全 文 ：中国肿瘤生物治疗杂志　htp://www.biother.org
ChinJCancerBiother, Feb.2010, Vol.17, No.1
DOI:10.3872/j.issn.1007-385X.2010.01.003 ·专题报道·
木鳖子醇提物对黑素瘤 B16细胞增殖的抑制及其可能机制
赵连梅 1 ,韩丽娜 1 ,商晓辉 2 ,单保恩 1(1.河北医科大学第四医院 科研中心 ,河北 石家庄 050011;2.河北工程大学
生物医学系 ,河北 邯郸 023312)
[摘　要 ] 　目的:观察木鳖子醇提物(ethanolextractfromcochinchinamomordicaseed, CMSEE)对黑素瘤 B16细胞增殖的影
响 , 初步探讨其作用机制。方法:MTT法和克隆集落形成实验检测 CMSEE对小鼠黑素瘤 B16细胞生长的影响 , 倒置相差显
微镜和瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态学变化 , 流式细胞技术(FCM)检测 B16细胞周期分布和凋亡率的变化 , 比色法检测
CMSEE对 B16细胞黑素生成和酪氨酸酶活性的影响 , RT-PCR法检测 CMSEE对 B16细胞中 C-myc、P38 和 Tyr基因表达的影
响。结果:CMSEE(10 ～ 100 mg/L)明显抑制 B16细胞的增殖(P<0.05, P<0.01), 呈质量浓度和时间依赖性。 10 ～ 40mg/L
CMSEE处理后 , B16细胞呈现典型的细胞分化形态 , 细胞周期阻滞于 G0 /G1期 , 黑素产生和酪氨酸酶活性增加(P<0.01),
C-myc基因表达下调 , P38 和 Tyr基因表达上调;100 mg/LCMSEE处理后的 B16细胞呈现凋亡形态变化 [凋亡率达(37.2 ±
3.29)%] , 黑素生成减少(P<0.05),酪氨酸酶活性降低(P<0.01)。结论:CMSEE体外对 B16细胞增殖有明显的抑制作用 ,
其机制与其低剂量诱导分化和高剂量诱导凋亡有关。
[关键词 ] 　木鳖子醇提物;黑素瘤;B16细胞;增殖抑制;分化;凋亡
[中图分类号 ] 　R739.5;R730.54　　　　[文献标志码 ] 　A　　　　[文章编号 ] 　1007-385X(2010)01-0013-06
[基金项目 ] 　国家自然科学基金资助项目(No.30371753)。 ProjectsupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.30371753)
[作者简介 ] 　赵连梅(1981-),女 ,内蒙古敖汉旗人 ,硕士 ,主要从事中药抗肿瘤研究工作。 E-mail:lianmeizhmail@ 163.com
[通信作者 ] 　单保恩(SHANBao-en, corespondingauthor), E-mail:baoenshan@yahoo.com.cn
Inhibitoryefectofcochinchinamomordicaseedethanolextractonproliferation
ofmelanomaB16 celsanditspossiblemeachanism
ZHAOLian-mei1 , HANLi-na1 , SHANGXiao-hui2 , SHANBao-en1(1.ResearchCenter, FourthHospitalofHebeiMedi-
calUniversity, Shijiazhuang050011, Hebei, China;2.DepartmentofBiotechnology, BiologyMedicalColegeofHebei
UniversityofEngineering, Handan056029, Hebei, China)
[ Abstract] 　Objective:Toinvestigatetheefectofcochinchinamomordicaseedethanolextract(CMSEE)ontheproli
ferationofmelanomaB16celsandtheunderlyingmechanism.Methods:MTTandcloneformationassaywereusedtoas-
sesstheefectofCMSEEonthegrowthofB16 cels.MorphologicalchangesofB16celswereobservedunderphase-con-
trastmicroscopeandGiemsastaining.Celcycleandapoptosisratewereexaminedbyflowcytometry(FCM).Theefect
ofCMSEEonmelaninproductionandtyrosinaseactivityofB16 celswasasessedbycolorimetry.TheefectofCMSEEon
theexpresionofC-myc, P38 , andTyrgeneswasexaminedbyRT-PCR.Results:CMSEE(10-100 mg/L)inhibitedthe
proliferationofB16 celinadose-andtime-dependentmanner.Aftertreatmentwith10-40 mg/LCMSEE, B16 cels
showedtypicaldiferentiationmorphology, andmelaninproductionandtyrosinaseactivitywereincreased.B16 celstrea-
tedwith100 mg/LCMSEEshowedapoptoticmorphology, decreasedmelaninproductionandtyrosinaseactivity.B16 cel
numberinG0 /G1 phasewassignificantlyincreased(P<0.01);C-mycmRNAexpressionwasdown-regulated, andP38,
TrymRNAexpressionwasup-regulatedinB16 celsaftertreatmentwith10-40 mg/LCMSEE.Conclusion:CMSEEcan
markedlyinhibittheproliferationofmelanomaB16 cels, whichisrelatedtoinductionofdiferentiationandpromotionof
apoptosisofB16 cels.
