全 文 ：松口蘑菌丝分离及其 RAPD-PCR鉴定 *
刁桂萍， 孟 雪， 邹 莉 **
（东北林业大学， 黑龙江 哈尔滨 150040）
摘要： 采用组织分离法，对东宁县的松口蘑进行了分离培养。通过显微观察及 RAPD-PCR技术对松口蘑子实体及其相
应的培养物之间进行了亲缘关系鉴定。结果表明，菌褶为松口蘑组织分离的最适宜部位，其最佳分离培养基为 PWJ，
即 PDA+黑木耳二级种浸出液+麦麸。RAPD-PCR结果显示，松口蘑子实体与分离物之间的 DNA指纹相似系数在 0.97~
1.00之间，表明松口蘑子实体与其相应的培养物在种质上是一致的。
关键字： 松口蘑；组织分离；RAPD-PCR
中图分类号： S646.9 文献标识码： A 文章编号： 1003-8310 （2011） 02-0046-03
Isolation of Tricholoma matsutake and It’s RAPD-PCR Identification
DIAO Gui-ping, MENG Xue, ZOU Li
（Northeast Forestry University, Haerbin Heilongjiang 150040）
Abstract: In this study, the mycelia of Tricholoma matsutake from Dongning were cultivated by the method of tissue separation
and identified using RAPD-PCR. The results showed that lamellae were suitable for the tissue separation and well induced on
PWJ medium. By RAPD-PCR analysis, DNA fingerprint similarity coefficient was 0.97~1.00, that implied the mycelia were in-
deed from their corresponding fruiting body.
Key words: Tricholoma matsutake; Tissue separation; RAPD-PCR
松口蘑 （Tricholoma matsutake）， 别名松茸， 属担子菌
亚门 (Basidiomycota)、 担子菌纲 （Basidiomycota）、 伞菌目
（Agaricales）、 口蘑科 （Tricholomataceae）、 口蘑属 （Tri-
choloma）。 它不仅味道鲜美， 营养丰富， 而且具有强身健
脾， 理气化痰的作用， 是世界上最著名、 最珍贵的野生食
用菌之一。 松口蘑人工驯化的探索已经在我国云南、 吉林
等地展开， 但是黑龙江省东宁地区的松口蘑研究未见报
道。 本研究通过对东宁松口蘑进行组织分离， 获得了母
种。 通过显微观察和分子鉴定， 证明了所分离菌丝与原子
实体的种质一致性， 为东宁松口蘑的进一步开发及利用奠
定了基础。
1 材料和方法
1.1 培养材料
松口蘑 1 号、 2 号、 3 号和 4 号子实体， 均采自于黑
龙江省东宁县暖泉子林场。
1.2 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基 （PDA）： 葡萄糖 20.0 g、 马
铃薯 200.0 g、 琼脂 20.0 g， 自来水 1 000.0 mL， pH 值自
然； PDA+VB1+VB3培养基 （PVB）： 葡萄糖 20.0 g、 马铃薯
200.0 g、 VB1 0.5 mg、 VB3 0.5 mg、 琼脂 20.0 g， 自来水
1 000.0 mL， pH 值自然； BM 培养基 （BM）： 葡萄糖 20.0
g、 酵母浸膏 2.0 g、 蛋白胨 0.5 g、 MgSO4·7H2O 0.5 g、
KH2PO4 0.5 g、 琼脂 20.0 g， 自来水 1 000.0 mL， pH 值自
然 ； BM+VB3 培养基 （BMV）： 葡萄糖 20.0 g、 酵母浸膏
2.0 g、 蛋白胨 0.5 g、 MgSO4·7H2O 0.5 g、 VB3 0.5 mg、
KH2PO4 0.5 g、 琼脂 20.0 g， 自来水 1 000.0 mL， pH 值自
然； 滨田培养基 （BT）： 葡萄糖 20.0 g、 干酵母粉 5.0 g、
琼脂 20.0 g， 自来水 1 000.0 mL， pH 值自然 ； 滨田+VB1
培养基 （BTV）： 葡萄糖 20.0 g、 干酵母粉 5.0 g、 VB1 0.5
mg、 琼脂 20.0 g， 自来水 1 000.0 mL， pH 值自然； PDA+
黑木耳二级种浸出液+麦麸培养基 （PWJ）： 葡萄糖 20.0 g、
