全 文 ：Guiding Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy
第21卷 第1期
Vol.21 No. 1
2015年 1月
January.2015
*基金项目：国家国际科技合作计划资助（2010DFB33260）；中医
药干预胰岛素抵抗技术平台建设与方药筛选研究（11北京教委
共建项目）；北京中医药大学创新团队项目（2011-CXTD-19）
通讯作者：徐暾海，E-mail：thxu@163.com
蒺藜（Tribulus terrestris L.）为蒺藜科（Zygophy－
laceae）蒺藜属（Tribulus）植物。性微温，味辛苦，有小
毒，具有平肝解郁、活血祛风、明目、止痒的功效。主
治头痛眩晕、胸胁胀痛、乳闭乳痈、目赤翳障、风疹瘙
痒、消渴等症[1]。《中国药典》（2010版）收载的中药蒺
藜为蒺藜的果实，称之为蒺藜果，始载于《神农本草
经》，列为上品[2]。蒺藜药用历史悠久，全株果实、根、
茎叶、花都可入药，被誉为“草中名药”。蒺藜地上部
分为蒺藜科植物蒺藜的茎叶，始载于《本草纲目》[3]。
蒺藜茎叶中主要含有皂苷、黄酮、生物碱和多糖类等
化合物。蒺藜中以槲皮素为母核的黄酮类成分含量
最高，在不同部位中，以叶中黄酮类成分含量最高，
茎次之，果实中最少，通过比较，主要黄酮类成分的
含量是主要皂苷类成分含量的1.5倍，其作用有抗氧
化、治疗心脑血管疾病等[4-5]。现代研究表明蒺藜黄酮
类成分主要是以槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempfer－
ol）及异鼠李素（isorhamnetin）为母核的化合物 [6]。蒺
HPLC-DAD法测定蒺藜茎叶3种酸水解
黄酮苷元的含量*
李春娜1，2，3，范冰舵1，2，3，时晓娟1，2，3，刘洋洋1，2，3，李朋收1，2，3，徐暾海1，2，3，刘铜华2，3
（1.北京中医药大学中药学院，北京 100029；2.教育部中医养生学重点实验室，北京 100029；
3.北京市中医养生学重点实验室，北京，100029）
[摘要] 目的：对酸水解后黄酮类三大苷元质量控制进行研究，建立水解充分完全，操作简单易行的质量控制方法。方法：采
用HPLC-DAD法，色谱柱：Thermo Syncronis C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：为乙腈-0.2%磷酸水溶液，流速：1.0 mL·min-1，柱
温：40℃，进样量：20 μL，槲皮素、山奈酚及异鼠李素检测波长：370 nm。结果：槲皮素、山奈酚、异鼠李素3个黄酮苷元分别在1.
76-44.00，0.81-10.16，0.55-13.75 μg/mL范围内呈线性良好；回归方程分别为Y=74906X-64345（R2=0.9999），Y=74324X-40391
（R2=0.9993），Y= 69020X-30737（R2=0.9996）。结论：通过提取分离工艺中不同部分的样品进行测定发现，经大孔树脂柱（D101）分
离后96%的黄酮类化合物主要集中在30%乙醇部分。
[关键词] 蒺藜；高效液相；黄酮苷元；酸水解
[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 1672-951X（2015）01-0033-04
Determination of Three Components of Flavonoids Aglycones After the Acid Hydrolysis
of Tribulus terrestris L. Stems and Leaves by HPLC-DAD
LI Chun-na1，2，3, FAN Bing-duo1，2，3, SHI Xiao-juan1，2，3, LIU Yang-yang1，2，3, LI Peng-shou1，2，3, XU Tun-hai1，2，3, LIU Tong-hua2，3
(1. School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029, China；2. Beijing Key Laboratory
of Health-cultivation，Beijing 100029, China；3. Health-cultivation Laboratory，Ministry of Education，Beijing 100029, China)
[Abstract] Objective: To establish a quality control method for flavonoid aglycones (quercetin，kaempferol，isorhamnetin).