[ Keywords] 　cochinchinamomordicaseedethanolextract(CMSEE);melanoma;B16 cel;anti-proliferation;difer-
entiation;apoptosis
[ ChinJCancerBiother, 2010, 17(1):13-18] 　　
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中国肿瘤生物治疗杂志 , 2010年 2月 , 17(1)
　　黑素瘤是恶性程度很高的皮肤癌 , 是黑素细胞
去分化而产生的恶性肿瘤 。目前化学治疗黑素瘤的
效果较差 ,其突出的特点为对多数化疗药耐药 ,转移
率和致死率高 ,患者生存期仅为 6 ～ 10个月 [ 1-2] 。因
此 ,探求黑素瘤发生 、发展 、侵袭与转移的机制 ,寻找
敏感性强 、作用靶点多的有效药物 ,一直是肿瘤学者
们关注的热点。近年来 ,从植物药资源中寻找抗肿瘤
活性成分受到了广泛的关注。中草药木鳖子始载于
宋《开宝本草》,是一味散血热 、除痈毒之要药 ,临床上
主要用于治疗疮痈肿痛 、多种关节炎及皮肤病 ,疗效
肯定 。目前临床上发现木鳖子入药对多种癌症具有
治疗作用[ 3-4] ,但是关于该药物的体内外抗黑素瘤的
效果及机制 ,迄今国内外尚未见报道。本课题组前期
研究发现 ,木鳖子醇提物(cochinchinamomordicaseed
ethanolextract, CMSEE)对黑素瘤细胞具有生长抑制
作用 。本实验探讨木鳖子醇提物对恶性黑素瘤 B16
细胞的作用效果和机制 ,为木鳖子醇提物抗黑素瘤的
开发和利用提供有价值的实验依据。
1　材料与方法
1.1　主要实验材料
中药木鳖子购自北京同仁堂药店 ,经河北医科
大学药学院生药学教研室鉴定为正品 。 PI染料 、
MTT试剂盒购自美国 Sigma公司 , 瑞-姬 (Wrigh-
Giemsa)染液购自 Baso公司 ,胎牛血清购自杭州四
季青生物工程材料有限公司 , RPMI1640和胰蛋白
酶购自美国 Gibco公司 , 左旋多巴胺 (Levodopa, L-
Dopa)购自 Sigma公司 。 RT-PCR反转录和扩增试
剂盒购自 Promega公司。无水乙醇为国产分析纯 。
1.2　木鳖子醇提物的制备和细胞培养
取一定量的木鳖子原药材 ,粉碎后称取 10g,加
入 10倍体积的 95%乙醇 ,室温密闭浸泡 7 d,纱布滤
去渣滓 ,加入 3%活性炭 , 80 ℃蒸煮脱色 30 min,
2 500×g离心 20 min,去除沉淀 ,取上清液用旋转冷
冻蒸发器减压蒸发成粉状物 ,所得干粉视为木鳖子醇
提物纯品。木鳖子醇提物纯品经无水乙醇溶解 ,储存
质量浓度为 2 000mg/L,保存于 -20℃冰箱 ,使用时
用无血清 RPMI1640培养基稀释 ,并使乙醇终体积分
数 <0.1%。小鼠黑素瘤细胞株 B16购自中科院上海
细胞库 , 以含 100 ml/L胎牛血清的 RPMI1640培养
液(含青霉素 100U/ml, 链霉素 100μg/ml)于 37℃、
5% CO2培养箱中培养 ,以 0.25%的胰蛋白酶消化细
胞传代 ,取对数生长期细胞用于实验。
1.3　MTT法检测 CMSEE对 B16细胞生长的抑制率
取对数生长期 B16细胞 ,调密度至 1×105 /ml,
均匀接种于 96孔培养板 ,每孔 180 μl,实验组各孔
加入不同质量浓度的木鳖子醇提物各 20 μl,使其终
质量浓度分别为 100、40、20、10 mg/L;阴性对照孔
加入完全培养基 , 同时设乙醇对照组(加入培养液
和同等稀释质量浓度的乙醇),每组均设 4个复孔 ,
置于饱和湿度 、37 ℃、5%CO2培养箱中培养 24、48、