马铃薯 200.0 g、 黑木耳二级种浸出液 20.0 g、 麦麸 50.0 g、
琼脂 20.0 g， 自来水 1 000.0 mL， pH值自然。
1.3 方法
* 项目来源： 基金项目， 哈尔滨市科技攻关项目 （2005AA3CN184）； 中央高校基本科研业务费专项资金 （DL09AA02）。
作者简介： 刁桂萍， 讲师， 主要从事食用菌方面的研究。
** 通讯作者： 邹莉， 教授。 E-mail: zouli6616@yahoo.com.cn
收稿日期： 2011-01-20
中国食用菌 2011， 30 （2）： 46~48
EDIBLE FUNGI OF CHINA
CN53－1054 ／ Q ISSN 1003－8310
刁桂萍等： 松口蘑菌丝分离及其 RAPD-PCR 鉴定
1.3.1 组织分离
将松口蘑子实体用 70%酒精擦洗后放在无菌培养皿
内， 用解剖刀把子实体纵向切开， 从菌褶、 菌盖、 菌盖和
菌柄连接处、 菌柄中部和菌柄下部挑取米粒大小的组织
块， 分别接种到 7 种分离培养基平板上， 10 个重复， 共
350 皿。 放置于 25℃的人工气候箱内避光培养 30 d～50 d，
定期观察并做好记录。 待菌落直径长到 1 cm 左右， 转皿
进一步纯化。
1.3.2 菌落及菌丝形态观察
将分离物菌丝体挑取少量， 置于载玻片上， 用美兰染
色 0.5 min 后盖上盖玻片， 适度按压到菌丝分散后进行显
微观察。 通过显微镜观察比较子实体和分离物的菌丝特
征， 根据分离物菌丝有无隔膜， 是否存在双核菌丝及菌丝
束， 来确定分离物与松口蘑子实体的亲缘关系。
1.3.3 松口蘑子实体与分离物的 RAPD-PCR 指纹比对分
析
以 1号、 2 号子实体的 DNA 为模板， 从 OPC、 OPF 两
组共 40 条引物中筛选出多态性显著、 重复性稳定的引物，
分别以子实体和分离物的 DNA 为模板， 进行 RAPD-PCR
反应。 PCR 反应结束后， 将 DNA 指纹图谱即转化为数字
矩阵。 用 NTSYS-PC 软件中的 SIMQUAL 程序计算 DNA 指
纹间的相似系数， 按 UPGMA 法构建树图。
2 结果与分析
2.1 松口蘑子实体组织的分离纯化
对东宁县松口蘑子实体的菌褶、 菌盖、 菌盖和菌柄连
接处、 菌柄中部和菌柄下部进行组织分离， 萌发的结果见
表 1。
菌褶组织块在培养 25 d 后， 开始萌发， 长出白色菌
表 1 不同部位组织分离结果
培养
基
菌褶 菌柄菌盖连接处 菌盖 菌柄中部 菌柄下部
接种
块数
污染率
/%
接种
块数
污染率
/%
接种
块数
污染率
/%
接种
块数
污染率
/%
接种
块数
污染率
/%
萌发率
/%
BM 30 0 30 0 30 0 30 0 30 0 0
PVB 30 3.3 30 0 30 0 30 0 30 0 0
BMV 30 0 30 0 30 0 30 0 30 0 0
PWJ 30 0 30 0 30 3.3 30 0 30 3.3 0
BTV 30 0 30 3.3 30 0 30 0 30 0 0
BT 30 6.7 30 0 30 0 30 0 30 3.3 0
PDA 30 0 30 0 30 3.3 30 0 30 0 0
萌发率
/%
6.7
65.7
23.3
73.3
36.7
28.0
56.7
萌发率
/%
0
0
0
0
0
0
0
萌发率
/%
0
0
0
0
0
0
0
萌发率
/%
0
0
0
0
0
0
0
丝， 平均萌发率为 38.9%。 而菌盖、 菌盖和菌柄连接处、
菌柄中部和菌柄下部的组织没有萌发。 菌褶组织在 7 种分
离培养基中的萌发率差异很大， 其中 PWJ 培养基上的菌
丝萌发率最高 ， 为 73.3%， 其次是 PVB 和 PDA 培养基 ，
萌发率最低的是 BM 培养基， 仅为 6.7%。 这些结果表明，
适宜松口蘑组织分离的最适宜部位是菌褶， 其最佳分离培
养基为 PWJ， 即 PDA+黑木耳二级种浸出液+麦麸培养基。
2.2 菌落及菌丝形态观察
2.2.1 菌落形态
松口蘑菌丝体在 PWJ 培养基上的菌落形态见图 1。
松口蘑菌丝体在 PWJ 培养基平板上生长， 形成毛刺
状菌丝束， 随后菌丝体贴附培养基缓慢生长。 菌落中心突
起、 草帽状， 颜色淡黄， 菌丝边缘呈皱褶状， 表面菌丝短
粗， 具有松口蘑香味。
2.2.2 菌落形态
将染色后的子实体和分离物菌丝体置于显微镜下观
察， 结果见图 2。
从图 2 可以看出， 子实体和分离物的内含物丰富， 粗
细均匀， 分隔不规律。 子实体的菌丝末端膨大， 并从菌褶
部位的菌丝体上观察到了担孢子 （图 2A、 图 2B）， 分离物
菌丝体的前端也明显的膨大 （图 2C）。 子实体和分离物菌
丝中都存在隔膜和双核结构， 并有菌丝束形成 （图 2D、
图2E）。 分离物菌丝性状稳定， 初步鉴定为松口蘑菌丝体。