Methods: A Thermo Syncronis C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm） was adopted. The mobile phase was 0.2% phosphoric acid solution
and acetonitrile in gradient elution. The flow rate was 1.0 mL·min-1，the column temperature was 40 ℃ and the injection volume
was 20 μL. The detecting wavelength was 370 nm. Results: Quercetin, kaempferol and isorhamnetin were linear in the range of
1.76 44.00, 0.8128 10.1600, 0.55 13.75 μg/mL with good linearity. Their regression equations were Y=74906X-64345 (R2=
0.9999)，Y=74324X-40391(R2=0.9993)，Y=69020X-30737(R2=0.9996)，respectively. Conclusion: 96% flavonoids were mainly con－
centrated in 30% ethanol eluent of D101 macroporous resin by analyzing the samples from different parts in the extraction and
separation processes.
[Key words] Jili (Tribulus terrestris L)；HPLC；contents determination；acid hydrolysis.
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中药制剂与药理分析
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DOI:10.13862/j.cnki.cn43-1446/r.2015.01.010
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藜已被广泛用于临床制剂中，但有关其含量测定方
法，尤其是黄酮类研究更是甚少。经查阅文献[7]，以3
种主要的黄酮水解苷元：槲皮素、山奈酚及异鼠李素
为指标测定的研究已经成熟。本文通过对蒺藜样品
的酸水解得到苷元，进行含量测定，可对蒺藜的提
取分离工艺，富集黄酮类成分的方法进行初步考察。
1 仪器与试药
仪器：岛津LC-15C高效液相色谱仪（四元泵，恒
温柱箱，DAD检测器，LC solution工作站，岛津公司，
日本）；FY130型中药粉碎机（天津市亲斯特仪器有
限公司）；Millipore-Q超纯水制备仪（法国密理博公
司）；KQ-250B型高功率数控超声波清洗器（昆山市
超声仪器有限公司）；德国赛多利斯电子分析天平
（R200D分析天平）。
材料与试剂：槲皮素（由中国药品生物制品检定
所提供，批号为100081-200907）、异鼠李素（由中国
药品生物制品检定所提供，批号为110860-201109）、
山奈酚（由上海源叶生物科技有限公司提供，批号为
20130329），各标准品含量均>98%，符合含量测定的
要求。乙腈（色谱纯）为美国Fisher Scientific公司产品；
水为Millipore-Q制超纯水；其他试剂均为分析纯。蒺
藜地上部分（产于陕西），检验样品（产于吉林）为70%
乙醇和水提取部位，经大孔树脂洗脱得到四个部位分
别为：30%乙醇部位、50%乙醇部位、75%乙醇部位、
95%乙醇部位。蒺藜药材经北京中医药大学中药博
物馆马泽新主任鉴定为蒺藜(Tribulus terrestris L.)
的干燥茎叶。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱：Thermo Syncronis C18(250mm×
4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.2%磷酸水；梯度洗
脱：0-30 min (25：75-45：55)；柱温：40 ℃，流速：
1.0 mL·min-1，进样量：20 μL，检测波长：370 nm。
2.2 对照品储备液的制备 分别精密称取槲皮素
对照品2.20 mg，山奈酚对照品2.54 mg，异鼠李素对
照品2.75 mg，分别置于50ml棕色容量瓶中，分别加
甲醇配制成含槲皮素浓度为44μg·mL-1，含山奈酚浓
度为50.8 μg·mL-1和含异鼠李素浓度为55 μg·mL-1的
对照品储备液。冷藏，避光备用。