72 h后 ,各孔加入 MTT(5mg/ml)20 μl,继续培养 4
h,弃去培养上清 ,每孔加入 DMSO150 μl,混匀后以
测定波长 492 nm、参考波长 620 nm检测各孔光密
度(D)值 ,计算对细胞增殖的抑制率 ,并根据软件计
算出 24、48、72h的 IC50。
细胞生长抑制率(inhibitoryrate, IR;%)=(对
照组 D值 -实验组 D值)/(对照组 D值 -空白对
照组 D值)×100%。
1.4　克隆形成实验观察 CMSEE对 B16细胞克隆
形成的影响
取对数生长期 B16细胞 , 每孔接种 50个细胞。
呈现肉眼可见的克隆后弃去培养基 , 倒置相差显微
镜下照相并作克隆计数 。
1.5　倒置相差显微镜观察 CMSEE对 B16细胞形
态学的影响
调整 B16细胞密度至 1 ×105 /ml,加入 6孔板
中(孔内预先放置盖玻片),每孔 2 ml,待细胞在盖
玻片上贴壁后 ,加入 CMSEE1 ml(终质量浓度分别
为 100、40、20、10 mg/L),培养 48 h,倒置相差显微
镜下观察细胞形态学变化;取出玻片 ,生理盐水冲洗
3次 ,晾干 ,滴加瑞-姬染料染色 1min,加入 3倍体积
的蒸馏水 ,吹匀后静置 15 min,冲洗干净 ,显微镜下
观察结果 。
1.6　比色法检测 B16细胞中黑素的生成[ 5]
B16细胞以每孔 2×105细胞 /2 ml接种于 6孔
板 ,待细胞贴壁后 ,加入 CMSEE1 ml(终质量浓度分
别为 100、40、20、10 mg/L),以不加中药作为对照。
将细胞在 37 ℃、5%CO2 、饱和湿度条件下培养 48
h,倾去培养液 ,用生理盐水洗 2次 , 0.25%胰酶消
化 ,收集细胞 , 1 200×g离心 5 min,倾去上清液 ,细
胞团溶于 1μmol/LNaOH(含 10%DMSO)300μl,转
移至 96孔培养板内 ,在 37 ℃水浴保温 1 h,于 405
nm处测光密度值(D值)。每个质量浓度设立 3个
复孔 ,取其平均值。
1.7　比色法检测 B16细胞酪氨酸酶的活性 [ 6-7]
96孔板加入 B16单细胞悬液 ,使 8×103个 /孔 ,
待贴壁后加入含 CMSEE的培养基 ,使其终质量浓度
为 100、40、20、10 mg/L,培养 48h后弃去培养基 ,用
pH7.4的 PBS洗涤 2次 ,每孔加 1%TritonX-100溶
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赵连梅 , 等.木鳖子醇提物对黑素瘤 B16细胞增殖的抑制及其可能机制
液 50μl,迅速置 -80℃冻存 30min,随后室温融化使
细胞完全破裂 , 37℃预温后加入 1%左旋多巴溶液
(用 PBS稀释 ,使其 pH值 <7)10μl, 37℃反应 2h后
测定 490nm处光密度(D)值 ,以不加中药的细胞孔
作为对照组 。结果分析以 D490值表示酪氨酸酶的相
对含量。实验样品 D值 /对照样品 D值的比值 >1.0
为 CMSEE处理组酪氨酸酶活性高于对照组 ,比值≤
1.0为 CMSEE处理组酪氨酸酶活性低于对照组。
1.8　流式细胞技术检测 B16细胞的细胞周期和凋亡率
分别以 100、40、20、10 g/ml的 CMSEE作用于
B16细胞 24 h,收集细胞 ,用预冷的 70%乙醇固定
12 h;离心弃固定液 , PBS重悬 5 min后 300目筛网
过滤;加入 PI染液 , 4℃避光染色 30min,流式细胞
仪(Beckman)分析细胞周期及凋亡率。
1.9　RT-PCR检测 B16细胞中 C-myc、P38和 P53
mRNA的表达