2.3 松口蘑子实体与分离物的 RAPD-PCR 指纹比对分析
图 1 松口蘑菌丝体在 PWJ培养基上的菌落形态
A B C
D E
图 2 （A） 松口蘑子实体菌丝的顶端膨大； （B） 松口蘑子实体的
担孢子； （C） 分离物菌丝的顶端膨大图； （D） 松口蘑子实体的
双核菌丝； （E） 分离物菌丝的隔膜和双核。
第 30 卷 第 2 期 47
部分引物 RAPD－PCR 反应电泳图谱及有效引物见图
3、 表 2。
以 1 号、 2 号子实体的 DNA 作为模板， 选取随机引物
OPC、 OPF 两组 40 条引物进行 PCR 反应， 其中有 17 条引
物为有效引物， 重复性好， 得到清晰稳定的指纹图谱。 利
用表 2 列出的 17 条随机引物， 以子实体和分离物的 DNA
为模板， 进行 PCR 扩增， 获得每个引物介导的 DNA 指纹
图谱。 图 4 为随机引物 S126 与 S127 介导的指纹图谱， 其
它 15 条随机引物介导的指纹图谱各不相同。
根据子实体与分离物的 DNA 指纹图谱， 获得各供试
样品间的矩阵， 用 NTSYS-PC 软件中的 SIMQUAL 程序计
算相似系数， 按 UPGMA 法构建树图， 见图 5。
从图 5 可以看出， 松口蘑子实体 1、 2、 3 和 4 之间
DNA 相似系数在 97%以上， 表明它们是 1 个蘑菇圈内的
子实体； 1 号子实体与 1 号分离物的相似系数为 100%，
表明 1 号分离物是由 1 号子实体分离获得的。
3 讨论
松口蘑子实体在生长过程中， 各部位组织分化程度不
同， 因而在移植到培养基上后， 萌发速度是不同的。 东宁
松口蘑子实体各部位分离的结果表明， 菌褶分离成功率最
高， 是松口蘑适宜的分离部位， 其他部位难以获得松口蘑
菌丝。
在研究中发现建立在其它真菌基础上的 RAPD-PCR
条件并不适合东宁松口蘑， 突出的问题就是 DNA 指纹模
糊难辨。 依据曾东方关于松口蘑菌丝体 RAPD-PCR 优化
条件的分析， 改变了预变性、 变性、 退火、 延伸的时间和
温度， 获得了清晰易辨的 DNA 指纹。 关于模板 DNA 的用
量， 经典的 RAPD 反应使用 20 ng·25-1·μL-1反应， 报道范
围是 25 ng·25-1·μL-1～100 ng·25-1·μL-1。 本研究结果表明，
9 ng·25-1·μL-1～600 ng·25-1·μL-1DNA 模板并不影响指纹图
谱的重复性， 而实际上使用 10 ng·25-1·μL-1 的 DNA 用量
更为经济有效。 通过 RAPD-PCR 分析， 结果表明供试的
17 个随机引物 RAPD 图谱一致， 揭示了松口蘑同一个体
子实体与菌丝体的 DNA 同质性， 依此鉴定分离物菌丝体
与分离物存在亲菌关系， 为目前鉴定尚不能经过出菇试验
的共生真菌分离物的真伪开辟了一条崭新的途径。
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图 3 部分引物 RAPD－PCR 反应电泳图谱
注： M 为 lambda DNA/EcoRI+HindⅢ marker; 1~20 为 PCR 产物。
表 2 松口蘑 RAPD 的有效引物
引物 引物 序列
S25 S79 GTTGCCAGCC
S69 S124 GGTGATCTGG
S64 S122 GAGGATCCCT
S28 S121 ACGGATCCTG
S26 S80 ACTTCGCCAC
S74 S126 GGGAATTCGG
S78 - -
S76 S129 CCAAGCTTCC
S75 S127 CCGATATCCC
序列
AGGGGTCTTG
CTCACCGTCC
CCGGCATCTAC
GTGACGTAGG
GGTCCCTGAC
TGCGTGCTTG
TGAGTGGGTG
CACACTCCAG
GACGGATCAG
图 4 随机引物 S126 和 S127 扩增的松口蘑子实体及其分离菌丝体
的 RAPD 图谱
注： M 为 lambda DNA/EcoRI+HindⅢ marker； 1 和 6 为 1 号菌丝体；
2 和 7 为 1 号子实体； 3 和 8 为 2 号子实体； 4 和 9 为 3 号子实体；
5 和 10 为 4 号子实体； 引物 1～5 为 S126； 引物 6～10 为 S127。
图 5 松口蘑 4 个子实体、 1 号子实体分离物及香菇菌丝体的聚
类分析树
注： c1 为 1 号菌丝体； c2 为 1 号子实体； c3 为 2 号子实体； c4
为 3 号子实体； c5 为 4 号子实体； c6 为香菇菌丝体。
中国食用菌 EDIBLE FUNGI OF CHINA Vol． 30 No．2
0.65 0.73 0.82 0.91 1.00
C1
C6
C5
C4
C3
C2
Coefficient
48