全 文 ：食用菌学报２０１６．２３（２）：６～１１
收稿日期：２０１６－０５－０９原稿；２０１６－０５－２７修改稿
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３）食用菌优异种质性状形成的遗传基础（２０１４ＣＢ１３８３０５）、公益性行业
（农业）科研专项（２０１５０３１３７）、吉林省教育厅“十三五”科学技术研究项目（２０１６１９１）资助
作者简介：王新新（１９９０－），女，在读硕士，主要从事食用菌病害研究。
＊本文通讯作者　Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｕｌｉ９６６＠１２６．ｃｏｍ
ＤＯＩ：１０．１６４８８／ｊ．ｃｎｋｉ．１００５－９８７３．２０１６．０２．００２
双孢蘑菇种质ＳＳＲ分子身份证的构建
王新新，李　丹，宋　冰，郭玉秀，苏文英，戴月婷，刘　源，付永平，李　玉＊
（吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心，吉林长春１３０１１８）
摘　要：分子身份证是作物品种数字化的ＤＮＡ指纹。本文采用从１００对ＳＳＲ引物中筛选出的８对引物、对
从国内外收集的８０份栽培及野生双孢蘑菇（Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｉｓｐｏｒｕｓ）种质的扩增谱进行分析，合并同类型菌株后得
到２９份代表菌株，再根据不同代表菌株对８对ＳＳＲ引物产生的不同扩增谱型构建出这２９份不同双孢菇菌株
的分子身份证，可为区分和鉴别双孢蘑菇的品种提供参考。
关键词：双孢蘑菇；ＳＳＲ标记；分子身份证
双孢蘑菇（Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｉｓｐｏｒｕｓ）又称为白蘑菇、洋蘑菇，有很高的食、药用价值［１］。早在１７世纪已开
始栽培，是世界现今人工栽培范围最广、产量最大的食用菌之一［２］。双孢蘑菇的商业化、规模化栽培模
式近几年在国内发展地更加迅速，我国双孢蘑菇产量和出口量已经跃居世界第一［３］。
我国现今广泛用于商业栽培的菌株大部分是从Ｕ１和Ｕ３演化而来［４］，遗传背景狭窄。且目前，食
用菌主要是采用形态学特征为分类依据，虽然在一定程度上形态特征能在类群层面进行很好的划分，
但子实体的形态性状容易受到外界环境条件的影响而不稳定，如果结合其它分子生物学等辅助手段将
能更好地区分和鉴别不同的食用菌菌株［５］。
近年来分子身份证的概念逐渐发展。分子身份证与指纹图谱的功能相同，但分子身份证作为数字
化、网络化的 ＤＮＡ 指纹，在用于品种检索、对比时能够更加直观方便［６］。ＳＳＲ （Ｓｉｍｐｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｒｅｐｅａｔ）是目前一种广泛应用于遗传育种中的分子标记，相对其它标记，其具有操作简便快速、多态性
高、稳定性和重复性好、识别率高等特点［７］，并被广泛应用于油菜［８］、葡萄［９］、水稻［１０］、大豆［１１］等品种鉴
定中。利用ＳＳＲ标记结合相关数量遗传分析手段，可以进行种质资源的鉴定、亲缘关系的判断、种质特
异性的评价［１２］。而将若干ＳＳＲ位点上的条带按一定规则转化成类似人指纹的图谱就称之为ＳＳＲ 指
纹图谱，数字化的指纹图谱即可构建各品种的分子身份证［１０］。笔者尝试了采用ＳＳＲ标记对国内外不
同来源的双孢蘑菇种质建立分子身份证，希望为科学鉴定、合理利用双孢蘑菇种质资源提供参考依据，
同时为在双孢蘑菇新品种审定与鉴定以及双孢蘑菇分子标记辅助育种提供一定的理论依据。
１　材料与方法
１．１供试材料
　　８０份双孢蘑菇菌株收集自中国（５７份，其中野生２６份）、美国（１３份）、英国（１份）、德国（３份）、韩
国（１份）、荷兰（４份）、西班牙（１份）等地，其中栽培菌株５４个，野生菌株２６个，保存于吉林农业大学食