收集对照组和 10、20、40 mg/LCMSEE处理 24
h的 B16细胞 5 ×106个 , 用 TRIzol试剂提取总
RNA,反转录(RT),取 3 μlcDNA进行 PCR扩增。
PCR引物由上海杰瑞生物工程有限公司合成 ,引物
序列见表 1。扩增产物经 1.5%凝胶电泳 ,以 Gel-
pro凝胶分析软件对电泳谱带 mRNA进行基因表达
差异分析 ,以目的基因灰度值 /β -actin条带灰度值
的比值表示 mRNA水平。实验重复 3次 。
表 1　RT-PCR检测所需要的引物序列
Tab.1　PrimersequencesofgenesinRT-PCRassay
Gene Primersequence(sense) Primersequence(anti-sense) Tempatureofrenaturation(t/℃)
Length
(bp)
P38 5′-ATCGTGAAGTGCCAGAAG-3′ 5′-TAGCCTGTCATCTCATCATC-3′ 53.8 200
Tyr 5′-GCCTCCAGTTACCAACAC-3′ 5′-CTCATAGTCCTCAGCATAGC-3′ 53.7 250
C-myc 5′-AATTCAGGGATCTGGTCACG-3′ 5′-CTGTGGAGAAGAGGCAAACC-3′ 59.8 355
β-actin 5′-TGAGACCTTCAACACCCCAG-3′ 5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3′ 55.0 312
1.10　统计学处理
实验数据用 x±s表示 , 采用 SPSS13.5统计软
件 ,进行单因素方差分析和 LSD,以 P<0.01为差异
有统计学意义。
2　结　果
2.1　CMSEE对 B16细胞增殖的影响
增殖抑制实验结果显示 , 10 ～ 100 mg/L的
CMSEE均能显著抑制 B16细胞的生长 , 且抑制
率呈质量浓度和时间依赖性 , 100 mg/L的 CM-
SEE对 B16细胞的增殖抑制率显著高于其他药
物组(P<0.01 , 表 2);CMSEE作用 24、48、72 h
的半数 抑制质量浓度 (IC5 0 )分 别为 38.87、
31.94、28.23 mg/L。
表 2　木鳖子醇提物对黑素瘤 B16细胞增殖的抑制作用(%)
Tab.2　InhibitoryeffectofCMSEEonproliferationofmelanomaB16 cells(%)
CMSEE(ρB/mg· L-1) 24 h 48 h 72h
Ctrl 1.24±0.32 5.82±0.03 6.24±0.05＊
10 20.01±3.32＊ 20.24±3.25＊ 24.95±1.27＊
20 28.97±4.42＊ 37.01±4.01＊ 40.62±4.38＊＊
40 45.97±5.83＊＊ 49.78±3.71＊＊ 52.17±6.17＊＊
100 77.54±4.91＊＊■■ 82.97±3.47＊＊■■ 84.06±8.38＊＊■■
　　　　＊P<0.05, ＊＊P<0.01 vsCtrl;■■P<0.01 vsotherdruggroups
2.2　CMSEE对 B16克隆形成的影响
各组细胞常规培养 3 d后 , RPMI1640培养基对照
组形成了肉眼可见的克隆 , CMSEE各质量浓度组均未
出现明显的克隆。培养至第 6天时 RPMI1640培养基
对照组出现满视野克隆集落 , 10、20、40 mg/LCMSEE
处理组可见细胞克隆集落形成 ,但细胞集落数及集落
内细胞数量显著少于培养基对照(图 1)。 100 mg/L
CMSEE处理组细胞未见克隆集落形成 ,仅见漂浮细胞。