2.3 供试品溶液的制备 精密称取1.0 mg蒺藜茎叶
干燥粉末于具塞锥形瓶中，加入30 mL甲醇，超声
30 min，减压过滤后蒸干滤液，再加入16%盐酸-甲
醇溶液25 mL（V：V=4：21），于80℃水浴锅中酸水解
3 h后，迅速冷却至室温，转移至25 mL容量瓶中，并
用甲醇定容，摇匀，溶液过0.45 μm微孔滤膜，取续滤
液（初滤液弃掉），既得。
2.4 系统适应性考察 分别吸取对照品溶液、供试
品溶液注入高效液相色谱仪，在“2.1”项色谱条件下
进样测定，结果见图1。槲皮素，山奈酚，异鼠李素理
论塔板数均不低于20000，各成分分离度分别为9.1、
1.3、2.7，均符合含量测定要求。（见图1）
A-混合标准品溶液
B蒺藜供试品溶液
图 1 测定蒺藜茎叶 HPLC图（1.槲皮素；2.山奈酚；3异鼠李素）
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2.5 线性关系考察 将“2.2”项下对照品储备液用
甲醇逐级稀释成不同浓度的对照品溶液，槲皮素浓
度依次为44、35.2、26.4、17.6、8.8、3.52、1.76 μg·mL-1，
山奈酚浓度依次为10.16、8.13、6.10、4.06、2.03、1.63、
0.81μg·mL-1，异鼠李素浓度依次为13.75、11.00、8.25、
5.5、2.75、1.10、0.55 μg·mL-1，精密吸取不同浓度的
对照品溶液各20 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测
定，记录峰面积，以对照品浓度（X）为横坐标，以峰
面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程和
相关系数。（见表1）
表 1 蒺藜中槲皮素、山奈酚、异鼠李素线性回归方程、
相关系数和线性范围
成分 线性回归方程 R2 线性范围(μg·mL-1)
槲皮素 Y=74905X-64344 0.9999 1.76-44.00
山奈酚 Y=74324X-40391 0.9993 0.81-10.16
异鼠李素 Y=69020X-30737 0.9996 0.55-13.75
2.6 精密度试验 分别精密吸取一定浓度的槲皮
素、山奈酚、异鼠李素对照品混合溶液，混合均匀，连
续进样6次，每次20μL，记录各对照品峰面积，RSD%
分别为0.46%、0.72%和0.38%，表明仪器精密度良好。
2.7 稳定性试验 按“2.3”项操作制备供试品溶液，
常温放置，在“2.1”项色谱条件下进样测定，分别于
0、2、4、8、12、24 h进样，每次20 μL，记录峰面积，样
品中槲皮素、山奈酚、异鼠李素不同时间测定的峰面
积RSD%分别为1.15%，1.71%，3.69%。表明供试品溶
液在24 h内稳定。
2.8 重现性试验 精密称取蒺藜茎叶粉末6份，分
别按“2.3”项操作制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条
件分别测定，计算样品中各待测成分含量。结果槲皮
素、山奈酚、异鼠李素的平均含量分别为139.62μg·g-1、
26.78 μg·g-1、52.6 μg·g-1，测定的峰面积RSD%分别
为2.10%、3.01%和1.48%。
2.9 加样回收率试验 取已知含量（自制，批号：
130819，水解后槲皮素、山奈酚、异鼠李素质量分数
分别为139.62 μg·g-1、26.78 μg·g-1、52.6 μg·g-1）的蒺
藜茎叶粉末6份，每份约0.5g，精密称定，置具塞锥形
瓶中，分别加入高、中、低剂量的对照品溶液。按
“2.3”中制备供试品溶液操作方法对黄酮苷进行酸化。
并按“2.1”色谱条件进样分析，根据测得量和加入量
计算其回收率。结果显示，槲皮素、山奈酚、异鼠李素
平均回收率分别为 100.51%、101.15%、100.09%。
RSD%为1.03%、1.56%、2.56%（n=6）。（见表2）
2.10 样品含量测定 按“2.3”中操作制备样品溶液
（4份），常温放置，按“2.1”项色谱条件进行测定，每
份分别进样两次，每次20 μL。记录峰面积，并计算样
品含量。（见表3）
表 2 蒺藜加样回收率实验 （n=6）
样品中含 样品中对 加入量 测得量 回收率 平均回
量(μg) 照品量(μg) (μg) (μg) (%) 收率(%)
槲皮素 高 1 0.5038 70.61 88.00 158.65 100.05
2 0.5060 70.91 88.00 160.95 102.31
3 0.5045 70.70 88.00 159.2 100.56
中 1 0.5051 70.52 70.40 141.22 100.43
2 0.5034 70.28 70.40 141.86 101.68 100.52 0.99
3 0.5047 70.47 70.40 140.47 99.43
