全 文 ：基金项目：国家自然科学基金项目“中国野生双孢蘑菇种质资源调查、鉴定与重要性状评价”(30671456)；福建省科技厅重大项目“福建省食用菌种质
资源科技共享平台建设及相关技术研究”(2006S1001)；福建省自然科学基金重点项目“中国野生双孢蘑菇种质资源调查、鉴定与重要性状评价”
(B0620004)；福建省农科院创新基金项目“利用野生种质创新选育双孢蘑菇抗逆新菌株”。
第一作者简介：陈美元，男，1972年出生，高级工程师，主要从事食用菌基因工程育种研究，发表主笔论文10多篇。通信地址：350014福州市晋安区
前横路95弄10号福建省蘑菇菌种研究推广站，Tel：0591-83334374，E-mail：cmy1972@gmail.com。
通讯作者：王泽生，男，1954年生，教授级高工，主要从事食用菌遗传育种研究，发表主笔论文100多篇，育成双孢蘑菇优良菌株As2796系列，Tel：0591-83355169，
E-mail：mushroom@public.fz.fj.cn。
收稿日期：2008-10-30，修回日期：2008-11-13。
双孢蘑菇栽培菌株遗传多样性的
DNA指纹分析
陈美元，廖剑华，李洪荣，郭仲杰，卢政辉，蔡丹凤，王泽生
(福建省农业科学院，福建省蘑菇菌种研究推广站，福州，350014)
摘 要：对206个收集自世界各地的双孢蘑菇栽培菌株的总DNA进行大规模的SRAP、ISSR和RAPD分
析，共获得15条SRAP、3条 ISSR和2条RAPD特异性标记条带。利用这20个标记条带对206个菌株进
行统计和聚类分析，获得亲缘关系树状图。结果显示在28%的相似值上，206个菌株可以分为高产型和
优质型两大类群。其中，优质类群主要包含优质传统菌株(代表菌株8213、8211)和优质杂交菌株(代表
菌株为福建省蘑菇菌种研究推广站选育的As2796、As4607)两大类，高产类群也主要包含高产传统菌株
(代表菌株01、02)和高产杂交菌株(代表菌株为荷兰选育的U1、U3)两大类。而在100%相似值上，可分为
大小72个类群，每群包含菌株数为1~31不等。
关键词：双孢蘑菇；SRAP；ISSR；RAPD；聚类分析
中图分类号：S646.1+1 文献标识码：A
DNA Fingerprinting of Genetic Diversity of Agaricus bisporus
Cultivation Strains
Chen Meiyuan, Liao Jianhua, Li Hongrong, Guo Zhongjie, Lu Zhenghui,
Cai Danfeng, Wang Zesheng
(Fujian Mushroom R&D Station, Fujian Academy of Agricultural Science, Fuzhou 350014)
Abstract: 206 cultivation strains of Agaricus bisporus collected from all over the world were studied by using
the techniques of SRAP, ISSR and RAPD fingerprinting, and 15 special SRAP bands, 3 special ISSR bands
and 2 special RAPD bands were obtained. The strains were analyzed and clustered based on the 20 special
bands and a dendrogram was obtained. The results showed that 206 strains be divided into high-production
group and good-quality group at the similarity coefficient of 28% . The good-quality group mainly contains
good-quality traditional strains (with representative strain of 8213 and 8211) and good-quality hybrid strains
(with representative strain of As2796 and As4607 bred by Fujian Mushroom R&D Station). The
high-production group mainly contains high-production traditional strains (with representative strain of 01 and
02) and high-production hybrid strains (with representative strain of U1 and U3 bred by the Netherland). And
at the similarity coefficient of 100%, the strains were divided into 72 groups with strain number range of 1-31.