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中国肿瘤生物治疗杂志 , 2010年 2月 , 17(1)
图 1　CMSEE抑制 B16细胞克隆形成(×200)
Fig.1 CMSEEinhibitedcloneformationofB16cells(×200)
A:Ctrl;B:10 mg/LCMSEE;
C:20mg/LCMSEE;D:40mg/LCMSEE
2.3　CMSEE作用致 B16细胞形态的改变
结果显示 ,未经处理的 B16细胞呈菱形或多边
形 ,形态饱满 ,较大 ,细胞核染色均匀 ,核仁清晰可
见;10 ～ 40 mg/LCMSEE处理过的 B16细胞体积增
大变成梭形 , 排列成纤维状生长 ,多数细胞出现树
突状结构 , 与空白对照组比较 , 细胞变稀少 , 不重
叠 ,为典型的细胞分化状态;100 mg/LCMSEE处理
组细胞变圆 ,胞质浓缩 ,核着色不均匀 ,核仁裂解 ,呈
现典型的凋亡细胞形态学改变(图 2)。
2.4　CMSEE对 B16细胞黑素生成和酪氨酸酶活性的影响
从表 3中可以看出 ,与未处理组相比 , 10、20、40
mg/L的 CMSEE能使 B16细胞黑素生成能力增强 ,
100 mg/L的 CMSEE使黑素生成能力下降 ,差异有
统计学意义 。说明 10、20、40 mg/L的 CMSEE使
B16黑素细胞向正常黑素细胞方向分化 , 而 100
mg/L的 CMSEE则诱导 B16细胞发生凋亡 。酪氨酸
酶是生物体合成黑素的关键酶 , 通过调控其活性可
以调控黑素的生成量。
图 2　CMSEE处理 B16细胞 48 h后的形态改变(×400)
Fig.2　MorphologicalchangesofB16cellstreatedwithCMSEEfor48 h(×400)
A:Ctrl;B:10mg/LCMSEE;C:20 mg/LCMSEE;D:40 mg/LCMSEE;E:100 mg/LCMSEE
　　检测酪氨酸酶活性结果表明 , 10、20、40 mg/L
CMSEE处理的 B16细胞酪氨酸酶活性明显高于对
照组 ,且呈质量浓度依赖性;而 100 mg/LCMSEE可
使 B16黑素细胞酪氨酸酶活性降低 。
2.5　CMSEE对 B16细胞周期和凋亡的影响
经 10 ～ 40 mg/LCMSEE处理 48h, B16细胞凋
亡率未发生明显变化;而 100 mg/LCMSEE处理后
B16细胞凋亡率明显升高(P<0.01,表 4)。检测结
果同时显示 , 10 ～ 40 mg/LCMSEE作用使 B16细胞
周期阻滞在 G0 /G1期 , 100 mg/LCMSEE作用致细
胞周期阻滞在 G2 /M期(图 3,表 4)。
2.6　CMSEE对 B16细胞 C-myc、P38和 TyrmRNA
表达的影响
RT-PCR扩增产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳的
结果显示 ,经 10 ～ 40 mg/LCMSEE处理 48 h后 ,
B16细胞 C-mycmRNA表达水平降低 , P38 和 Tyr
mRNA表达水平升高 ,且均呈质量浓度依赖性(图
4,表 5)。
表 3　CMSEE对 B16细胞产生黑素和酪氨酸酶
活性的影响(n=4, x±s)
Tab.3　EfectsofCMSEEonmelaninproduction
andtyrosinaseactivityofB16cells(n=4, x±s)
CMSEE
(ρB/mg· L-1)
Melanin
(D405)
Tyrosinaseactivity
(Multiple)
Ctrl 0.037±0.002 1.00
