:当 FICI≤0． 5 时，两药
的相互作用确定为协同作用;0． 5 ＜ FICI≤4 时为无
关作用;当 FICI ＞4时两药产生拮抗作用［7］。
2 结 果
2． 1 覆盆子不同溶液提取物单用及联合氟康
唑对受试菌 C． albicans 103 的作用
覆盆子的醇提物、水提物、DMSO 提物单用时
对受试菌 C． albicans 103 的 MIC80测定值为大于 10
mg /mL，与氟康唑联合使用后表现出协同作用，
MIC80测定值为 0． 04 mg /mL;并且，氟康唑的 MIC80
测定值由大于 64 μg /mL 降至 0． 125 ～ 0． 5 μg /mL
(见表 1)。
2． 2 覆盆子醇提物单用及联合氟康唑对不同念珠
菌的 MIC80测定结果
以下实验均以覆盆子醇提物为例，单用对敏感
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念珠菌的 MIC80测定值:在 0． 02 ～ 1． 25 mg /mL 之
间，与氟康唑联合使用后有协同关系 (FICI≤0． 5)
MIC80测定值:在 0． 02 ～ 0． 04 mg /mL 之间;并且联
合使用后氟康唑的 MIC80测定值由 0． 25 ～ 2 μg /mL
降至 0． 125 ～ 0． 5 μg /mL。单用对耐药念珠菌的
MIC80测定值:主要集中在 0． 16 ～ 10 mg /mL 之间，
与氟康唑联合使用后有协同关系 (FICI≤0． 5)
MIC80测定值:主要集中在 0． 01 ～ 0． 313 mg /mL 之
间;并且联合使用后氟康唑的 MIC80测定值由大于
64 μg /mL降至 0． 125 ～ 16 μg /mL (见表 2)。
表 1 不同覆盆子提取物单用及联合氟康唑对 C． albicans 103 的作用 (μg /mL)
Tab． 1 Effect of different Rubus idaeus extracts singlely and combination with fluconazole against C． albicans 103 (μg /mL)
覆盆子提取物
单用 MIC80 联合 MIC80
覆盆子提取物 氟康唑 覆盆子提取物 氟康唑
FICI 相互关系
覆盆子醇提物 ＞ 10 000 ＞ 64 39． 06 0． 125 0． 003 协同
覆盆子水提物 ＞ 10 000 ＞ 64 39． 06 0． 500 0． 006 协同
覆盆子 DMSO提物 ＞ 10 000 ＞ 64 39． 06 0． 500 0． 006 协同
表 2 覆盆子醇提物单用和联合氟康唑对不同念珠菌的作用 (μg /mL)
Tab． 2 Effect of Rubus idaeus ethanol extracts singlely and combination with fluconazole against different Candida spp． (μg /mL)
菌 株
单用 MIC80 联合 MIC80
覆盆子醇提物 氟康唑 覆盆子醇提物 氟康唑
FICI 相互关系
实验室 SC5314 156． 25 0． 25 19． 53 0． 125 0． 625 非协同
标准菌 ATTC10231 156． 25 0． 5 19． 53 0． 125 0． 375 协同
临床敏感 C． albicans 465 1 250 0． 5 39． 06 0． 25 0． 531 非协同
念珠菌 C． al杭 113187 1 250 2 19． 53 0． 5 0． 266 协同
C． al杭 112721 156． 25 2 39． 06 0． 5 0． 500 协同
C． parap 90018 19． 53 0． 5 4． 88 0． 5 1． 250 非协同
临床耐药 C． albicans 904 78． 125 ＞ 64 19． 53 0． 125 0． 250 协同
念珠菌 C． albicans 953 1 250 ＞ 64 312． 5 0． 25 0． 250 协同
C． albicans 32 156． 25 ＞ 64 9． 77 16 0． 188 协同
C． albicans 842 156． 25 ＞ 64 9． 77 8 0． 125 协同
C． albicans 557 156． 25 ＞ 64 9． 77 8 0． 125 协同
C． albicans 502 1 250 ＞ 64 19． 53 0． 5 0． 020 协同
C． albicans 103 ＞ 10 000 ＞ 64 39． 06 0． 125 0． 003 协同
C． albicans 100 ＞ 10 000 ＞ 64 39． 06 0． 125 0． 003 协同
C． albicansJ 5 156． 25 ＞ 64 39． 06 0． 5 0． 254 协同
C． albicansJ 28 156． 25 ＞ 64 9． 77 1 0． 070 协同
