全 文 ：食用菌学报 2009.16(3):43～ 47
收稿日期:2009-07-22原稿;2009-08-12 修改稿
基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号:30660150)的部分研究内容
作者简介:邢仁昌(1970-), 男 , 1993年毕业于中国农业大学生物学院微生物专业 , 副研究员 ,在职博士 , 主要从事
微生物发酵与鉴定研究。
＊本文通讯作者
文章编号:1005-9873(2009)03-0043-05
蒙古口蘑液体发酵条件的优化
邢仁昌1 , 2 , 闫　伟1＊
(1 内蒙古农业大学林学院 , 内蒙古呼和浩特 010019;2 北京生物医药研究所 ,北京 100091)
摘　要:通过单因子试验和正交试验对蒙古口蘑(Tricholoma mongolicum)菌株 Q97的发酵培养基组成及发
酵条件进行了研究。结果表明:摇瓶发酵最佳培养基组成为豆饼粉 30 g/ L , 蔗糖 50 g/ L , K2HPO4 1 g/ L ,
CaCO3 1 g/ L , pH 自然 ,最佳发酵周期为 13 d。在上述条件下发酵 , 最大生物量达到 30 g/ L , 胞外多糖量达到
100 mg/ L以上 。
关键词:蒙古口蘑;液体培养;胞外多糖;生物量
　　蒙古口蘑(Tricholoma mongolicum Imai.)属伞
菌目(Agaricales)、口蘑科(Tricholomataceae)、口蘑属
(Tricholoma),1937年由日本真菌学者今井三子(S.
Imai)定名发表 ,并记载其汉语名称为白蘑菇[ 1] ,是
我国北方草原特有的大中型优质食用菌。
近年来 ,国内对蒙古口蘑的研究主要集中在
蘑菇圈特殊生态现象[ 2 ～ 9] 与促植物生长效
应[ 10 ～ 13] 方面 。由于蒙古口蘑至今尚不能实现人
工驯化栽培 ,自然生长季节性强 ,加之生态环境
恶化 、资源锐减 ,所以蒙古口蘑的产量和质量每
况愈下 ,难以满足商品化 、市场化的要求[ 14] 。为
了开发利用这一宝贵资源 ,我们对蒙古口蘑菌丝
体进行液体培养 ,以发酵液中生物量和胞外多糖
(exopo ly saccharide ,EPS)为目标产物 ,考察不同
参数对它们的影响 ,确定最佳培养基成分及发酵
周期 ,为其驯化栽培提供基础 。
1　材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
　　供试蒙古口蘑菌株 Q 97 ,由内蒙古农业大学
菌根实验室分离自锡林郭勒白音锡勒草原采集
的蒙古口蘑子实体 ,实验室采用微流控芯片电泳
技术和 RAPD指纹验证方法 ,证实 Q 97菌株是蒙
古口蘑子实体的分离物(相关数据将另文发表)。
1.1.2 培养基
　　PDA 培养基:马铃薯浸出粉 20 g , 葡萄糖
20 g ,琼脂 20 g ,蒸馏水 1000 mL , pH 自然 。
液体培养基:马铃薯浸出粉 20 g , 葡萄糖
20 g ,自来水 1000 mL ,pH 自然。
发酵基础培养基:豆饼粉 20 g ,蔗糖 20 g ,自
来水 1000 mL ,pH 自然。
1.2 方法
1.2.1 菌种活化
　　将保藏的菌种接在 PDA 斜面上 ,25 ℃培养
箱中静置培养 14 d 。
1.2.2 液体菌种的制备
　　将己活化好的蒙古口蘑菌株 Q 97斜面切成小
块 ,接种到 100 mL 液体培养基中(500 mL 三角
瓶),25 ℃、160 r/min ,摇床培养 21 d ,用超细匀
浆器打碎菌丝球 ,制备成一级种子液 。以 10%的
接种量将一级种子液再次接种于液体培养基中 ,
同法摇床培养 14 d ,制备成发酵种子液 。
1.2.3 摇瓶发酵培养
　　摇瓶发酵培养条件同发酵种子液制备 ,每组
设 5个重复。
1.2.4 最佳三角瓶筛选
　　选用 500 mL 容量的普通三角瓶 、广口三角
瓶 、底部加不锈钢弹簧三角瓶和具玻璃挡板三角
瓶 ,摇瓶发酵培养 ,方法同 1.2.2。
1.2.5 发酵培养基的优化
　　氮源筛选:以 20 g/L葡萄糖为碳源 ,采用酵母
食　用　菌　学　报 第 16 卷
膏 、牛肉膏 、蛋白胨 、豆饼粉 、奶粉 、麸皮 、棉籽饼粉 、
硫酸铵 、硝酸钾 、玉米浆作为氮源(硫酸铵 、硝酸钾
添加量为 10 g/L ,其它添加量为 20 g/L),调初始
pH 为 6.5左右 ,摇瓶发酵培养 , 方法同 1.2.2。