Key words: Agaricus bisporus, SRAP, ISSR, RAPD, cluster analysis
中国农学通报 2009,25(04):149-156
Chinese Agricultural Science Bulletin
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
SRAP(sequence-related amplified polymorphism，
序列相关扩增多态性)技术是Li等人在2001年发展的
一种新型分子标记[1]。该标记通过独特的引物设计对
开放阅读框(ORFs)进行扩增，可因个体不同以及物种
的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性的
扩增产物，具有简便、稳定、在基因组中分布均匀等特
点。 ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat，简单序列重
复区间)是一种基于微卫星序列发展起来的新型DNA
分子标记技术[2]。它利用人工设计合成的核苷酸重复
序列引物对SSR(Simple Sequence Repeat，简单序列重
复)之间的DNA序列进行半随机PCR扩增，可获得丰
富的多态性。RAPD(Random Amplified Polymorphic
DNA，随机扩增的多态性DNA)技术是较早发展起来
的DNA分子标记技术，具有快速、安全、简便、灵敏度
高、需样量少的特点。笔者利用SRAP、ISSR和RAPD
3种DNA分子标记技术，对收集自世界各地的 206个
双孢蘑菇栽培菌株进行大规模的DNA指纹分析，以期
获得它们的亲缘关系，并选出一批特异性标记条带，为
这些菌株的鉴定、鉴别以及杂交亲本的选择提供DNA
水平的依据。
1 试验
1.1 时间与地点
试验于 2006年 10月—2007年 1月在福建省蘑菇
菌种研究推广站的中美合作食用菌基因工程实验室进
行。
1.2 材料
1.2.1 菌株 双孢蘑菇 206个栽培菌株收集自世界各
地，由福建省蘑菇菌种研究推广站保藏并提供。
1.2.2 试剂 PCR试剂盒及其它试剂均购自上海生工
生物工程服务有限公司。
1.2.3 引物
（1）所用SRAP上游引物9条及下游引物17条[1]由
华大基因上海鼎安生物科技有限公司合成，其序列见
表1。
表1 SRAP引物及其序列
下游引物
em1, 5-GACTGCGTACGAATTAAT-3
em2, 5-GACTGCGTACGAATTTGC-3
em3, 5-GACTGCGTACGAATTGAC-3
em4, 5-GACTGCGTACGAATTTGA-3
em5, 5-GACTGCGTACGAATTAAC-3
em6, 5-GACTGCGTACGAATTGCA-3
em7, 5-GACTGCGTACGAATTATG-3
em8, 5-GACTGCGTACGAATTAGC-3
em9, 5-GACTGCGTACGAATTACG-3
em10, 5-GACTGCGTACGAATTTAG-3
em11, 5-GACTGCGTACGAATTTCG-3
em12,5-GACTGCGTACGAATTGTC-3
em13, 5-GACTGCGTACGAATTGGT-3
em14, 5-GACTGCGTACGAATTCAG-3
em15, 5-GACTGCGTACGAATTCTG-3
em16, 5-GACTGCGTACGAATTCGG-3
em17, 5-GACTGCGTACGAATTCCA-3
上游引物
me1, 5-TGAGTCCAAACCGGATA-3
me2, 5-TGAGTCCAAACCGGAGC-3
me3, 5-TGAGTCCAAACCGGAAT-3
me4, 5-TGAGTCCAAACCGGACC-3
me5, 5-TGAGTCCAAACCGGAAG-3
me6, 5-TGAGTCCAAACCGGTAG-3
me7, 5-TGAGTCCAAACCGGTTG-3
me8, 5-TGAGTCCAAACCGGTGT-3
me9, 5-TGAGTCCAAACCGGTCA-3
（2）所用 71条 ISSR引物参照加拿大UBC大学设
计的序列[3]，由华大基因上海鼎安生物科技有限公司
合成，其序列见表2。
（3）所用 72条随机引物为Sangon产品，其编号为
S241~S260， S1~S10， S101~S110， S301~S310，
S401~S410，S501~S510，S261，S262。
1.3 方法
1.3.1 菌丝的培养 菌种接入常规 PDA斜面培养基，
24℃培养21天。
1.3.2 总DNA的提取 按美国Sylvan公司提供的方法
并加以改进。
刮取适量斜面培养基上的菌丝，-70℃冰冻后砸