低 1 0.5017 70.31 52.80 122.73 99.28
2 0.5025 70.42 52.80 123.23 100.01
3 0.5033 70.54 52.80 123.81 100.90
山奈酚 高 1 0.5038 13.54 16.26 29.73 99.60
2 0.5060 13.60 16.26 29.87 100.09
3 0.5045 13.56 16.26 29.95 100.82
中 1 0.5051 13.53 14.03 27.34 98.43
2 0.5034 13.48 14.03 27.47 99.71 100.61 1.54
3 0.5047 13.52 14.03 27.62 100.50
低 1 0.5017 13.48 10.16 23.69 100.49
2 0.5025 13.51 10.16 24.06 103.84
3 0.5033 13.53 10.16 23.89 101.97
异鼠李素 高 1 0.5038 26.60 33.33 59.33 98.20
2 0.5060 26.71 33.33 61.26 103.67
3 0.5045 26.64 33.33 60.73 102.28
中 1 0.5051 26.57 27.50 54.24 100.62
2 0.5034 26.48 27.50 54.61 102.30 100.78 2.37
3 0.5047 26.55 27.50 55.02 103.53
低 1 0.5017 26.49 22.00 47.91 97.38
2 0.5025 26.53 22.00 48.12 98.16
3 0.5033 26.57 22.00 48.77 100.89
表 3 蒺藜样品含量测定
样品 槲皮素(μg/g) 山奈酚(μg/g) 异鼠李素(μg/g)
30%部分 207.9 264.6 614.0
50%部分 - 69.3 115.6
75%部分 - - -
95%部分 - - -
3 讨 论
3.1 色谱条件的选择 黄酮醇（3-OH游离）有两个
特征紫外吸收峰，分别为250-280 nm（带Ⅱ），358-
380 nm（带Ⅰ），本实验选用370 nm为带Ⅰ特征吸收
峰，不仅可以提高样品含量测定的灵敏度，同时可以
区分其他色谱峰[8-9]。采用0.2%磷酸-水溶液可使色
谱峰拖尾现象明显消除。实验比较了30%乙腈-磷酸
水等度洗脱、20%-50%乙腈-磷酸水梯度洗脱、25%
45%乙腈-磷酸水梯度洗脱、27%-42%乙腈-磷酸水
RSD(%)成分 No.
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梯度洗脱等色谱条件，其中当色谱条件为0-30 min，
25%-45%乙腈-0.2%磷酸水梯度洗脱，流速1 mL/min
时，样品组分中3个标志峰可得到快速，较好的分离，
故确定为最终色谱条件。
3.2 提取方法及酸水解方法的选择 实验首先比
较了热回流提取（95℃，2 h）和超声提取（30 min）两
种方法各成分的差异，结果发现超声提取收率明显
优于热回流提取，且用时短，操作更方便。在考察提
取溶剂的选择时，考察了水和纯甲醇两种溶剂，结果
发现两者无明显差异，考虑到黄酮苷元多羟基的特
点，选用纯甲醇做提取溶剂，这样可以避免实验操作
中测定成分的氧化反应损失。纯甲醇的沸点为64.7℃，
本实验酸水解的温度设为80℃，可使样品充分酸水
解。对盐酸浓度和水解时间考察时，通过文献查询结
合本实验对这两个因素考察，结果发现盐酸浓度为甲
醇-25%盐酸（21：4）明显优于甲醇-25%盐酸（22：3）。
水解时间对收率的影响为3 h>2 h>1 h，前2 h随着水
解时间增加，样品收率的增长明显；2 h后随着水解
时间增加，样品收率的增长减慢，至3 h时收率最大，
4 h时趋于平稳。因此盐酸水解浓度设定为甲醇-25%
盐酸（21：4），水解时间为3 h。（见图2）
A 甲醇-25%盐酸（21：4）
B 甲醇-25%盐酸（22：3）
C 不同盐酸浓度时苷元总量
图 2 两因素四水平数据趋势图
3.3 样品测定的分析 对工艺中30%乙醇部位、
50%乙醇部位、75%乙醇部位、95%乙醇部位四个样
品进行苷元含量的测定发现三标准成分的含量大小
顺序为：异鼠李素>山奈酚>槲皮素。这与原药材供
试品（槲皮素>异鼠李素>山奈酚）数据不符。原因可
能是以槲皮素苷元为母核的黄酮苷大部分被95%乙
醇渗漉提取。研究发现蒺藜提取液经大孔树脂分离
总黄酮95%以上被富集在30%乙醇中，可作为蒺藜
总黄酮富集工艺的优化依据。经表3数据分析可见直
观分析图。（见图3）
图 3 各部分样品黄酮含量分析
参考文献
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（收稿日期：2014-09-30 编辑：李海洋）
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