碳源筛选:以 20 g/ L 豆饼粉为氮源 ,采用葡
萄糖 、蔗糖 、果糖 、可溶性淀粉 、麦芽糖 、糊精 、甘
油 、大豆油为碳源(添加量均为 20 g/L), pH 自
然 ,摇瓶发酵培养 ,方法同 1.2.2。
1.2.6 发酵条件的优化
　　最佳初始 pH 筛选:发酵基础培养基用 10%
的 H 2SO 4 或 NaOH 分别调初始 pH 为 3.0 、4.0 、
5.0 、6.0 、7.0 、8.0 、9.0 ,以 pH 自然(6.5)为对照 ,
摇瓶发酵培养 ,方法同 1.2.2。
正交试 验:以豆 饼粉 、蔗 糖和 无 机 盐
K 2HPO 4 、 MgSO 4 · 7H2O 、 ZnSO 4 、 CaCO 3 、
KH 2PO 4 为实验因子 ,利用 L18(37)正交表 ,设计
7因素 3水平正交试验表(见表 1),摇瓶发酵培
养 ,方法同 1.2.2。
表 1　实验因子及水平 L18(37)
Table 1　Factor and levels of the [ L18(37)] orthogonal test
水平
Level
因素 Factor
A B C D E F G
豆饼粉 Soybean cake powder(%) 蔗糖 Sucrose(%)K2HPO4(%) MgSO4·7H2O(%) ZnSO4(%) CaCO3(%) KH2PO4(%)
1 2 2 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
2 3 3 0.1 0.1 0.05 0.1 0.05
3 4 5 0.2 0.2 0.1 0.2 0.1
　　最佳发酵时间试验:选择豆饼粉 30 g/L ,蔗
糖 50 g/ L , K2HPO4 1 g/L , CaCO3 1 g/L ,pH 自
然 ,摇瓶培养 ,从发酵第 3天到第 18天每天取下
三个摇瓶 ,测定生物量与胞外多糖含量 。
1.2.7 BIO 及 EPS 的测定
　　将 100 mL 发酵液用双层纱布过滤 ,蒸馏水
冲洗 ,菌丝体 60 ℃烘干至恒重 , 电子分析天平
称重 。
取发酵滤液 10 mL , 2 800 g离心 20 min ,取
上清3 mL ,加 95%乙醇 10 mL ,混匀后封口 ,4 ℃
冰箱过夜 ,2 800 g离心 20 min ,去上清 ,加 3 mL
蒸馏水摇匀后硫酸-蒽酮法测定多糖含量[ 15] 。
2　结果与分析
2.1 摇瓶类型对菌丝体液体发酵的影响
　　不同三角瓶对菌丝体生物量和胞外多糖量
的影响见图 1 ,具玻璃挡板三角瓶的生物量与胞
外多糖产率都明显高于另外三种 ,因此选具玻璃
挡板的三角瓶为蒙古口蘑液体发酵摇瓶。
2.2 氮源对菌丝体液体发酵的影响
　　不同氮源对菌丝体生物量和胞外多糖量的
影响见图 2 。与利用无机氮源相比 ,菌丝体利用
有机氮源时生物量及胞外多糖的量都较高 。利
用有机氮源时 ,棉籽饼粉的发酵产量最高 ,其次
为豆饼粉和奶粉 ,采用棉籽饼粉做氮源发酵产物
呈黑色 ,颜色视觉较差 ,不利于作为食品添加剂
开发;而豆饼粉成本低廉 ,原材料来源广泛 ,发酵
产物色感好 ,生物量及胞外多糖的产率都较高 ,
因此本研究选用豆饼粉为液体发酵的氮源 。
2.3 碳源对菌丝体液体发酵的影响
　　不同碳源对菌丝体生物量和胞外多糖量的
影响见图 3。除添加大豆油菌丝体不能生长外 ,
其它 7种碳源都能够被较好的利用 ,其中以蔗糖
为碳源时 ,生物量和胞外多糖量最高 ,因此本研
究选用蔗糖作为液体发酵的碳源 。
2.4 初始 pH值对菌丝体液体发酵的影响
　　pH 值对菌丝体生物量和胞外多糖量的影响
见图4 。生长最适初始pH 值是 6.5 ,初始 pH≤4
则菌丝体不能正常生长;初始 pH 值在 7 ～ 9 时 ,
1.普通三角瓶;2.广口三角瓶;3.底部加不锈钢弹簧三角瓶;4.具
玻璃挡板三角瓶
1.Standard flask;2.w ide-necked flask;3.f lask f it t ed w ith metal
sprin gs;4.f lask fit t ed w ith glass baf f le
图 1　三角瓶形状对口蘑 Q97深层发酵的影响
Fig.1　Effect of flask type on biomass and EPS production
by T.mongolicum strain Q97 in submerged culture