碎，移入 750 μl预冷的抽提缓冲液(100 mM Tris-Cl，
pH8.0；50 mM EDTA；500 mM NaCl；20 mM NaHSO3)
中，旋涡振荡。加入 100 μ l 10% SDS，颠倒混匀，在
65℃保温 15 min，加入 250 μl 5M KOAc，再次混合均
匀，冰上放置 20 min。16000 r/min离心 5 min后，上清
用酚/氯仿抽提 1次。再次同样离心后，上清加 0.7倍
·· 150
体积的异丙醇，室温沉淀 10 min。离心收集沉淀，用
70%乙醇洗 1遍，吹干后溶于 20 μ l TE(含 17 μg/ml
RNaseA)，通过琼脂糖凝胶电泳检查总DNA质量并定
量后，-20℃保存备用。
1.3.3 SRAP分析 根据文献报道[1,4]并加以摸索改进。
（1）PCR反应体系。20 μl反应体系含：30 ng模板
DNA，30ng上游引物，30 ng下游引物，0.1 mmol/L
dNTPs，2.5 mmol/L MgCl2，1 U Taq DNA聚合酶，1×
PCR缓冲液。
（2）PCR扩增条件。94℃预变性5 min，94℃变性
1 min、35 ℃退火 1 min、72 ℃延伸 1 min、扩增 5个循
环，94℃变性1 min、50℃退火1 min、72℃延伸1 min、
扩增35个循环，72℃延伸10 min。
（3）电泳。扩增产物 20 μl进行 1.5%琼脂糖凝胶
电泳。GeneFinder荧光染料染色并拍照。
1.3.4 ISSR分析 根据文献报道[5-6]并加以摸索改进。
（1）PCR反应体系。20 μl反应体系：30 ng模板
DNA，30 ng 引物，0.1 mmol/L dNTPs，2.5 mmol/L
MgCl2，1 U Taq DNA聚合酶，1×PCR缓冲液。
（2）PCR扩增条件。94℃预变性5 min，94℃变性
30 s，52℃退火 45 s，72℃延伸 1 min30s，扩增 40个循
环，72℃延伸7 min。
（3）电泳。同1.3.3（3）。
1.3.5 RAPD分析 方法同前[7]。
2 结果与分析
2.1 双孢蘑菇栽培菌株的SRAP指纹图谱分析
先用不同类型的少数菌株进行SRAP引物对的筛
选，选出能产生较佳带型和具有较好重复性的引物
对。进一步用筛选出的引物对进行双孢蘑菇206个栽
培菌株总 DNA的 SRAP分析，从引物对 me1-em2，
me1-em5，me2-em3，me2-em4，me5-em9，me5-em10中
共找到 15 条标记条带，分别命名为 SRAP1-21300，
SRAP1-2750，SRAP1-51450，SRAP1-51000，SRAP2-31800，
SRAP2-3950， SRAP2-3700， SRAP2-3400， SRAP2-3200，
SRAP2-41200，SRAP5-9650，SRAP5-101200，SRAP5-10570，
SRAP5-10500，SRAP5-10400。图 1~图 4显示了部分菌株
的SRAP带型，并用箭头指示了部分标记条带。利用
上述标记条带对206个栽培菌株进行了初步的聚类分
析，在100%的相似值上可见206个菌株聚为大小不等
的类群，包含的菌株数从1株到数10株不等，即较大类
群中的菌株均有上述15条标记条带，它们的进一步鉴
别还需要更多的标记。
2.2 双孢蘑菇栽培菌株的 ISSR指纹图谱分析
在双孢蘑菇的 ISSR引物初筛中发现，在52℃退火
条件下，71个 ISSR引物只有 19个能产生可鉴别的稳
定带型，其余均产生弥散状不可鉴别带型。这 19个
ISSR引物为 807、808、809、810、811、822、825、827、
834、835、841、842、852、853、854、855、857、866、868。
利用这 19个引物对上述 15个SRAP标记条带未能区
分的传统优质菌株72个和传统高产菌株24个作 ISSR
分析，在找到新的标记后，再进一步对206个栽培菌株
作 ISSR分析。在 19个引物中共发现 2个引物(808，
809)能稳定体现该2个类群的群内差异(图5~图6)，并
找到 3条标记条带，它们是 ISSR8081650，ISSR8081100，
ISSR8092100，利用这些标记带又可以把大的类群细分
为几个群。
表2 ISSR引物编号及其序列
注：R=(A，G)，Y=(C，T)。
陈美元等：双孢蘑菇栽培菌株遗传多样性的DNA指纹分析 ·· 151
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2.3 双孢蘑菇栽培菌株的RAPD指纹图谱分析
以少数菌株进行RAPD扩增，对72个RAPD随机
引物进行初筛，发现26个引物有较佳带型。进一步用