药用菌教育部工程研究中心，由福建省农业科学院食用菌研究所及四川省农业科学院土壤肥料研究所
提供，详细信息和菌株编号见表１。
１．２ＤＮＡ提取
　　表１中菌株分别于ＰＤＡ固体培养基上，２５℃条件下培养７～１０ｄ，刮取新鲜双孢蘑菇菌丝体１００ｍｇ
第２期 王新新，等：双孢蘑菇种质ＳＳＲ分子身份证的构建
左右，加入液氮迅速冷冻，后按新型植物基因组ＤＮＡ提取试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司，北
京）说明提取其基因组ＤＮＡ，－２０℃保存。
表１　供试双孢蘑菇菌株信息
Ｔａｂｌｅ　１　Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ　ｔｅｓｔ　ｓｔｒａｉｎｓ
编号
Ｎｏ．
原保藏号
Ｏｒｉｇｉｎａｌｃｏｄｅ
特性
Ｃｈａｒａｃｔｅｒ
来源
Ｏｒｉｇｉｎ
编号
Ｎｏ．
原保藏号
Ｏｒｉｇｉｎａｌｃｏｄｅ
特性
Ｃｈａｒａｃｔｅｒ
来源
Ｏｒｉｇｉｎ
Ａ１ Ｍｉｎ－１＊ Ａ，Ｗ 福建Ｆｕｊｉａｎ　 Ａ４１ Ｙｉｎｇｘｉｕ－１＊ Ｓ，Ｗ 浙江 Ｚｈｅｊｉａｎｇ
Ａ２ Ａｓ１６７１＊ Ａ，Ｗ 福建Ｆｕｊｉａｎ　 Ａ４２ Ａｇ２３ａ＊ Ｓ，Ｗ 英国 Ｅｎｇｌａｎｄ
Ａ３ Ａ１５＊ Ｓ，Ｗ 美国 Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　 Ａ４３　 ２０９４＊＊ Ｓ，Ｂ 西藏 Ｔｉｂｅｔ
Ａ４ Ａｓ４６０７＊ Ｓ，Ｗ 福建Ｆｕｊｉａｎ　 Ａ４４ Ｄａｓｈａｎ－１＊＊ Ｓ，Ｂ 山西Ｓｈａｎｘｉ
Ａ５ Ａｓ３００３＊ Ｓ，Ｗ 福建Ｆｕｊｉａｎ　 Ａ４５ Ａ－０２＊，Ａ，Ｗ　 Ａ，Ｗ 上海Ｓｈａｎｇｈａｉ
Ａ６ Ｚｈｅｎｏｎｇ－１＊ Ｓ，Ｗ 浙江 Ｚｈｅｊｉａｎｇ　 Ａ４６ ＡＨ８３０１＊ Ｓ，Ｗ 上海Ｓｈａｎｇｈａｉ
Ａ７ Ａｓ２７９６＊ Ｓ，Ｗ 福建Ｆｕｊｉａｎ　 Ａ４７ ＡＨ８３０２＊ Ｓ，Ｂ 上海Ｓｈａｎｇｈａｉ
Ａ８ Ｔ２５８＊ Ａ，Ｗ 福建Ｆｕｊｉａｎ　 Ａ４８ Ｊ５＊ Ｓ，Ｗ 上海Ｓｈａｎｇｈａｉ
Ａ９ Ａｓ２９８７＊ Ｓ，Ｗ 福建Ｆｕｊｉａｎ　 Ａ４９ Ｆ－０１＊ Ｓ，Ｗ 上海Ｓｈａｎｇｈａｉ
Ａ１０ Ｗ２０００＊ Ｓ，Ｗ 福建Ｆｕｊｉａｎ　 Ａ５０　 ２０１４０６２３１４＊ Ｓ，Ｗ 韩国 Ｋｏｒｅａ
Ａ１１ Ａｓ１７８９＊ Ａ，Ｗ 福建Ｆｕｊｉａｎ　 Ａ５１ Ｔａｉｓｈａｎ　Ｉ＊ Ｓ，Ｂ 泰安 Ｔａｉａｎ
Ａ１２ Ａｓ４５８０＊ Ｓ，Ｗ 福建Ｆｕｊｉａｎ　 Ａ５２ Ｆ４４１＊ Ｓ，Ｂ 美国Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ
Ａ１３　 ８２１３＊ Ｓ，Ｗ 上海Ｓｈａｎｇｈａｉ　 Ａ５３ Ａ－１４＊ Ａ，Ｗ 美国Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ
Ａ１４ ＺＡ＊ Ａ，Ｗ 德国 Ｇｅｒｍａｎｙ　 Ａ５４ Ｔ１２３８７＊＊ Ｓ，Ｗ 云南 Ｙｕｎｎａｎ
Ａ１５ Ｐｓｕ３２４＊ Ｓ，Ｗ 美国 Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　 Ａ５５ Ｍｏｊｉａ－１＊ Ｓ，Ｂ 武汉 Ｗｕｈａｎ
Ａ１６ Ｕ３＊ Ｓ，Ｗ 荷兰 Ｈｏｌａｎｄ　 Ａ５６ Ｄａｚｏｎｇｇｕ＊ Ａ，Ｂ 武汉 Ｗｕｈａｎ
Ａ１７ ＭＳＢ＊ Ｓ，Ｗ 台湾 Ｔａｉｗａｎ　 Ａ５７ ＡＧＡＢ－０１－１＊＊ Ｓ，Ｂ 四川Ｓｉｃｈｕａｎ
Ａ１８ Ｆ４＊ Ｓ，Ｗ 德国 Ｇｅｒｍａｎｙ　 Ａ５８ ＡＧＨＹ０３－１＊＊ Ｓ，Ｂ 四川Ｓｉｃｈｕａｎ
Ａ１９ Ａｇ５＊ Ｓ，Ｗ 合肥 Ｈｅｆｅｉ　 Ａ５９ Ａ１２＊ Ｓ，Ｗ 美国Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ
Ａ２０ Ｍ－２＊ Ｓ，Ｗ 台湾 Ｔａｉｗａｎ　 Ａ６７ ＡｇＲＨＳ２３５＊＊ Ｓ，Ｂ 四川Ｓｉｃｈｕａｎ
Ａ２１　 １０２－２＊ Ｓ，Ｗ 上海Ｓｈａｎｇｈａｉ　 Ａ６８ ＡｇＬＨ８７５＊＊ Ｓ，Ｂ 四川Ｓｉｃｈｕａｎ
Ａ２２ Ｓ４６＊ Ｓ，Ｗ 福建Ｆｕｊｉａｎ　 Ａ６９ ＡｇＲＨＳ２３２＊＊ Ａ，Ｂ 四川Ｓｉｃｈｕａｎ
Ａ２３　 ０２＊ Ａ，Ｗ 荷兰 Ｈｏｌａｎｄ　 Ａ７０ ＡｇＲＨＳ６１＊＊ Ｓ，Ｂ 四川Ｓｉｃｈｕａｎ
Ａ２４ ＭＥ＊ Ｓ，Ｗ 美国Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　 Ａ７２ ＡｇＲＨＳ１８１＊＊ Ｓ，Ｂ 四川Ｓｉｃｈｕａｎ
Ａ２５ Ｓ１３０Ａ＊ Ａ，Ｗ 美国Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　 Ａ７４ ＡｇＬＨ８２６＊＊ Ｓ，Ｂ 四川Ｓｉｃｈｕａｎ
Ａ２６　 １３Ｄ＊ Ｓ，Ｗ 福建Ｆｕｊｉａｎ　 Ａ７５ ＡｇＲＨＳ２３１９＊＊ Ｓ，Ｂ 四川Ｓｉｃｈｕａｎ
Ａ２７ Ｃ１３＊ Ｓ，Ｂ 美国Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　 Ａ７６ ＡｇＨＳ７２＊＊ Ｓ，Ｂ 四川Ｓｉｃｈｕａｎ
Ａ２８　 ２０８Ｐ＊ Ｓ，Ｗ 美国Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　 Ａ７７ ＡｇＲＨＳ２３３＊＊ Ｓ，Ｂ 四川Ｓｉｃｈｕａｎ
Ａ２９　 ００７２＊ Ｓ，Ｗ 美国Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　 Ａ７８ ＡｇＲＨＳ２３８＊＊ Ｓ，Ｂ 四川Ｓｉｃｈｕａｎ
Ａ３０　 １６３＊ Ｓ，Ｗ 上海Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　 Ａ７９ ＡｇＬＨ８７７＊＊ Ｓ，Ｂ 四川Ｓｉｃｈｕａｎ
Ａ３１ Ｕ１＊ Ｓ，Ｗ 荷兰 Ｈｏｌａｎｄ　 Ａ８０ ＡｇＬＨ８９＊＊ Ｓ，Ｂ 四川Ｓｉｃｈｕａｎ
Ａ３２ ＰＳＵ３１０＊ Ｓ，Ｗ 美国Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　 Ａ８１ ＡｇＳＱ８３＊＊ Ｓ，Ｂ 四川Ｓｉｃｈｕａｎ
Ａ３３　 １２６＊ Ｓ，Ｗ 荷兰 Ｈｏｌａｎｄ　 Ａ８２ ＡｇＲＨＳ２３３８＊＊ Ｓ，Ｂ 四川Ｓｉｃｈｕａｎ
Ａ３４ Ｆ２０＊ Ｓ，Ｗ 德国 Ｇｅｒｍａｎｙ　 Ａ８４ ＡｇＨＳ１７＊＊ Ｓ，Ｂ 四川Ｓｉｃｈｕａｎ
Ａ３５ Ｍ－１＊ Ｓ，Ｗ 西班牙Ｓｐａｉｎ　 Ａ８５ ＡｇＲＨＳ２３１＊＊ Ｓ，Ｂ 四川Ｓｉｃｈｕａｎ
Ａ３６ Ｘｉｎｚｈｕａｎｇ－３＊ Ｓ，Ｗ 上海Ｓｈａｎｇｈａｉ　 Ａ８６ ＡｇＲＨＳ１３２＊＊ Ｓ，Ｂ 四川Ｓｉｃｈｕａｎ
Ａ３７ ＭＢ９９＊ Ａ，Ｂ 美国Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　 Ａ８８ ＡｇＬＨ８６＊＊ Ｓ，Ｂ 四川Ｓｉｃｈｕａｎ
Ａ３８ ＡＳ－１５＊ Ｓ，Ｗ 美国Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　 Ａ８９ ＡｇＲＨＳ２３３３＊＊ Ｓ，Ｂ 四川Ｓｉｃｈｕａｎ
Ａ３９ Ｗ１９２＊ Ｓ，Ｗ 福建Ｆｕｊｉａｎ　 Ａ９０ ＡｇＲＨＳ１１２＊＊ Ｓ，Ｂ 四川Ｓｉｃｈｕａｎ
Ａ４０ Ｚｏｎｇｘｉｕ－１＊ Ｓ，Ｂ 浙江 Ｚｈｅｊｉａｎｇ　 Ａ９１ ＡｇＬＨ８８＊＊ Ｓ，Ｂ 四川Ｓｉｃｈｕａｎ
＊为栽培菌株，＊＊为野生驯化菌株；Ａ为气生，Ｓ为匍匐；Ｗ 子实体白色，Ｂ子实体棕色
