全 文 ：基金项目:四川省科技支撑计划(编号:15ZC1978) ;四川省科研院所科技成果转化资金项目(编号:14010139) ;四川省公益性科研院所基本
科研业务专项
作者简介:武蕊娟(1989. 08—) ，女，硕士在读，研究方向:中药新药与新型给药系统研究，E-mail:344354319@ qq. com
通信作者:徐超群(1963. 09—) ，女，博士，研究员，研究方向:中药新药与新型给药系统研究，E-mail:chaoqun_xu@ sina. com
中药研究
马甲子叶提取物抗肿瘤活性部位的筛选
武蕊娟1，2 谭 镭2 詹 雁2 阮 佳2 徐 超2
(1 成都中医药大学，成都，610075;2 四川省中医药科学院，成都，610041)
摘要 目的:从药用植物马甲子叶醇提物中分离筛选具有抗肿瘤作用的活性组分。方法:采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇
萃取马甲子叶醇提物，并将这三个萃取部位进行体外抗肿瘤实验，再把筛选得到的具有较好抗肿瘤活性的部位进行硅胶
柱层析分离，并采用 MTT法对分离得到的组分进行体外抗肿瘤活性比较。结果:通过体外抗 HepG-2 细胞和 HeLa细胞实
验表明，乙酸乙酯萃取部位具有较好抗肿瘤活性。通过硅胶柱分离，获得 5 个组分，通过 MTT实验发现这 5 个组分中，石
油醚:乙酸乙酯为 1∶ 1 和 1∶ 2 洗脱所得到的两个组分具有明显的体外抗肿瘤活性，其中石油醚:乙酸乙酯为 1∶ 2 的洗脱具
有更好的杀伤作用，对 HepG-2 细胞和 HeLa细胞的 IC50分别为 45. 79，13. 16 μg /mL。结论:从马甲子叶醇提物乙酸乙酯部
位中分离得到 2 种具有抗肿瘤作用的活性组分，为进一步分离抗肿瘤活性成分提供一定的指导作用。
关键词 马甲子叶提取物;抗肿瘤活性;溶剂法和硅胶柱分离法;MTT;活性组分
Study of Effective Anti-tumor Activity Parts from Leaves of Paliurus ramosissimus
Wu Ｒuijuan1，2，Tan Lei2，Zhan Yan2，Ｒuan Jia2，Xu Chaoqun2
(1 Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610075，China;2 Sichuan Academy
of Chinese Medicine Sciences，Chengdu 610041，China)
Abstract Objective:To separate and select anti-tumor activity part from the leaves of Paliurus ramosissimus． Methods:Ex-
tracts from the leaves of Paliurus ramosissimus were extracted with petroleum ether，ethyl acetate and n-butyl alcohol respectively．
In vitro anti-tumor experiments were performed at the three extract sites． The optimal site with best anti-tumor activity then was
screened by silica gel column chromatography，and MTT assay was used for the comparison of components obtained for antitumor
activity． Ｒesults:In vitro anti HepG-2 cells and HeLa cell experiments showed that ethyl acetate fraction extracts had good anti-
tumor activity． Separated by a silica gel column，five components were collected by MTT assay，which found that when the ratio of
petroleum ether:ethyl acetate were 1∶ 1 and 1∶ 2，both eluted fraction group had in vitro anti-tumor activity and when the ration of
the elution of petroleum ether to ethyl acetate was 1∶ 2 the anti-tumor function was better． IC50 of HepG-2 cells and HeLa cells were
45． 79 and 13． 16 μg·mL-1 respectively． Conclusion:Two kinds of active ingredients with anti-tumor effect were separated from
the leaves of Paliurus ramosissimus by ethyl alcohol，which may provide guidance for the further separation of anti-tumor active in-