C． albicansJ 38 156． 25 ＞ 64 19． 53 1 0． 133 协同
C． al杭 112869 1 250 ＞ 64 19． 53 1 0． 023 协同
C． al杭 112678 1 250 ＞ 64 9． 77 1 0． 016 协同
C． krusei 4996 39． 06 64 9． 77 64 1． 250 非协同
C． tropical 2718 ＞ 10 000 ＞ 64 9． 77 1 0． 008 协同
A． fumigatus 7544 ＞ 10 000 ＞ 64 156． 25 ＞ 64 1． 008 非协同
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2． 3 覆盆子醇提物单用及联合不同抗真菌药物对
受试菌 C． albicans 100 的 MIC80测定结果
以受试菌 C． albicans 100 为例，覆盆子醇提物
单用时的 MIC80测定值大于 10 mg /mL，与氟康唑、
酮康唑、伊曲康唑、咪康唑合用后均表现出协同作
用，MIC80测定值为 0． 04 mg /mL;同时，不同唑类药
物的 MIC80测定值由单用时的大于 32 μg /mL 降至
合用后的 0． 125 μg /mL (见表 3)。
表 3 覆盆子醇提物单用及联合不同唑类药物对 C． albicans 100 的作用 (μg /mL)
Tab． 3 Effect of Rubus idaeus ethanol extracts singlely and combination with different azole drugs against C． albicans 100 (μg /mL)
唑类药物
单用 MIC80 联合 MIC80
覆盆子醇提物 唑类药物 覆盆子醇提物 唑类药物
FICI 相互关系
氟康唑 ＞ 10 000 ＞ 64 39． 06 0． 125 0． 003 协同
酮康唑 ＞ 10 000 32 39． 06 0． 125 0． 006 协同
伊曲康唑 ＞ 10 000 ＞ 64 39． 06 0． 125 0． 003 协同
咪康唑 ＞ 10 000 64 39． 06 0． 125 0． 004 协同
3 讨 论
念珠菌是人类最常见的条件致病菌之一，在免
疫缺陷者身上极易发生感染，其中白念珠菌、克柔
念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌等所致感染占
念珠菌病的 95%左右。由于氮唑类药物的广泛使
用已经导致白念珠菌对该类药物耐药现象快速增
多，对药物治疗带来严重威胁。联合用药是目前抗
真菌药的研究热点之一，不仅能够缩短治疗周期、
降低药物毒副作用和剂量，而且还可扩大药物抗菌
谱、避免耐药性的出现［8］。
从 20世纪 20年代开始，人们便开始从中药中寻
找高效低毒的抗真菌中药，由于其副作用小、来源广、
价格低廉、较少出现耐药性等优势，使研究开发抗真
菌中药具备良好前景。至今已发现 300 多种中草药
在试管内有抗真菌活性具有良好的抗真菌作用［9］，
本实验室前期通过筛选 30余种中药提取物对受试菌
株进行体外药物敏感试验，发现覆盆子可以联合唑
类药物有效提高抗真菌活性。覆盆子不同溶液提取
物与氟康唑联合使用后均表现出协同关系，与临床
敏感菌相比，覆盆子醇提物与氟康唑联合后对临床
耐药菌的协同关系更显著，抗真菌作用更明显，MIC80
测定值可从单用时大于 0． 08 mg /mL，降至合用后的
0． 04 mg /mL 以下;除对 C． albican32、C． albican842、
C． albican 557，氟康唑的 MIC80测定值均从大于 64
μg /mL降至 0． 125 ～ 1 μg /mL。另外，覆盆子醇提物
与不同唑类药物合用均有协同关系，其 MIC80测定值
由单用时大于 10 mg /mL降至 0． 04 mg /mL。以上实
验结果可以看出覆盆子提取物本身有一定的抗真菌
作用，而与唑类药物合用后有明显的协同关系，抗真
菌作用明显增强。
中药粗提物中含有多种化学成分，成分与药理
作用都很复杂，受多种因素影响。因此，我们今后
的工作重点是从已经发现的具有抗真菌协同作用
的中药中，利用不同的提取方法提取有效单体成
分，进而对不同的有效成分进行抗真菌机制的研
究。另外还可以针对高效低毒作用机制，设计选择
性作用靶点以减少用药量，进行高通量筛选化合物
或先导化合物，为合成新的抗真菌药物奠定基础。
参 考 文 献
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［9］ 王玲，吕雪莲，孙令，等． 中药提取物对酵母菌抗真菌活性研
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［收稿日期］ 2011-11-24 ［本文编辑］ 王 飞
·7·中国真菌学杂志 2012 年 2 月 第 7 卷 第 1 期 Chin J Mycol，February 2012，Vol 7，No． 1