＊ａｎｄ＊＊ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｃｕｌｔｉｖａｒｓ　ｏｒ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｆｒｕｉｔ　ｂｏｄｉｅｓ　ｃｏｌｅｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｗｉｌｄ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；Ａ　ａｎｄ　Ｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ａｅｒｉａｌ　ｏｒ　ｔｒａｉｌｉｎｇ
（ｓｔｏｌｏｎ）ｔｙｐｅ　ｍｙｃｅｌｉａ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；Ｗ　ａｎｄ　Ｂ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｗｈｉｔｅ－ｏｒ　ｂｒｏｗｎ－ｃｏｌｏｒｅｄ　ｆｒｕｉｔ　ｂｏｄｉｅｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ
７
食　用　菌　学　报 第２３卷
１．３ＳＳＲ引物设计
　　从ＪＧＩ数据库中搜索并下载双孢蘑菇 Ｈ９７基因组数据（ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０）（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ－ｐｓｆ．
ｏｒｇ／．），利用 ＭＩＳＡ （ｈｔｔｐ：／／ｐｇｒｃ．ｉｐｋ－ｇａｔｅｒｓｌｅｂｅｎ．ｄｅ／ｔｏｏｌｓ．ｐｈｐ）搜索ＳＳＲ，搜索标准为：二、三、四、
五、六核苷酸的最少重复次数大于等于５次。利用引物设计软件Ｐｒｉｍｅｒ　３．０在含有ＳＳＲ位点的序列
中设计引物，共设计１００对引物，这些ＳＳＲ引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
１．４ＳＳＲ引物筛选
　　选取４株来自欧洲和中国的栽培与野生双孢蘑菇菌株Ａ７、Ａ１６、Ａ４３、Ａ５４，分别以它们的基因组ＤＮＡ
为模板进行ＳＳＲ引物初筛。ＰＣＲ反应体系：２μＬ　１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ
２＋ ｐｌｕｓ，ｐＨ＝７），２μＬ　ｄＮＴＰ
Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍｍｏｌ／Ｌ），０．３μＬ上游引物（５０ｐｍｏｌ／Ｌ），０．３μＬ下游引物（５０ｐｍｏｌ／Ｌ），０．３μＬ基因组
ＤＮＡ，０．２５μＬ　Ｔａｑ （５Ｕ／Ｌ），ｄｄＨ２Ｏ补足２０μＬ体积。反应条件：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ、
６０℃退火３０ｓ、７２℃延伸３０ｓ、３０个循环；７２℃后延伸１０ｍｉｎ。使用丙烯酰胺∶甲叉双丙（１９∶１）制备聚丙
烯酰胺凝胶，２２０Ｖ恒压电泳１～１．５ｈ后用硝酸银染色。
１．５菌株扩增实验和数据处理与分析
　　根据４个菌株对引物的扩增结果，筛选出扩增条带稳定、多态性丰富且区分度高的ＳＳＲ分子标记，
分别对所有供试菌株进行扩增实验。
根据供试菌株引物扩增片段对应的分子量大小，按从大到小依次统计数据，有条带记为１，无条带
则记为０，构建零一矩阵并基于ＵＰＧＭＡ进行菌株的遗传相似度分析；按照相似度分析结果，将相似度
１００％的菌株分为一组，根据菌株栽培范围及普遍程度在每组中选择一个菌株作为代表。
分析每对引物对所有菌株扩增产生的不同条带类型，分别编码为１－０，并根据所有引物获得条带类
型的数据构建菌株的分子身份证。
２　结果与分析
　　根据４个菌株对引物的筛选结果，通过多次扩增实验及不同引物组合，最终选取８对扩增条带稳
