全 文 ：中国肿瘤生物治疗杂志 http:/ /www． biother． org
Chin J Cancer Biother，Aug． 2012，Vol． 19，No． 4
DOI:10． 3872 / j． issn． 1007-385X． 2012． 04． 007 ·基础研究·
木鳖子醇提物诱导小鼠黑素瘤 B16 细胞分化的作用机制
赵连梅1，韩丽娜2，耿艺曼1，杜彦艳2，刘丽华1，胡彩霞3，单保恩1(1． 河北医科大学 第四医院 科研中心，河北 石家
庄 050011;2． 河北医科大学 第四医院 检验科，河北 石家庄 050011;3． 河北医科大学 第四医院 皮肤性病科，
河北 石家庄 050011)
［基金项目］ 河北省中医药管理局资助项目(No． 2011011)。Project supported by the Foundation of Administration of Traditional Chinese Medicine
in Hebei Province (No． 2011011)
［作者简介］ 赵连梅(1981 －) ，女，内蒙古敖汉旗人，博士生，助理研究员，从事抗肿瘤中药筛选和机制研究。E-mail:Lianmeizhmail@ 163． com
［通信作者］ 单保恩(SHAN Bao-en，corresponding author) ，E-mail:shanbaoen@ 163． com
［网络出版］ http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /31． 1725． R． 20120727． 1048． 002． html
［摘 要］ 目的:探讨木鳖子醇提物(ethanol extract of cochinchina momordica seed，CMSEE)诱导黑素瘤 B16 细胞分化的作用
机制。方法:CMSEE处理 B16 细胞后，瑞氏染色法观察 B16 细胞的形态变化;比色法检测 B16 细胞的黑素含量。Western
blotting检测经 CMSEE 和 p38、ERK 通路抑制剂 SB203580、SD98059 分别处理后 B16 细胞中 p-p38、p-ERK 表达的变化。
结果:CMSEE可诱导 B16 细胞分化，使细胞的黑素量含量明显升高(P ＜ 0． 01) ，10、20、40 μg /ml CMSEE处理组 B16 细胞的黑
素量 D值分别为(0． 057 ± 0． 007)、(0． 173 ± 0． 005)和(0． 249 ± 0． 002) ，而对照组为(0． 037 ± 0． 002)。20 μg /ml CMSEE 处理
B16 细胞后，p-p38 蛋白表达水平明显升高，处理 60 min时的相对表达量最高，为对照组的 5． 6 倍;而 p-ERK 表达水平明显降
低(P ＜ 0． 01) ，处理 60 min时的相对表达量为对照组的 25%倍。p38 通路抑制剂 SB203580 可阻断 CMSEE对 B16 细胞的分化
诱导作用，而 ERK通路抑制剂 SD98059 可增强 CMSEE对 B16 细胞的分化诱导作用。结论:p38 通路和 ERK通路的活化参与
了 CMSEE对 B16 细胞的分化诱导作用。
［关键词］ 木鳖子醇提物;黑素瘤;B16;分化;p38 通路;ERK通路
［中图分类号］ R739． 5;R730． 5 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1007-385X(2012)04-0381-06
Mechanism of differentiation of mouse melanoma B16 cells induced by ethanol
extract of cochinchina momordica seed
ZHAO Lian-mei1，HAN Li-na1，GENG Yi-man1，DU Yan-yan2，LIU Li-hua，HU Cai-xia3，SHAN Bao-en1(1． Research
Center，Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，Hebei，China;2． Clinical Laboratory，
Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，Hebei，China;3． Dermatological Department，Fourth
Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，Hebei，China)
［Abstract］ Objective:To study the mechanism of the differentiation of mouse melanoma B16 cells induced by ethanol
extract of cochinchina momordica seed (CMSEE)． Methods:After treated with CMSEE，morphological changes of B16
cells were observed by Giemsa staining，and melanin level was assessed by colorimetric method． Western blotting was used
to measure the expression changes of phosphorylation p38 (p-p38)and ERK (p-ERK)in B16 cells after treatment with
CMSEE and p38，ERK pathway inhibitors，SB203580 and SD98059． Results:CMSEE could induce the differentiation of
B16 cells． The melanin level in B16 cells was significantly increased after CMSEE treatment (P ＜ 0． 01) ，with D value
being (0． 057 ± 0． 007) ，(0． 173 ± 0． 005)and (0． 249 ± 0． 002)for 10，20 and 40 μg /ml CMSEE and (0． 037 ±
0. 002)for control group． 20 μg /ml CMSEE elevated the level of p-p38 protein and blocked the expression of p-ERK
(P ＜ 0． 01)in B16 cells，and the expression level of p-p38 protein was 5． 6 fold and p-ERK was 0． 25 fold that of the
control group after treatment with CMSEE for 60 min． SB203580，the inhibitor of p38 pathway，blocked CMSEE-induced
B16 cell differentiation，and PD98059，the inhibitor of ERK pathway，elevated CMSEE-induced B16 cell differentiation．
Conclusion:p38 and ERK signal pathway activations are involved in the differentiation of B16 melanoma cells induced by
·183·
中国肿瘤生物治疗杂志，2012 年 8 月，19(4)
CMSEE．
［Key words］ ethanol extract of cochinchina momordica seed(CMSEE) ;melanoma;B16;differentiation;p38 path-
way;ERK pathway
［Chin J Cancer Biother，2012，19(4) :381-386］
诱导分化是指恶性肿瘤细胞在体内外分化诱导
剂作用下，向正常或接近正常细胞方向分化逆转的
现象。其作为恶性肿瘤的一种新型治疗方法，为肿
瘤治疗开辟了一条崭新的途径［1-2］，从天然药物中寻
找肿瘤细胞的诱导分化剂是当前的研究热点之
一［3］。本课题组的前期研究［4］发现，木鳖子醇提物
(ethanol extract of cochinchina momordica seed，CM-
SEE)对多种组织来源的肿瘤细胞系均具有较强的
增殖抑制作用，对黑素瘤 B16 细胞的增殖抑制作用
尤为显著。进一步研究［5］发现，一定浓度范围的
CMSEE能够诱导黑素瘤 B16 细胞的分化，抑制其侵