10 0.057±0.007＊ 1.39±0.32＊　
20 0.173±0.005＊＊ 2.00±0.44＊　
40 0.249±0.002＊＊ 2.80±0.52＊＊
100 0.020±0.004＊ 0.57±0.34＊＊
　　＊ P<0.05, ＊＊P<0.01 vsCtrl
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赵连梅 , 等.木鳖子醇提物对黑素瘤 B16细胞增殖的抑制及其可能机制
图 3　FCM检测 CMSEE处理 24 h对 B16细胞凋亡率的影响
Fig.3　EffectofCMSEEonapoptoticrateofB16 cellsafter24 hasdetectedbyFCM
A:Ctrlgroup;B:10 mg/LCMSEE;C:20 mg/LCMSEE;D:40mg/LCMSEE;E:100 mg/LCMSEE
表 4　CMSEE对 B16细胞凋亡和周期分布的的影响(n=4, x±s, %)
Tab.4　EffectsofCMSEEonapoptosisandcelcycleofB16 cels(n=4, x±s, %)
CMSEE
(ρB/mg· L-1)
Cellcycle(%)
G0 /G1 S G2 /M
Apoptoticrate
(%)
Ctrl 36.4±7.9 56.3±8.5 7.3±2.3 6.17±2.46
10 50.4±8.0＊ 51.2±8.6 2.1±0.4 2.22±0.37　　
20 58.9±5.7＊ 38.3±3.4＊ 8.1±1.8 4.45±0.94　　
40 66.2±6.4＊ 25.5±7.9＊ 11.0±1.5 3.96±0.73　　
100 23.6±4.3　 45.6±5.7 31.3±5.2＊ 37.20±3.29＊＊
　　＊P<0.05, ＊＊P<0.01, vsCtrl
图 4　CMSEE对 B16细胞 C-myc、P38
和 TyrmRNA表达的影响
Fig.4　EffectsofCMSEEonC-myc, P38 ,
andTyrmRNAexpressionsinB16 cels
1:Ctrlgroup;2:10 mg/LCMSEE;
3:20mg/LCMSEE;4:40 mg/LCMSEE
表 5　CMSEE对 B16细胞 C-myc、P38
和 TyrmRNA表达的影响
Tab.5　EffectsofCMSEEonmRNAexpressionof
C-myc, P38 , andTyrinB16 cells
CMSEE
(ρB/mg· L-1) TyrmRNA C-mycmRNA P38 mRNA
Ctrl 0.84±0.03 1.02±0.04 0.17±0.02
10 0.72±0.13 0.89±0.12＊ 0.67±0.07＊
20 0.51±0.03＊ 0.57±0.03＊ 0.85±0.04＊
40 0.27±0.05＊ 0.24±0.01＊ 0.98±0.11＊＊
　　＊P<0.05, ＊P<0.01 vsCtrl
3　讨　论
本研究发现 ,中药木鳖子醇提物能显著抑制恶
性黑素瘤 B16细胞的增殖和集落形成能力 ,且该作
用呈时间和质量浓度依赖性 。细胞形态观察结果显
示 ,较高质量浓度的 CMSEE(100mg/L)具有显著诱
导黑素瘤 B16细胞凋亡的作用 ,而较低质量浓度的
CMSEE(10 ～ 40 mg/L)则促进了恶性黑素瘤细胞向
正常上皮细胞的分化。
小鼠黑素瘤 B16细胞经较低质量浓度 CMSEE
作用后 ,细胞形态发生明显改变 ,细胞体积增大 ,细
胞核大小均一 ,核浆比例减少 ,出现树突状和网状结
构 ,呈梭形排列 ,此为典型正常黑素细胞的形态 [ 8] 。