定、带型丰富且区分度高的ＳＳＲ分子标记（见表２）。这些引物对所有供试菌株进行扩增后得到６０个
表２　多态性ＳＳＲ引物
Ｔａｂｌｅ　２　Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ＳＳＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ
引物名称
Ｍａｒｋｅｒ
ＳＳＲ结构
ＳＳＲ　ｍｏｔｉｆ
引物序列
Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５－３）
片段大小
Ｓｉｚｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｌｏｎｅｄ　ａｌｅｌｅ（ｂｐ）
ＡｂＳＳＲ００５ （ＧＡＴＧＡＧ）６
Ｆ－ＣＴＣＴＧＧＧＡＴＡＴＧＧＡＣＧＡＧＧＡ
Ｒ－ＣＣＴＣＴＴＣＡＣＣＴＴＧＡＣＣＣＴＣＡ
１１８
ＡｂＳＳＲ０１３ （ＴＡ）６
Ｆ－ＧＡＣＴＧＣＣＴＧＡＴＴＧＡＣＧＧＡＴＴ
Ｒ－ＴＣＣＧＡＣＴＣＣＧＡＣＡＴＣＣＴＡＴＣ
１６２
ＡｂＳＳＲ０１５ （ＧＡ）７
Ｆ－ＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＧＡＡＧＧＡＡＡＣ
Ｒ－ＴＣＣＴＣＧＧＴＴＴＣＧＡＣＴＧＴＡＣＣ
２３８
ＡｂＳＳＲ０１６ （ＴＣ）１２
Ｆ－ＴＧＴＣＴＧＧＴＴＴＴＧＣＴＣＡＣＧＴＣ
Ｒ－ＴＣＡＧＣＡＣＡＣＴＴＡＡＴＣＧＣＡＣＡ
２４２
ＡｂＳＳＲ０１８ （ＣＡＴ）６
Ｆ－ＴＧＧＣＴＣＴＴＴＡＣＡＧＣＣＴＴＧＧＴ
Ｒ－ＴＧＣＡＧＡＴＧＴＧＧＴＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧ
１２２
ＡｂＳＳＲ０８４ （ＧＡＡ）６
Ｆ－ＣＧＡＣＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＣＴＴＣＣＴ
Ｒ－ＡＡＣＧＡＧＧＧＡＡＡＧＧＴＣＧＡＴＴＴ
２３４
ＡｂＳＳＲ６＊ （ＧＣＴ）８
Ｆ－ＡＣＣＡＣＡＴＴＣＴＧＧＡＡＡＡＣＧＡＡ
Ｒ－ＴＴＡＡＴＧＣＴＣＴＴＧＧＣＴＴＣＧＡＣ
１８１
ＡｂＳＳＲ３６＊
（ＧＡＡＧ）４（ＧＡＡＡＡＧ）
（ＧＡＡＧ）
Ｆ－ＣＧＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＡＣＴＧＡＧ
Ｒ－ＡＣＡＡＣＡＡＡＡＴＣＧＴＣＧＴＧＡＧＧ
１４８
＊引物源自参考文献［１３］
＊Ｐｒｉｍｅｒｓ　ａｓ　ｉｎ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ［１３］
８
第２期 王新新，等：双孢蘑菇种质ＳＳＲ分子身份证的构建
多态性条带。据此结果对８０份菌株进行遗传多样性分析，获得系统发育树图１。如图所示，在遗传相
似系数为２６％时，该８对引物准确的将供试８０份双孢蘑菇菌株分为两大类群，一个类群包括５４株传
统栽培菌株，另一类群包括２６株野生菌株；在遗传相似系数为１００％时，分为大小２９个类群，每个类群
含有菌株数１～１２不等，其中１７个类群由单一菌株组成，剩下的６３份菌株分为１２类，每类选择１株具
代表性菌株（带星号角标）构建其分子身份证。
虚线以上为栽培菌株、以下为野生菌株；＊菌株为每组选出的代表菌株
Ｓｔｒａｉｎｓ　ａｂｏｖｅ　ａｎｄ　ｂｅｌｏｗ　ｔｈｅ　ｄｏｔｔｅｄ　ｌｉｎｅ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｃｕｌｔｉｖａｒｓ　ａｎｄ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ｓｔｒａｉｎｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；＊ｓｔｒａｉｎｓ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ　ｏｆ　ｅａｃｈ　ｇｒｏｕｐ