gredient．
Key Words Extracts from the leaves of Paliurus ramosissimus;Anti-tumor effect;Solvent and silica gel column separation;
MTT;Active ingredient
中图分类号:Ｒ284. 2 文献标识码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1673 － 7202． 2016． 02． 038
马甲子 Paliurus ramosissimus (Lour. )Poir. 系
鼠李科马甲子属植物，又名铁篱笆、铜钱树。在我国
长江流域以南各省均有分布，多生于丘陵林边灌丛
中或荒山草地上。其根、果实、叶均可供药用，根能
除寒活血，解热消肿，治疗跌打损伤及心腹疼痛;果
实能化瘀止血，活血止痛，台湾地区民间用于治疗牙
痛和腹痛［1-2］;叶能治疗无名肿痛，民间多用于治痈
疮溃疡等。也有报道证实马甲子醇提物具有镇咳祛
痰的功效［3-4］。经课题组的前期研究证实其叶也具
有抗肿瘤方面的作用且疗效较好。此次实验主要从
马甲子叶醇提物中分离出具有抗肿瘤作用的活性组
分，对其中活性成分进行活性追踪并分离纯化，为阐
明马甲子的抗肿瘤作用机制奠定物质基础。
1 材料与方法
1. 1 药材 马甲子鲜叶，于 2014 年 5 月 7 日采于
四川省成都市牧马山，经四川省中医药科学院舒光
·423· WOＲLD CHINESE MEDICINE February． 2016，Vol． 11，No． 2
明研究员鉴定为鼠李科马甲子属植物马甲子 Pali-
urus ramosissimus (Lour. )Poir的鲜叶。
1. 2 药品与试剂 DMEM/HIGH GLUCOSE 培养
基，胎牛血清(Hyclone，美国) ，3-(4，5-二甲基噻唑-
2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT) ，青霉素、链霉素
(Amresco，美国) ，胰蛋白酶(Gibco，美国) ，其他试剂
均为分析纯。人肝癌细胞 HepG-2、人宫颈癌细胞
HeLa(四川大学华西药学院靶向药物及释药系统教
育部重点实验室提供) ，96 孔板。
1. 3 仪器 Thermo Forma系列 CO2 培养箱(Sanyo，
日本) ;Model-550 型酶联免疫检测仪(Bio-Ｒad，美
国) ;SW-CJ-2D 型超净工作台(苏州市净化设备总
厂) ;倒置显微镜(型号:Fx-35DX，Nikon) ;离心机
(型号:TGL-16G，上海医用分析仪器厂)。
2 方法［5-10］
2. 1 溶剂法和硅胶柱分离法提取不同组分 称取
马甲子鲜叶适量，粉碎，用 10 倍量 95%乙醇浸渍提
取 2 d，过滤，减压浓缩，浓缩液冷冻干燥得马甲子叶
醇提物。马甲子叶醇提物依次用石油醚、乙酸乙酯、
正丁醇萃取，分别得到以上 3 个部位及水溶液层，将
各溶剂挥干，备用。将以上萃取得到的乙酸乙酯部
位采用硅胶柱色谱分离，分别用石油醚:乙酸乙酯为
15∶ 1，5∶ 1，3∶ 1，1∶ 1 和 1∶ 2 配制的不同极性溶剂洗脱
得到 5 个组分(Pl，P2，P3，P4 和 P5) ，蒸去溶剂，备
用。
2. 2 MTT法测细胞增殖的抑制率 样品配制:马甲
子各萃取部位和乙酸乙酯部位不同组分分别用异丙
醇超声溶解，1 000 r /min离心 2 次，0. 22 μm微孔滤
膜过滤除菌，用培养基稀释至所需浓度，备用。
按文献方法［11-12］复苏两种细胞，常规培养。取
对数生长期的 HepG-2、HeLa 细胞，均制备成浓度为
6. 25 × 104 个 /mL的单细胞悬液，接种于 96 孔板，每
孔 160 L(即每孔接种 1. 0 × 104 个细胞) ，37 ℃、5%
CO2 培养箱培养至细胞贴壁后，加入不同浓度的药
物，设阳性对照 0. 025 mg /mL 5-Fu 注射液、阴性对
照、空白对照组，复孔 4 个，继续培养 48 h。吸去上
清液，用含 0. 5 mg /mL MTT的无血清 DMEM 孵育 3
h后，弃上清液，每孔加入 150 μL DMSO，在酶标仪
上于 490 nm 处检测各吸光度 OD 值。实验重复 3
次。按下列公式计算细胞生长抑制率:
抑制率 = 1-(实验组 OD 值-空白对照组 OD
值)/(阴性对照组 OD 值-空白对照组 OD 值)×
100%。
表 1 马甲子醇提物不同萃取部位作用于 HepG-2
细胞 24 h的实验结果
浓度
/μg /mL
抑制率 /%
石油醚部位 乙酸乙酯部位 正丁醇部位 水部位
40 21. 55 ± 0. 63 27. 83 ± 0. 45 — —
60 26. 78 ± 0. 37 30. 02 ± 0. 58 — —
80 32. 11 ± 0. 53 37. 82 ± 0. 33 — —
100 36. 47 ± 0. 39 44. 67 ± 0. 79 — —
200 45. 25 ± 0. 36 52. 15 ± 0. 61 — —
400 62. 04 ± 0. 58 64. 93 ± 0. 42 16. 11 ± 0. 41 —
表 2 马甲子醇提物不同萃取部位作用于 HeLa
细胞 24 h的实验结果
浓度
/μg /mL
抑制率 /%
石油醚部位 乙酸乙酯部位 正丁醇部位 水部位
