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蒙古口蘑多糖抗氧化活性及其对血管的保护作用



全 文 :2014年 9月 内蒙古大学学报(自然科学版) Sept. 2014
第45卷第5期 Journal of Inner Mongolia University(Natural Science Edition) Vol.45 No.5
  文章编号:1000-1638(2014)05-0498-05    DOI:10.13484/j.nmgdxxbzk.20140510
蒙古口蘑多糖抗氧化活性及
其对血管的保护作用

包 良1,2,白海鹏1,萨朝夫1,李瑞娟1,
席其乐木格1,阿木日沙那2,阿拉坦高勒1
(1.内蒙古大学生命科学学院,呼和浩特010021;
2.呼和浩特职业学院生物化学研究所,呼和浩特010051)
摘要:为了观察蒙古口蘑多糖(Mongolia Tricholoma Polysaccharide,MTP)对低密度脂蛋白
(LDL)氧化的影响及其在抗内皮细胞凋亡的作用.采用DPPH法检测 MTP的清除自由基活
性.将LDL分为 MTP处理组和未处理组,经Cu2+氧化处理后,ELISA试剂盒检测它们被氧
化程度.同时用这两组被氧化的LDL(ox-LDL)刺激血管内皮细胞,用荧光倒置显微镜和流
式细胞仪检测细胞凋亡.实验结果显示 MTP具有很高的抗氧化活性,MTP可显著抑制LDL
的氧化,抑制血管内皮细胞的凋亡和血管内皮的损伤,从而抑制动脉粥样硬化.
关键词:蒙古口蘑多糖;抗氧化;血管内皮细胞;凋亡
中图分类号:Q256  文献标志码:A
  蒙古口蘑(Tricholoma mongolicum),又称草原白蘑、查干蘑菇,是一种我国北方草原特有的,富
含营养成分的大中型优质食用菌.蒙古口蘑在调脂、抗动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)方面有肯
定疗效,在高血糖、高脂血症和AS的治疗中具有很大的潜在功效.但其抗动脉粥样硬化的确切机制
尚未明确.本研究通过测定蒙古口蘑多糖(Mongolia Tricholoma Polysaccharide,MTP)的抗氧化活
性,观察其在低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)被氧化修饰过程中的作用,探讨其可能的
保护血管、抗AS的作用机制.
1 材料与方法
1.1 材料
蒙古口蘑子实体,采自内蒙古呼伦贝尔草原,自然风干以后研磨成粉末.
主要试剂 低密度脂蛋白购自南京建成生物工程研究所.二苯代苦味酰肼(DPPH),人氧化型低
密度脂蛋白(oxLDL)ELISA检测试剂盒购自美国Santa cruz公司.细胞凋亡和坏死检测试剂盒An-
nexin-V-FLUOS Staining Kit购自罗氏诊断产品有限公司.
主要的仪器有荧光倒置显微镜,流式细胞仪,全自动酶标仪.
1.2 方法
1.2.1 蒙古口蘑多糖的提取和纯化
称取蒙古口蘑子实体粉末3g置于50ml的三角瓶中,用无水乙醇加热回流提取3h,进行脱脂处
* 收稿日期:2013-01-29
基金项目:内蒙古自然科学基金项目(2011MS0502);内蒙古自治区高等学校科学技术研究项目(NJZY12293)
作者简介:包 良(1982-),男(蒙古族),讲师,2012级博士研究生.E-mail:baobaoliang@126.com.
通信作者:阿拉坦高勒(1960-),男,(蒙古族),教授,博士,博士生导师.E-mail:bigaole@imu.edu.cn.
理.脱脂后过滤得到的残渣再加蒸馏水至30ml,放入水浴锅中90℃加热6h.将反应液转到离心管,
3000r/min离心10min,取上清.反复提取2次,将上清液混合后加入3倍体积的无水乙醇,4℃沉淀过
夜.3000r/min离心10min,弃上清,用Sevage法(氯仿∶正丁醇=4∶1)除蛋白,反复进行4次至无蛋
白层.经醇沉淀,依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤.最后得到的沉淀即为多糖.
1.2.2 多糖含量测定
将标准葡萄糖105℃干燥至恒重后准确称取20mg,置于500ml容量瓶中,加蒸馏水至刻度,分别
吸取0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml及1.8ml置于试管中,各以超纯水补至
2.0ml,苯酚—硫酸法[1]检测糖含量.即每个试管加入6%苯酚溶液1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀,室
温静置30min后于490nm波长处测定光吸收值,以2.0ml蒸馏水代替葡萄糖作为空白.以葡萄糖浓
度为横坐标,吸光值为纵坐标作标准曲线.
将1.2.1中所得多糖加超纯水溶解至浓度为0.1mg/ml,用苯酚—硫酸法测定多糖含量,代入回
归方程计算出样品中的多糖含量.