图１　基于ＳＳＲ标记的双孢蘑菇系统发育树
Ｆｉｇ．１　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｏｆ　Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ　ｔｅｓｔ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ＳＳＲ　ｄａｔａ
　　分析每个引物对供试菌株的扩增结果，筛选出的８对引物对本实验的供试菌株的标准扩增图谱，
见图２。
图２　８对ＳＳＲ引物对供试菌株的标准扩增图谱
Ｆｉｇ．２　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｂａｎｄ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｓｔａｎｄａｒｄｓ　ｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ　ｔｅｓｔ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｂｙ　ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ　ＳＳＲ　ｐｒｉｍｅｒ　ｐａｉｒｓ
　　按照图２的标准扩增图谱，将每个样品的８对引物产生的标准带型进行组合，即可构成双孢蘑菇
９
食　用　菌　学　报 第２３卷
２９个特异性菌株的分子身份证（见表３）。其中引物 ＡｂＳＳＲ６及 ＡｂＳＳＲ３６引自ＦＯＵＬＯＮＧＮＥ［１３］于
２００９年文章引物，其余６对引物为本文新开发的多态性引物；由此，每个菌株的分子身份证由８位数字
组成，分别对应上述的８对ＳＳＲ引物，不同数字代表引物扩增出带型在标准扩增图谱中的编号，８位数
字从左到右的顺序对应图２的引物顺序依次分别是 ＡｂＳＳＲ００５、ＡｂＳＳＲ０１３、ＡｂＳＳＲ０１５、ＡｂＳＳＲ０１６、
ＡｂＳＳＲ０１８、ＡｂＳＳＲ０８４、ＡｂＳＳＲ６和 ＡｂＳＳＲ３６。以Ａ３为例，其分子身份证ＩＤ 为３２３２２１１３，表示在上
述引物顺序下第１个引物的第３种带型，第２个引物的第２种带型，第３个引物的第３种带型，依此类
推，到第８个引物的第３种带型为止。
表３　２９个特异菌株的分子身份证
Ｔａｂｌｅ　３　ＳＳＲ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＩＤ（ＳＳＲ　ＭＩＤ）ｃｏｄｅｓ　ｆｏｒ　２９ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｉｓｐｏｒｕｓ　ｓｔｒａｉｎｓ
菌株名称
Ｓｔｒａｉｎ　Ｎｏ．
分子身份证号
ＳＳＲＭＩＤ
菌株名称
Ｓｔｒａｉｎ　Ｎｏ．
分子身份证号
ＳＳＲＭＩＤ
菌株名称
Ｓｔｒａｉｎ　Ｎｏ．
分子身份证号
ＳＳＲＭＩＤ
Ａ３　 ３２３２２１１３ Ａ７　 １１２１１２２１ Ａ１４　 ２３２３２３１４
Ａ１６　 １１１１１２２１ Ａ２２　 ３２３１１２２１ Ａ２７　 ４４４２２１１５
Ａ２９　 １５６４４３４１ Ａ３１　 ３１１２２１１３ Ａ３２　 ２３２１２３１４
Ａ３３　 ２２５５１１１２ Ａ３５　 ３３２２２１１３ Ａ４２　 １１２３１２２１
Ａ４３　 ５６３６１２３２ Ａ４４　 ６６５２３４３２ Ａ４７　 ７８７７３１６６
Ａ５３　 ３２３２６３１３ Ａ５４　 ８８３２５５３２ Ａ５７　 ９６８８１４３７
Ａ５８　 ０８３９６５３２ Ａ６７　 ６４３２４４３２ Ａ６８　 ６６６９３４３２
Ａ６９　 ６６６２３３３２ Ａ７０　 ８６３２３３３２ Ａ７９　 ６４３２１２５２
Ａ８０　 ６６３８６３３２ Ａ８２　 ６４６２４２３２ Ａ８４　 ８４６５３２３２