袭和转移，但具体的作用机制尚不清楚。本研究探
讨了 CMSEE诱导 B16 细胞分化的机制，为 CMSEE
作为分化诱导剂用于临床治疗黑素瘤提供实验依
据。
1 材料与方法
1． 1 材料和试剂
中药木鳖子购自北京同仁堂药店，经河北医科
大学药学院生药教研室鉴定为正品。MTT 试剂盒
购自美国 Sigma 公司;瑞氏(Wrigh-Giemsa)染液购
自 Baso公司;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材
料有限公司;RPMI 1640 和胰蛋白酶购自美国 Gibco
公司;α-黑素细胞刺激素(α-MSH)、MAPK通路特异
性抑制剂 SB203580、PD98059 购自 Sigma公司;p44 /
42MAPK(ERK1 /2)、pho-p44 /42ERK1 /2 (Thr202 /
Tyr204)、pho-p38 MAPK (Thr180 /Tyr182)单克隆抗
体购自 Cell Signaling 公司。p38、JNK 和 GAPDH 多
克隆抗体购自 Santa Cruz 公司。无水乙醇为国产分
析纯。
1． 2 CMSEE的制备和细胞培养
CMSEE的制备参见文献［5］。取一定量的木鳖
子原药材，粉碎后称取 10 g，加入 10 倍体积的 95%
乙醇，室温密闭浸泡 7 d，提取上清液过滤，旋转冷冻
蒸发器减压蒸发成粉状物，所得干粉视为 CMSEE。
使用醇提物时经乙醇溶解，保存于 － 20 ℃冰箱，使
用时用无血清 RPMI 1640 培养基稀释，并使乙醇终
浓度 ＜ 0． 1%。
小鼠黑素瘤 B16 细胞株购自中科院上海细胞
库，以含 100 ml /L 胎牛血清的 RPMI 1640 培养液
(含青霉素 100 U /ml，链霉素 100 μg /ml)于 37 ℃、
5% CO2 培养箱中培养，以 0． 25%的胰蛋白酶消化
细胞传代，取对数生长期细胞用于实验。
1． 3 细胞计数法检测 CMSEE 对肿瘤细胞增殖的
影响
取对数生长期 B16 细胞，调整细胞密度为 1 ×
105 /ml，均匀接种于 96 孔培养板，每孔 90 μl，实验
组各孔加入不同浓度的 CMSEE 和(/或)SB203580、
PD98059 各 10 μl，对照孔加入完全培养基，每组均
设 4 个复孔，置于饱和湿度、37 ℃、5% CO2 培养箱
中培养 48 h后，以 0． 25%的胰蛋白酶消化细胞，离
心后将各培养孔的细胞悬浮于 1 ml 培养基，细胞计
数板下计数每组细胞的数量。计算各培养组细胞平
均数。
1． 4 CMSEE对 B16 细胞形态的影响
取对数生长期的 B16 细胞，调整细胞浓度为
1 × 105 /ml，加入 6 孔培养板中(孔内预先放置灭菌
盖玻片) ，每孔 2 ml，待细胞在盖玻片上贴壁良好
后，加入不同浓度 CMSEE 1 ml(终浓度为 40、20、10
μg /ml)或者 SB203580，继续培养 48 h，倒置相差显
微镜下观察细胞形态学变化;取出玻璃片，生理盐水
冲洗 3 次，晾干，滴加瑞氏染料染色 1 min，加入 3 倍
体积的蒸馏水，吹匀后静置 15 min，用清水冲洗干
净，普通光学显微镜下观察结果。
1． 5 B16 细胞黑素含量的测定［6］
对数生长期 B16 细胞制成单细胞悬液，以每孔
0． 5 × 105 /ml 接种于 6 孔培养板，待细胞贴壁良好
后，加入不同浓度 CMSEE 和 SB203580(终浓度为
10 μg /ml) ，以不加中药 CMSEE 作为对照。将细胞
在 37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养 48 h，弃去
培养液，用生理盐水洗 2 次，0． 25%胰酶消化，收集
细胞，1 200 × g离心 5 min，倾去上清液，细胞团溶于
1 mol /L NaOH(含 10%DMSO)100 μl，转移至 96 孔
培养板内，在 37 ℃水浴保温 1 h 后于 475 nm 处测
光密度值(D) ，每一浓度设立 3 个复孔，结果取平均
值。
1． 6 Western blotting 法检测 p-p38 和 p-ERK 蛋白
表达的变化
取对数期 B16 细胞，加入不同浓度 CMSEE，或
者预先加入 SB203580 或 PD98059 处理 15 min，然
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赵连梅，等． 木鳖子醇提物诱导小鼠黑素瘤 B16 细胞分化的作用机制