这26个随机引物对上述 ISSR分析中的传统优质菌株
72个和传统贴生菌株24个作RAPD分析，在找到新的
标记后，再进一步对 206个栽培菌株作RAPD分析。
在 26个引物中共发现 2个引物(S258，S402)能稳定体
现群内差异(图 7~图 8)，并找到 2条标记条带，它们是
RAPD2581900、RAPD402950。
图1 24个双孢蘑菇栽培菌株的SRAP图谱(引物对me1-em2)
注：两端泳道为Lambda DNA/EcoRI+HindIII Markers，箭头示意标记条带位置，下同。
图2 24个双孢蘑菇栽培菌株的SRAP图谱(引物对me1-em5)
图3 24个双孢蘑菇栽培菌株的SRAP图谱(引物对me2-em3)
图4 24个双孢蘑菇栽培菌株的SRAP图谱(引物对me5-em9)
·· 152
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←
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2.4 双孢蘑菇栽培菌株的聚类分析
以上述 15条 SRAP、3条 ISSR和 2条RAPD标记
条带对 206个双孢蘑菇栽培菌株相对应的DNA图谱
进行分析和统计。使用NTSYSpc-2.02j软件进行分析
和聚类，得到 206个菌株的亲缘关系树状图。因菌株
数目较多，树状图分 2页显示(图 9~图 10)。结果显示
在 28%的相似值上，206个菌株可以分为优质型和高
产型两大类群。其中，优质类群主要包含优质传统菌
株(代表菌株8213、8211)和优质杂交菌株(代表菌株为
福建省蘑菇菌种研究推广站选育的As2796、As4607)
两大类，高产类群也主要包含高产传统菌株(代表菌株
01、02)和高产杂交菌株(代表菌株为荷兰Horst蘑菇试
验站选育的U1、U3)两大类，规律性非常明显。而在
100%相似值上，可分为大小 72个类群。其中有 49个
图5 24个双孢蘑菇优质菌株的 ISSR图谱(引物 ISSR808)
图6 24个双孢蘑菇优质菌株的 ISSR图谱(引物 ISSR809)
图7 24个双孢蘑菇优质菌株的RAPD图谱(引物S258)
图8 24个双孢蘑菇优质菌株的RAPD图谱(引物S402)
陈美元等：双孢蘑菇栽培菌株遗传多样性的DNA指纹分析 ·· 153
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图9 双孢蘑菇206个栽培菌株的亲缘关系树状图 I
0.28 0.37 0.46 0.55 0.64 0.73 0.82 0.91 1.00
Coefficient
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图10双孢蘑菇206个栽培菌株的亲缘关系树状图 II
0.28 0.37 0.46 0.55 0.64 0.73 0.82 0.91 1.00
Coefficient
陈美元等：双孢蘑菇栽培菌株遗传多样性的DNA指纹分析 ·· 155
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
菌株已单独分出，其余类群分别包含 2~31个菌株，最
大的类群仍为优质传统菌株。
3 讨论
SRAP、ISSR、RAPD 3种DNA分子标记技术已被
应用于多种经济作物的比较基因组学、遗传图谱构建、
遗传多样性分析、基因定位、种质鉴定、遗传变异分析
甚至系统发生学研究等方面等[1,8-15]。笔者应用这 3种
技术对双孢蘑菇栽培菌株进行系统的分析，构建了它
们的亲缘关系图，并获得了 20条特异性标记条带，为
杂交育种的亲本选择以及这些菌株的鉴定提供了分子
水平的依据。该研究结果与王泽生等人应用同工酶技
术把双孢蘑菇分为高产、优质、杂交和不育四大类型的
结果非常类似[16]。
经过大规模的DNA指纹研究，笔者获得了 15条
SRAP、3条 ISSR和2条RAPD标记条带。它们作为双
孢蘑菇的特异性分子标记，可用于鉴定、鉴别双孢蘑菇
菌株特别是试验所用的206个栽培菌株。没有使用整
个扩增图谱的所有条带进行统计分析而是挑选少数的
特异性条带，是因为这些标记条带重复性更好，条带的
有无清晰可辨，也方便日后制备成SCAR标记，快速进
行菌株的鉴别。
利用这些特征性条带及其相应的引物对，可以对
这206个菌株建立特征性数据库。进一步的工作可以
应用更多的引物组合、更多的蘑菇属内菌株进行更大
规模的DNA分析，建立起蘑菇属的DNA指纹特征性
数据库，更好地进行双孢蘑菇的种性鉴别和指导杂交
育种。
参考文献
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