Ａ８８　 ６６３９３３３２ Ａ９１　 ８６６５３２５２
ＳＳＲ分子标记由８位数组成，从左到右的数字分别代表了８对引物扩增产物的带型编号（标准带型见图２），引物顺序为 ＡｂＳＳＲ００５、
ＡｂＳＳＲ０１３、ＡｂＳＳＲ０１５、ＡｂＳＳＲ０１６、ＡｂＳＳＲ０１８、ＡｂＳＳＲ０８４、ＡｂＳＳＲ６、ＡｂＳＳＲ３６
ＳＳＲ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＩＤｓ（ＳＳＲ　ＭＩＤ）ｃｏｎｓｉｓｔ　ｏｆ　ｅｉｇｈｔ　ｄｉｇｉｔ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｂａｎｄ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ｓｈｏｗｎ　ｉｎ　Ｆｉｇ．
２）ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｉｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｉｇｈｔ　ＳＳＲ　ｐｒｉｍｅｒ　ｐａｉｒｓ　ＡｂＳＳＲ００５，ＡｂＳＳＲ０１３，ＡｂＳＳＲ０１５，ＡｂＳＳＲ０１６，ＡｂＳＳＲ０１８，ＡｂＳＳＲ０８４，
ＡｂＳＳＲ６ａｎｄ　ＡｂＳＳＲ３６
３　讨论
　　ＦＯＵＬＯＮＧＮＥ［１４］等使用１４对双孢蘑菇ＳＳＲ引物对７５株传统及新育成双孢蘑菇商业菌株进行
遗传多样性进行研究，结果显示仅存在１３个特异菌株，且大部分源于Ｕ１和Ｕ３。该研究结果说明现今
世界范围双孢蘑菇的主要栽培菌株的来源比较单一，且遗传背景非常狭窄［１５］。本实验中５４份栽培菌
株中仅１６份特异菌株的结果与之相符。
明确种质资源的遗传背景是利用该种质进行育种研究的重要基础，现在的分子身份证可以在一定
程度上简单直观的分辨其相似程度。例如高粱种质９２０９７和哈Ｒ６５７，其分子ＩＤ分别是６５５２４５２４４３５
和６５５４４３２４４３５，具有很大的相似性，两份种质具有相同的母本 Ｒ１１７，亲缘关系较近，均由黑龙江省农
业科学院作物育种研究所育成，因而表现出相似的分子ＩＤ［１６］；本实验中Ａ７和Ａ１２的分子ＩＤ分别是
１１２１１２２１和１１１１１２２１仅一处不同，二者均为双孢蘑菇菌株０２和８２１３杂交子代，亲缘近、分子ＩＤ几乎
一致。由此可见，利用分子标记技术对双孢蘑菇的菌种进行分子水平的鉴定，结合农艺性状进行综合
分析［１６］，种质资源的分子ＩＤ 可做为种质创新和品种选育的重要参考信息，这对双孢蘑菇的菌种利用
和保护，以及功能基因的开发具有重要的意义。但是单纯的分子身份证是较为片面的，并不能完全代
表一个品种的所有信息；且本实验中仅采用了ＳＳＲ引物，若要对类群内菌株进行准确划分，还需借助其
它分子标记进行全面深入研究。
参考文献
［１］王泽生，廖剑华，陈美元，等．双孢蘑菇遗传育种和产业发展［Ｊ］．食用菌学报．２０１２，１９（３）：１－１４．
［２］王贤樵．双孢蘑菇定向育种［Ｊ］．福建食用菌，１９９０，１（１）：３－４．
０１
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Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｒｅｐｅａｔ－ｂａｓｅｄ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＩＤ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ
Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｉｓｐｏｒｕｓ　Ｓｔｒａｉｎｓ
ＷＡＮＧ　Ｘｉｎｘｉｎ，ＬＩ　Ｄａｎ，ＳＯＮＧ　Ｂｉｎｇ，ＧＵＯ　Ｙｕｘｉｕ，ＳＵ　Ｗｅｎｙｉｎｇ，ＤＡＩ　Ｙｕｅｔｉｎｇ，