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第 3 期 邢仁昌 , 等:蒙古口蘑液体发酵条件的优化
菌丝体和胞外多糖有一定的生长和积累;在培养
过程中观察到 ,pH≥7时菌丝体的萌发及前期生
长均快于对照组 ,但发酵后期菌丝体不结球 ,造
成菌丝体生物量下降 , 同时不利于胞外多糖的
积累 。
2.5 正交试验优化发酵培养基
　　正交实验方案 、测定结果及极差分析见表 2。
极差分析结果表明 ,豆饼粉 、蔗糖是影响发
酵生物量的主要因素 ,添加 K 2HPO 4 、KH2 PO 4 、
MgSO4·7H 2O 、CaCO3 对生物量影响不显著 ,添
加 ZnSO 4 不利于生物量积累 。根据生物量指标
确定发酵的最优组合为 A3 B3 ,即豆饼粉40 g/L 、
蔗糖 50 g/ L。豆饼粉 、蔗糖亦是影响蒙古口蘑胞
外多糖形成的主要因素 , 添加少量的无机盐
K 2HPO 4(0.1%)、CaCO3(0.1%)有利于提高胞
外多糖的产率 , 添加 ZnSO 4 、MgSO 4·7H2O 与
KH 2PO 4 不利于胞外多糖的积累 。根据胞外多
糖指标确定发酵最优组合为 A2 B3 C2 F2 ,即豆
饼粉 30 g/ L 、蔗糖 50 g/L 、K2HPO 4 1 g/L 、
CaCO 3 1 g/ L。综合考虑 ,确定蒙古口蘑菌株 Q 97
的摇瓶发酵最佳培养基组成为豆饼粉 30 g/ L 、蔗
糖 50 g/L 、K2HPO 4 1 g/ L 、CaCO 3 1 g/L。
2.6 最佳发酵时间的确定
　　不同发酵时间生物量及胞外多糖量测定结
果见图 5 ,摇瓶发酵前 5 d 为蒙古口蘑菌丝体生
长的迟滞期 ,此阶段内菌丝体生长缓慢 ,产胞外
多糖量较低;发酵第 6 天菌丝体进入指数生长
期 ,该阶段菌丝体生长迅速 ,呈几何级数增长 ,胞
外多糖产量也迅速增加;到第 11天 ,菌丝体生长
进入减速期 ,但胞外多糖仍保持较高的产率 ,第
13天生物量及胞外多糖量均达到最大 ,此后菌丝
体生长趋于稳定 ,所以确定摇瓶发酵最佳时间为
13 d , 最大生物量达到 30 g/L , 胞外多糖达到
100 mg/ L以上 。
3　结论与讨论
　　本实验结果表明 ,4 种不同三角瓶对蒙古口
蘑菌株 Q 97液体发酵的生物量和胞外多糖量具有
不同影响 ,原因是由于三角瓶形状不同 ,液体发
酵过程中溶氧量会有较大差别 ,溶氧量大 ,生物
量与胞外多糖的产量也会有所增加;另外在菌丝
体生长过程中 ,碰撞效率的提高能够增加菌丝体
的生长点 ,具玻璃挡板的三角瓶不但对菌丝体的
冲击大 ,而且溶氧条件也最好 ,所以效果较好。
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食　用　菌　学　报 第 16 卷
表 2　正交实验结果的极差分析 L18(37)
Table 2　Extreme value analysis of [ L18(37)] orthogonal test
A B C D E F G
豆饼粉
Soybean cake powder
蔗糖
Sucrose
K2HPO4 MgSO4·7H2O Z nSO4 CaCO3 KH2PO4
生物量
Biomass
(g/ L)
胞外多糖
EPS
(mg/ 100mL)
1 1 1 1 1 1 1 1 10.5 8.8
2 1 2 2 2 2 2 2 10.7 9.9
3 1 3 3 3 3 3 3 13.2 10.0
4 2 1 1 2 2 3 3 14.6 7.7
5 2 2 2 3 3 1 1 14.8 9.0
6 2 3 3 1 1 2 2 20.4 11.2
7 3 1 2 1 3 2 3 23.7 7.8
8 3 2 3 2 1 3 1 26.1 8.5
9 3 3 1 3 2 1 2 28.1 8.6
10 1 1 3 3 2 2 1 11.2 6.7
11 1 2 1 1 3 3 2 12.5 8.1
12 1 3 2 2 1 1 3 17.3 9.2
13 2 1 2 3 1 3 2 22.3 9.6
14 2 2 3 1 2 1 3 21.7 9.7
15 2 3 1 2 3 2 1 18.5 11.2
16 3 1 3 2 3 1 2 23.7 7.1
17 3 2 1 3 1 2 3 26.6 8.9
18 3 3 2 1 2 3 1 27.1 10.5
K1 12.567 17.667 18.467 19.317 20.533 19.350 18.033