后加入不同浓度 CMSEE，于 37 ℃、5% CO2 培养箱
中培养不同时间后，用预冷的 PBS 洗 3 遍，刮下细
胞，蛋白提取试剂盒提取总蛋白，加入一定量的 4 ×
上样缓冲液，沸水浴中煮沸 5 min。用 10% SDS 聚
丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，分离的蛋白电转移至
PVDF膜后，用脱脂牛奶室温封闭 1 h，一抗 p-p38、
p-ERK 4 ℃孵育过夜，PBST洗膜 20 min × 3 次，加入
红外线标记的二抗(IRD 800-LI-COR，Odyssey) ，
37 ℃反应 2 h，PBST 洗膜 20 min × 3 次，用 Odyssey
双色红外荧光扫描系统进行检测。
1． 7 统计学处理
实验数据用 珋x ± s 表示，采用 SPSS13． 0 统计软
件，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采
用 LSD 检验。P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01 表示差异具有
统计学意义。
2 结 果
2． 1 CMSEE对 B16 细胞形态的影响
未经处理的 B16 细胞呈菱形或多边形，形态饱
满，呈重叠生长;10 ～ 40 μg /ml CMSEE 处理过的
B16 细胞体积增大变成梭形，排列成纤维状生长，多
数细胞出现树突状结构，与空白对照组比较，细胞变
稀少，不重叠，为典型的细胞分化状态(图 1)。10 ～
40 μg /ml CMSEE 作用于 B16 细胞 48 h 后，与对照
组相比，细胞数量明显减少，并呈浓度依赖性(P ＜
0． 05 或 P ＜ 0． 01，图 2)。由此证实，10 ～ 40 μg /ml
CMSEE可能诱导了黑素瘤 B16 细胞的分化。
图 1 CMSEE对 B16 细胞形态变化的影响(×200)
Fig． 1 Morphological changes of B16
cells treated with CMSEE (×200)
A:Control;B:10 μg /ml;C:20 μg /ml;D:40 μg /ml
图 2 CMSEE处理 B16 细胞 48 h后的细胞数
Fig． 2 Number of B16 cells after treatment
with CMSEE for 48 h
* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01 vs 0 μg /ml group
2． 2 CMSEE对 B16 细胞黑素产生的影响
对照组 B16 细胞黑素的 D475值为(0． 037 ±
0. 002) ，10、20、40 μg /ml CMSEE 处理组 B16 细胞
黑素的 D475 分别为(0． 057 ± 0． 01)、(0． 173 ±
0. 005)和(0． 249 ± 0． 002) ，明显高于对照组(P ＜
0. 01) ，且 20、40 μg /ml CMSEE 处理组 B16 细胞黑
素含量高于黑素生成刺激激素 α-MSH 对 B16 细胞
黑素生成的刺激作用。由于正常黑素细胞产生黑素
能力高于黑素瘤细胞［7］，因此本实验结果证实了
CMSEE 能够诱导黑素瘤 B16 细胞的分化(图 3)。
图 3 CMSEE对 B16 细胞黑素产生的影响
Fig． 3 Effect of CMSEE on melanin production of B16 cells
* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01 vs control group
2． 3 CMSEE对 B16 细胞MAPK通路中 ERK和 p38
蛋白活化的影响
有研究［6-7］表明，MAPK通路在 B16 细胞的分化
过程中发挥重要的作用。本实验检测了 CMSEE 对
MAPK通路的关键蛋白 p-ERK、p-p38 的表达，结果
(图 4)显示，CMSEE 处理细胞 0、30、60、120、240
min 后，p-p38 蛋白的相对表达量分别为 0． 24 ±
0. 02、0． 38 ± 0． 05、0． 98 ± 0． 06、0． 67 ± 0． 10、0． 59 ±
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中国肿瘤生物治疗杂志，2012 年 8 月，19(4)