ＬＩＵ　Ｙｕａｎ，ＦＵ　Ｙｏｎｇｐｉｎｇ，ＬＩ　Ｙｕ＊
（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｅｄｉｂｌｅ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｆｕｎｇｉ，
Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ，Ｊｉｌｉｎ　１３０１１８，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＩＤ （ｄｉｇｉｔａｌ　ＤＮＡ　ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ）ｓｙｓｔｅｍ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ＳＳＲ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｆｏｒ　ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ　ａｎｄ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ　Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｉｓｐｏｒｕｓ　ｃｕｌｔｉｖａｒｓ　ａｎｄ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｉｓ　ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ．Ｅｉｇｈｔ　ＳＳＲ　ｐｒｉｍｅｒ　ｐａｉｒｓ，ｓｅｌｅｃｔｅｄ
ｆｒｏｍ　ａ　ｐｏｏｌ　ｏｆ　１００ｐｒｉｍｅｒ　ｐａｉｒｓ，ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｅｍｐｌｏｙｅｄ　ｔｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ　ａ　ｔｏｔａｌ　ｏｆ　ｅｉｇｈｔｙ　Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ　ｃｕｌｔｉｖａｒｓ
ａｎｄ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｈｉｃｈ，ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎｓ，ｆｏｒｍｅｄ　２９ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｇｒｏｕｐｓ．ＳＳＲ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＩＤ
ｃｏｄｅｓ　ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ａｎ　ａｓｓｅｍｂｌａｇｅ　ｏｆ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｂａｎｄ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ａｓｓｉｇｎｅｄ　ｔｏ　ｅａｃｈ
ｔｅｓｔ　ｓｔｒａｉｎ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｉｓｐｏｒｕｓ；ＳＳＲ　ｍａｒｋｅｒ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＩＤ
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