K2 18.717 18.733 19.317 18.483 18.900 18.517 19.617
K3 25.883 20.767 19.383 19.367 17.733 19.300 19.517
R 13.316 3.100 0.916 0.884 2.800 0.833 1.584
k1 8.783 7.950 8.883 9.350 9.367 8.733 9.117
k2 9.733 9.017 9.333 8.933 8.850 9.283 9.083
k3 8.567 10.117 8.867 8.800 8.867 9.067 8.883
r 1.166 2.167 0.466 0.555 0.517 0.550 0.234
图 5 蒙古口蘑 Q97生物量及胞外多糖量随发酵时间的变化
Fig.5　Time-courses of EPS and mycelial biomass
production by T.mongolicum strain Q97
in submerged culture
　　本实验结果表明 ,有机氮源较无机氮源更有
利于菌丝体的生长 ,可能有以下两个原因 ,一是不
同氮源在发酵过程中 pH 值不同 ,有机氮源在利
用过程中对发酵液 pH 值的改变 ,更有利于菌丝
体后期的结球 ,导致生物量与胞外多糖产量较高;
二是有机氮源除能够象无机氮源为蒙古口蘑的生
长提供氮源外 ,还能够提供维生素 、微量元素等营
养物质 ,这些物质在发酵过程中对蒙古口蘑菌丝
体生长有促进作用。
对蒙古口蘑菌株 Q97的发酵培养基组成及
发酵条件的研究结果表明:摇瓶发酵最佳培养
基组成为豆饼粉 30 g/L 、蔗糖 50 g/L 、K2HPO4
1 g/L 、CaCO3 1 g/L , pH 自然 ,最佳发酵周期为
13 d。蒙古口蘑 Q97菌丝体在该条件下进行发
酵 ,最大生物量达到 30 g/L , 胞外多糖量达到
100 mg/ L以上 ,这为进一步研究利用蒙古口蘑
46
第 3 期 邢仁昌 , 等:蒙古口蘑液体发酵条件的优化
提供参考 。
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[本文编辑] 　王瑞霞
Optimization of Selected Parameters Affecting Biomass and
Extracellular Polysaccharide Production by Tricholoma
mongolicum , St rain Q97 ,Grown in Submerged Culture
XING Renchang
1 , 2 , YAN Wei1＊
(1College of Forestr y , I nner Mongolia Agr icultur e University , H ohhot , I nne r Mongolia 010018 , China;
2Beijing Institute of Biomedicine , Beijing 100091 , China)
Abstract:The eff ects of sele cted cultur e par ameters on myce lial biomass and polysacch aride production by a
str ain of Tricholoma mongolicum (Q97)are descr ibed.Using an optimized fe rment ation medium consisting of
30 g/ L soybean cake powder , 50 g/ L sucrose , 1 g/ L K2H PO4 , 1 g/ L CaCO3 and an unadjusted pH ,
maximum mycelial biomass production (30 g/ L)and exopolysacchar ide production (100 mg/ L)was recorded
af ter ～ 13 d incubation.
Key words:Tricholoma mongolicu m ;submerged culture;exopolysacch aride;mycelial biomass
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