1.2.3 MTP的抗氧化活性的测定
将DPPH以无水乙醇为溶剂配制为6×10-5 mol/L的溶液,将 MTP以超纯水为溶剂分别配
成1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml,各取100μL置于96孔酶标板,分别加入200μL浓
度为6×10-5 mol/L的DPPH溶液,震荡混匀后室温下静置10min,517nm处测吸光度.每一个样品
平行做3个复孔,取平均值,计算自由基清除率及自由基清除率为50%时各组分的浓度,即IC50.超
纯水作为阴性对照,维生素C作为阳性对照.
自由基清除率=1-[(A-B)/A0]×100%,
其中A0 为阴性对照(200μL DPPH+100μL超纯水)的吸光度,A为样品与DPPH 反应后的吸
光度,B为样品(200μL无水乙醇+100μL样品)的吸光度.
1.2.4 MTP对LDL氧化修饰的影响
将新鲜分离的人血清LDL分为 MTP处理组和未处理组.前者先用0.5mg/ml的 MTP 37℃温
育12h,后者则不用 MTP处理,加入相应的超纯水.然后二者均用25μmol/L的CuSO4 溶液37℃氧
化修饰6h,最后用1mmol/L EDTA终止修饰.未经处理的LDL作为对照.用人氧化型低密度脂蛋白
(oxLDL)ELISA检测试剂盒检测ox-LDL含量.
1.2.5 MTP对ox-LDL诱导的血管内皮细胞凋亡的影响
将人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cels,HUVEC)传到6孔板内,细胞
覆盖率达到60%-70%时用无血清培养基饥饿处理8h.用待测药物刺激细胞24小时,去除培养基,
每孔加入100μL Annexin-V-FLUOS,15-25℃孵育10-15min,立即在荧光倒置显微镜上观察.流式
细胞仪检测时,先将细胞用胰蛋白酶消化下来,用PBS洗一遍,1000r/min离心5min,去掉上清后,用
100μL Annexin-V-FLUOS和Propidium iodide(PI)的混合溶液重悬细胞,15-25℃孵育10-15min,
加入5ml培养基后,上机分析.
2 结果与分析
2.1 MTP的提取及含量测定
热水浸提法提取蒙古口蘑中多糖,将得到的粗多糖溶液进行醇沉淀后,依次用无水乙醇、丙酮和
乙醚洗涤沉淀.最后得到浅黄色的固体,为纯化后的多糖.经苯酚—硫酸法测定,得多糖的含量为
92%,为口蘑子实体干重的0.97%.
2.2 蒙古口蘑多糖的抗氧化活性的检测
MTP对DPPH自由基具有较好的清除作用,且随着多糖浓度的增加对DPPH自由基的清除能
力逐渐加强,表明多糖用量与清除率存在量效关系.表1和表2分别为维生素C和 MTP浓度梯度稀
释后对DPPH自由基的清除率.从表中可看出,MTP对6×10-5 mol/L DPPH自由基的半数清除浓
994第5期 包 良 等 蒙古口蘑多糖抗氧化活性及其对血管的保护作用
度(IC50)为3.01mg/ml.
表1 不同浓度维生素C对DPPH
(6×10-5 mol/L)自由基的清除率
Table 1  DPPH radical(6×10-5 mol/L)
scavenging effect of Vitamine C
浓度(mg/ml) 清除率%
1.761×10-1  95.62%
1.761×10-2  94.14%
1.761×10-3  48.9%
1.761×10-4  19.45%
1.761×10-5  17.37%
1.761×10-6  16.17%
表2 不同浓度 MTP对DPPH
(6×10-5 mol/L)自由基的清除率
Table 2 DPPH radical(6×10-5 mol/L)
scavenging effect of MTP
浓度(mg/ml) 清除率%
1  23.26%
2  34.85%
3  49.4%
4  60.09%
5  66.55%
2.3 蒙古口蘑多糖对低密度脂蛋白氧化作用和促细胞凋亡作用的影响
用人氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)ELISA检测试剂盒对1.2.4中提到的3种溶液进行检测.如
图1所示,MTP处理组的oxLDL含量明显低于未处理组,说明 MTP能够显著抑制LDL的被氧化
作用.
用上述3种溶液刺激 HUVEC后,Annexin-V-FLUOS染色细胞,用流式细胞仪检测.结果如图
2所示,氧化修饰的LDL对 HUVEC的凋亡作用明显高于未氧化的LDL.用 MTP抑制其氧化后诱
导细胞凋亡作用显著降低.同样处理的细胞用荧光倒置显微镜观察,结果如图3所示.A和B、C和
D、E和F分别为对照组、氧化处理组、给药组的荧光观察图和可见光观察结果.箭头所指的是被染色
的凋亡细胞.从图中也可看出与上述同样的结果.