为了进一步验证 CMSEE对 B16黑素细胞的分化诱
导作用 ,本研究检测了标志黑素细胞发生分化的关
键指标 , 即黑素的合成能力和酪氨酸酶活性 。黑素
瘤细胞与正常黑素细胞相比 ,黑素合成能力降低 ,当
被诱导分化后 ,黑素合成能力增加 [ 9-10] 。酪氨酸酶
是黑素合成的限速酶 ,控制黑素的合成 ,具有多巴氧
化酶和酪氨酸羟化酶的功能 [ 11] 。本研究发现 , B16
细胞经 CMSEE(10 ～ 40 mg/L)作用后 ,黑素合成能
力和酪氨酸酶活性均明显增加 ,同时酪氨酸酶 Tyr
基因的 mRNA表达水平升高 ,且呈质量浓度依赖
性;说明 CMSEE促进黑素合成与其提高酪氨酸酶
的活性有关 ,且酪氨酸酶活性的增强可能与 CMSEE
·17·
中国肿瘤生物治疗杂志 , 2010年 2月 , 17(1)
介导的 Tyr基因表达水平升高相关 ,进一步证明了
CMSEE对 B16细胞的诱导分化作用 。研究中还发
现 ,经 100 mg/L的 CMSEE作用后 , B16细胞显示
典型的凋亡形态学变化 ,黑素合成和酪氨酸酶活性
明显降低 ,说明较高剂量的 CMSEE抑制 B16细胞
增殖是通过诱导其凋亡实现的 。
　　众多研究表明 , 应用诱导剂量提高癌细胞分
化 、抑制增殖循环周期中某一固定时相 , 是目前降
低肿瘤恶性程度 , 减少其转移和复发的最为有效的
治疗方法 ,并且有人提出 G1期是细胞分化期 , 也是
药物作用的敏感期。本实验证实 , 低剂量 CMSEE
作用于 B16肿瘤细胞后 , 细胞堆积于 G1期 , 进入 S
期 DNA合成细胞少 , 相应进入 G2期的细胞数量减
少 , 证明了 CMSEE对 B16细胞诱导分化的作用。
p38信号转导通路是 MAPK通路最重要的分支
之一 ,是细胞信号从细胞表面到细胞核内的一条重
要途径 ,在肿瘤细胞的增殖 、凋亡和分化中发挥重要
的作用 。研究证实 , p38MAPK通路激活和 P38蛋白
激酶活性的增强介导了黑素瘤 B16 2F2细胞的分
化 [ 12-13] 。本实验结果也显示 , 经 CMSEE(10 ～ 40
mg/L)处理后 , B16细胞 P38 mRNA表达升高 , 提示
CMSEE诱导黑素瘤 B16细胞分化可能与其激活了
P38MAPK通路有关 ,但尚需更深入的实验来证实 。
C-myc是 MAPK家族下游的重要蛋白之一 ,也是一
种可使细胞无限增殖和获永生化功能 、促进细胞分
裂的蛋白 ,其表达产物在调节细胞生长 、分化或恶性
转化中发挥作用 [ 14-15] 。 Smith等 [ 16]研究了 C-myc的
亮氨酸拉链区 ,该区介导各种转录因子的二聚作用 ,
在亮氨酸重复部位的突变能显著降低 C-myc抑制
鼠红白血病(MEL)细胞分化能力;同样地 ,此区的
插入突变能消除 C-Myc的转化活性 。正是这些
C-myc结构成分的表达阻止了细胞进入细胞周期 ,
从而抑制许多细胞系的分化。本研究发现 , CMSEE
能下调 C-myc基因的表达 ,说明 C-myc基因表达的
变化参与了 CMSEE对 B16细胞的分化作用。
本研究结果显示 ,木鳖子醇提物能够诱导恶性
黑素瘤 B16细胞分化和凋亡 ,可作为潜在的分化诱
导剂用于治疗恶性黑素瘤 ,但是木鳖子醇提物中诱
导分化和凋亡作用的单体化合物及具体的诱导分化
和凋亡的机制尚需深入的探究 。
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[收稿日期 ] 　 2009-11-25 [修回日期 ] 　 2009-12-30
[本文编辑 ] 　韩　丹
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