0． 05，明显升高(P ＜ 0． 01) ;p-ERK蛋白的相对表达
量分别为 1． 14 ± 0． 03、0． 38 ± 0． 05、0． 98 ± 0． 15、
0. 67 ± 0． 08、0． 59 ± 0． 04，明显降低(P ＜ 0． 01) ;且
均在 60 min 时表达差异最大，而总的 p38 和
ERK1 /2蛋白表达水平没有发生明显的变化。
图 4 CMSEE对 B16 细胞 p38 和 ERK活化的影响
Fig． 4 Effect of CMSEE on activation
of p38 and ERK in B16 cells
2． 4 MAPK通路抑制剂与 CMSEE联用对 B16 细胞
生长和分化的影响
MAPK通路抑制剂处理 B16 细胞，结果显示，对
照组细胞相对数为(1 ± 0． 01) ，CMSEE(20 μg /ml)
处理组 B16 细胞相对数目为(0． 61 ± 0． 03) ;
SB203580(10 μmol /L)处理组细胞相对数为
(0． 98 ± 0． 12) ，SB203580 与 CMSEE 联合处理组
B16 细胞相对数为(0． 79 ± 0． 10) ;PD98059(10
μmol /L)处理组细胞相对数为(0． 59 ± 0． 09) ，
PD98059 与 CMSEE 联合处理组细胞相对数为
(0. 38 ± 0． 05) (图 5)。可见，SB203580 单独作用对
B16 细胞的生长和分化没有影响，但可部分阻断
CMSEE 对 B16 细胞的生长抑制和诱导分化作用。
MEK通路抑制剂 PD98059 可明显抑制 B16 细胞的
生长，增强 CMSEE对 B16 细胞的分化诱导作用。
图 5 CMSEE与 SB203580(SB)和 PD98059(PD)联用对 B16 细胞增殖(A)和分化(B，×200)的影响
Fig． 5 Effect of CMSEE in combination with SB203580 (SB)or
PD98059 (PD)on proliferation (A)and differentiation (B，×200)of B16 cells
＊＊ P ＜ 0． 01 vs control group，△△ P ＜ 0． 01 vs CMSEE group
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赵连梅，等． 木鳖子醇提物诱导小鼠黑素瘤 B16 细胞分化的作用机制
2． 4 MAPK 通路抑制剂与 CMSEE 联用对磷酸化
p38 和 ERK表达的影响
p38 通路抑制剂 SB203580 和 ERK 通路抑制剂
PD98059 分别处理 B16 细胞 15 min后加入 CMSEE，
继续处理细胞 48 h 后发现，SB203580 部分阻断了
CMSEE对磷酸化 p38 蛋白表达的升高作用(P ＜
0. 01) ，对照组 p-p38 蛋白相对表达量为(0． 56 ±
0. 04) ，SB203580 处理组蛋白相对表达量为(0． 21 ±
0． 02) ，CMSEE 处理组细胞 p-p38 蛋白相对表达量
为(0． 93 ± 0． 12) ，而 CMSEE 和 SB203580 联合处理
组的蛋白相对表达量为(0． 40 ± 0． 08)。PD98059 增
强了 CMSEE对磷酸化 ERK 蛋白表达的抑制作用。
对照组 p-ERK 蛋白相对表达量为(0． 46 ± 0． 03) ，
PD98059 处理组蛋白相对表达量为(0． 32 ± 0． 04) ，
CMSEE 处理组细胞 ERK 蛋白相对表达量为
(0． 33 ± 0． 09) ，而 CMSEE 和 PD98059 联合处理组
的蛋白相对表达量为(0． 26 ± 0． 05) (图 6)。由此提
示，p38 通路活性的升高和 ERK 通路活性的降低参
与了 CMSEE对 B16 细胞的分化诱导作用。
图 6 CMSEE与 SB203580(SB)和 PD98059(PD)
联用对 B16 细胞 p38、ERK活化的影响
Fig． 6 Effect of CMSEE in combination with SB203580(SB)
or PD98059(PD)on activation of p38 and ERK in B16 cells
3 讨 论
丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated pro-