40 22. 94 ± 0. 64 26. 03 ± 0. 56 — —
60 27. 51 ± 0. 38 29. 10 ± 0. 54 — —
80 33. 78 ± 0. 45 35. 69 ± 0. 62 — —
100 43. 45 ± 0. 61 42. 18 ± 0. 80 — —
200 50. 31 ± 0. 53 54. 38 ± 0. 49 — —
400 65. 02 ± 0. 47 66. 54 ± 0. 57 18. 54 ± 0. 46 —
表 3 马甲子醇提物乙酸乙酯部位不同组分作用于
HepG-2 细胞 24 h的实验结果
浓度
/ g /mL
抑制率 /%
P1 P2 P3 P4 P5
40 — 15. 22 ± 0. 33 20. 92 ± 0. 49 42. 59 ± 0. 53 59. 94 ± 0. 61
60 — 21. 61 ± 0. 74 25. 66 ± 0. 46 47. 44 ± 0. 74 62. 80 ± 0. 57
80 — 22. 27 ± 0. 52 31. 63 ± 0. 42 52. 23 ± 0. 65 68. 15 ± 0. 52
100 — 28. 56 ± 0. 69 33. 09 ± 0. 77 61. 21 ± 0. 47 70. 34 ± 0. 43
200 — 35. 51 ± 0. 44 43. 51 ± 0. 51 75. 53 ± 0. 56 79. 11 ± 0. 78
400 — 57. 90 ± 0. 45 53. 92 ± 0. 58 84. 33 ± 0. 44 87. 76 ± 0. 65
表 4 马甲子醇提物乙酸乙酯部位不同组分作用于
HeLa细胞 24 h的实验结果
浓度
/μg /mL
抑制率 /%
P1 P2 P3 P4 P5
40 — 15. 57 ± 0. 73 6. 56 ± 0. 85 47. 70 ± 0. 63 69. 01 ± 0. 52
60 — 21. 45 ± 0. 59 10. 73 ± 0. 49 52. 81 ± 0. 60 80. 56 ± 0. 41
80 — 28. 44 ± 0. 63 16. 41 ± 0. 56 66. 69 ± 0. 47 88. 59 ± 0. 64
100 — 30. 27 ± 0. 66 22. 04 ± 0. 58 70. 15 ± 0. 53 89. 63 ± 0. 44
200 — 61. 78 ± 0. 51 33. 57 ± 0. 61 76. 42 ± 0. 38 93. 39 ± 0. 75
400 — 79. 95 ± 0. 78 60. 30 ± 0. 55 90. 32 ± 0. 49 95. 92 ± 0. 47
3 结果
3. 1 不同极性部位对 HepG-2 细胞、Hela 细胞增殖
的抑制作用 实验结果显示，马甲子石油醚和乙酸
乙酯部位对 HepG-2 和 HeLa 细胞的增殖有较强的
抑制作用，正丁醇及水溶液部分则无明显作用。石
油醚部位作用于 HepG-2 和 HeLa 细胞 24 h 的 IC50
分别为 223. 17，180. 80 g /mL;乙酸乙酯部位作用于
HepG-2 和 HeLa 细胞 24 h 的 IC50分别为 138. 29，
125. 11 g /mL。2 个部位对 HepG-2 和 Hela细胞增殖
·523·世界中医药 2016 年 2 月第 11 卷第 2 期
抑制率有明显的量效关系。水提物部位对 2 种细胞
体外增值均无明显的抑制作用，正丁醇部位在最大
浓度 400 g /mL才有抑制作用。
3. 2 不同组分对 HepG-2 细胞、HeLa 细胞增殖的抑
制作用 乙酸乙酯部位采用硅胶柱层析分离得到的
5 个组分中，P4 和 P5 2 个组分对 HepG-2、Hela 细胞
增殖具有显著的抑制作用。其中 P4 组分抑制
HepG-2 和 HeLa 细胞 24 h 的 IC50分别为 62. 91，
45. 79 g /mL。P5 组分抑制 HepG-细胞和 HeLa 细胞
24 h的 IC50分别为 26. 11，13. 16 g /mL。
图 1 不同组分对 HepG-2 和 HeLa细胞增殖的抑制曲线
4 讨论
本实验以人肝癌细胞 HepG-2 和人子宫颈癌细
胞 HeLa 的体外抗肿瘤活性为指标，用不同极性溶
剂对马甲子醇提物进行萃取分离得到的 4 个溶剂部
位，并对 4 个溶剂部位采用 MTT 法测定抗肿瘤活
性。实验结果表明，石油醚和乙酸乙酯部位的抗肿
瘤活性较明显，其中乙酸乙酯部位的抗肿瘤活性最
强。故将乙酸乙酯部位过硅胶柱层析分离，洗脱得
到 5 个组分，得到活性较好的 P4 和 P5 组分，为马甲
子分离得到有效抗肿瘤活性单体提供了有效的实验
基础。
由于中药活性成份多而复杂，并且成份之间有
可能存在相互作用，作用机制也各有不同。目前研
究表明，应用中药和其中的有效成分预防和治疗肿
瘤可以达到更好的效果。目前对马甲子的研究主要
集中在其根、茎、果实中化学成分的分离鉴定，而马
甲子叶中化学成分的研究还未见报道［13-15］，课题组
拟对马甲子的抗肿瘤药效物质基础及其作用机制进
行深入研究，为进一步将马甲子开发成一个新的抗
肿瘤药物提供实验依据。
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(2015 － 06 － 16 收稿 责任编辑:张文婷)
·623· WOＲLD CHINESE MEDICINE February． 2016，Vol． 11，No． 2