图1 MTP对LDL氧化的影响
Fig.1 Effect of MTP on LDL oxidation
图2 ox-LDL诱导细胞凋亡作用(细胞流式仪)
Fig.2 ox-LDL induced cels apoptosis
detected by flow-cytometry
005 内蒙古大学学报(自然科学版) 2014年
A和B、C和D、E和F分别为对照组、氧化处理组、给药组的荧光观察图和可见光观察结果.A和B,未氧化处理
的LDL没有促细胞凋亡的作用.C和D,LDL经被氧化后具有很强的诱导细胞凋亡的作用.E和F,用 MTP抑制LDL
的氧化后,其促进细胞凋亡的作用也显著降低.
The cels were divided into control groups(A,B),oxidation treatment groups(C,D)and drug groups(E,F).The
MTP treated and untreated LDL are oxidized by Cu2+,and added into the oxidation treatment group and drug group
respectively.The A,C,E and B,D,F are fluorescent observaed and visible-light observaed of cel apoptosis.
图3 ox-LDL诱导细胞凋亡作用(镜检)
Fig.3 ox-LDL induced cels apoptosis observed by microscopy
3 讨论
血管内皮是保护血管系统的一个主要的屏障.它能保持血管舒张和收缩之间的平衡,能够调控血
管平滑肌细胞的增殖和迁移及血栓形成[2-3].当血管内皮受到损伤时这些平衡被破坏,血管系统的功
能紊乱.血管内皮的功能失调是动脉粥样硬化的早期标志,会引起血管平滑肌细胞增殖、迁移等一系
列反应,进而促进和加剧动脉粥样硬化的进程[2].
随着氧自由基(oxygen free radical,OFR)及其介导的脂质过氧化反应在疾病中的作用研究日趋
深入,自由基与动脉粥样硬化等心血管病的发生发展相关的研究越来越多,人们对OFR损伤机制的
认识也更加深入.大量基础研究表明[4-7],高血脂时体内自由基产生和清除的平衡被破坏,许多自由
基清除剂(如SOD、CAT)的活性降低,产生了大量的脂质过氧化物(LPO),导致血浆中的低密度脂蛋
白被氧化修饰,从而导致血管内皮细胞的凋亡及血管内皮的损伤.因此清除血浆中的自由基、防止低
密度脂蛋白(LDL)的氧化是预防动脉粥样硬化发生的有效途径之一.ox-LDL是血管内皮的损伤乃
至不稳定斑块形成的关键因子,由LDL在体内氧化形成[8-9].ox-LDL能促使巨噬细胞吞噬大量的脂
质而成为泡沫细胞,并且泡沫细胞累计而成的脂池是粥样斑块的主要成分[10].
本研究从蒙古口蘑中提取多糖成分,研究其抗氧化活性.多糖作为蒙古口蘑中含量最为丰富的生
物活性物质之一,具有十分重要的研究价值.我们发现 MTP具有很强的清除自由基活性,能抑制
LDL的氧化,降低血浆中的ox-LDL水平.Ox-LDL的细胞毒性作用可使内皮细胞坏死或凋亡,从而
导致血管内皮的损伤,促进AS的形成[11].我们的研究证明 MTP能够抑制LDL被氧化过程的同时,
也能够降低其对血管内皮细胞的凋亡作用.
综上所述,蒙古口蘑子实体及从中提取得到的多糖通过抑制LDL的氧化、抗细胞凋亡等途径抑
制AS的形成过程,它具有调脂、抗动脉粥样硬化作用,为开发相关的保健品提供了依据.
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(责任编委 王迎春)
Antioxidant Activity and Vascular Protecting Effect of
Mongolia Tricholoma Polysaccharide
BAO Liang1,2,BAI Hai-peng1,SA Chao-fu1,
LI Rui-juan1,XI Qilemuge1,Amurisana2,ALATAN Gaole1
(1.School of Life Sciences,Inner Mongolia University,Hohhot 010021,China;
2.Institute of Biology and Chemistry,Hohhot Vocational College,Hohhot 010051,China)
  Abstract:Effect of Mongolia Tricholoma Polysaccharide(MTP)on oxidative modification of
LDL and its anti-apoptosis effect on Vascular Endothelial Cel (VEC)are investigated.Free radical
scavenging activity was tested by DPPH method.To detect vascular protecting effect of MTP,
human LDL was divided into the control group and treatment group.The treatment group was
disposed of MTP,and then both two groups were oxidized by Cu2+into oxidized low density lipo-
proteins(ox-LDL).The oxidized level of them was determined by ELISA kit.The VEC apoptosis
was detected by the Inverted Fluorescence Microscopy(IFM)and the Flow Cytometry(FCM)after
stimulated by ox-LDL of two groups respectively.Results show MTP had a high antioxidant activity
and can significantly inhibit oxidative modification of LDL,apoptosis of VEC and vascular endotheli-
al damage.Thus MTP can decrease the risk of atherosclerosis.
  Key words:MTP;anti-oxidation;vascular endothelial cel;cel apoptosis
205 内蒙古大学学报(自然科学版) 2014年