tein kinase，MAPK)通路在真核细胞中高度保守，它
的持续激活促进人类各种肿瘤的形成，因此已成为
癌症治疗的候选靶点。Mas 等［8］研究报道，多种黑
素瘤细胞对 MEK通路抑制剂 PD98059 或 U0126 的
刺激敏感，发生凋亡，但正常黑素细胞却产生了凋亡
抵抗，提示 MAPK通路的活性在黑素瘤细胞和正常
黑素细胞中有差异，可作为药物治疗的靶点。近年
也有大量研究［9-11］报道，MAPK 信号通路在黑素瘤
B16 细胞的分化过程中发挥着重要作用。Kataya
等［12］研究证明，鸟嘌呤核苷(guanosine)通过 PKC-
ERK1 /2 通路诱导黑素瘤 B16F10 细胞分化，Keishi
等［13］研究报道，p38 作为 PKA的下游效应通路调控
了植物来源的化合物羽扇豆醇酯(lupeol)对 B16 黑
素瘤 2F2 细胞的分化。Smalley 等［41］研究发现，黑
素生成刺激激素(α-melanocyte stimulating hormone，
α-MSH)诱导 B16 细胞分化时，能使 p-p38 的表达呈
时间依赖性升高，而与 p38 通路抑制剂 SB203580 联
合应用后能够阻断其对 B16 细胞的分化诱导作用，
但尚有通过其他机制诱导黑素瘤细胞分化的研究报
道。Serini等［15］的研究结果显示，DHA(n-3 polyun-
saturated fatty acid docosahexaenoic acid)通过抑制黑
素瘤细胞中 β-catenin 通路，降低 COX-2 和 HuR 的
表达，进而抑制黑素瘤细胞的增殖和促进其分化。
随着人们对天然化合物的抗肿瘤作用的关注，
关于天然化合物诱导肿瘤细胞分化作用的研究报道
开始增多。Tabolacci 等［16］研究表明，从天然植物中
提取的芦荟素(aloin)能够增强顺铂的抗肿瘤细胞
活性，以及转谷氨酰胺酶(transglutaminase)诱导的
黑素瘤细胞的分化。本课题组的前期研究及本实验
研究结果均证实，CMSEE能够诱导黑素瘤 B16 细胞
发生分化，可作为肿瘤细胞分化诱导剂，但具体机制
尚不清楚。本实验研究结果发现，CMSEE 能够抑制
黑素瘤细胞的增殖并增强黑素的生成。尽管近期有
研究［17］表明，黑素的生成可作为细胞外基质介导 E-
cadherin 的活性，从而促进黑素瘤的侵袭和生长，但
是黑素的生成在黑素瘤发生、发展过程中的作用尚
未全面阐明。
CMSEE处理 B16 细胞 30 min 时能明显提高 p-
p38 蛋白的表达水平，降低 p-ERK蛋白表达水平，且
均在 60 min 时达到峰值。进一步实验结果发现，
p38 特异性通路抑制剂 SB203580 抑制了 CMSEE 对
B16 细胞的分化诱导作用，抑制 CMSEE 对磷酸化
p38 蛋白表达的升高作用;而 ERK 通路抑制剂
PD98059 能够增强 CMSEE 对 B16F1 细胞的分化诱
导作用，增强 CMSEE 对磷酸化 ERK 蛋白表达的升
高作用，提示 p38 通路活性的增强和 ERK通路活性
的降低参与了 CMSEE 对 B16 细胞的分化诱导作
用，但其下游核内转录因子转录活性及上游蛋白活
性的改变需要进行进一步的研究探讨。本实验研究
结果提示，CMSEE对黑素瘤 B16 细胞具有分化诱导
·583·
中国肿瘤生物治疗杂志，2012 年 8 月，19(4)
作用，且其机制可能与 CMSEE 调节 MAPK 通路中
ERK和 p38 通路活性的平衡有关，有作为黑素瘤分
化诱导剂的潜力。但是，CMSEE 仍然是一个粗提
物，后继研究对粗提物的具体活性成分发现，
CMSEE中的醛类化合物可能参与了 CMSEE 对黑素
瘤 B16 细胞的分化诱导作用(未发表的结果) ，但是
具体作用效果和如何对 B16 细胞的生长分化发挥
作用尚待进一步研究。
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［收稿日期］ 2012 － 03 － 11 ［修回日期］ 2012 － 05 － 22
［本文编辑］
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王莹
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(本刊编辑部)
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