全 文 ：Mycosystema     
菌 物 学 报 15 May 2011, 30(3): 508-513

jwxt@im.ac.cn
ISSN1672-6472 CN11-5180Q
©2011 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved.






基金项目：国家自然科学基金（No. 30871769），福建省重大专题（No. 2008SZ0002）
*Corresponding author. E-mail: mrcfafu@163.com
收稿日期: 2010-12-29, 接受日期: 2011-03-18

双孢蘑菇基质降解能力退化的差异蛋白质组学分析
陈美元 1,2 王泽生 1 廖剑华 1 李洪荣 1 蔡志欣 1 谢宝贵 2*
1福建省农业科学院食用菌研究所 福州 350014
2福建农林大学菌物研究中心 福州 350002


摘 要：对双孢蘑菇CGMCC No. 0214及其基质降解能力退化菌株 0214-3、0214-5进行了蛋白质双向电泳（2-DE或 2D-PAGE）
分析，发现了 2 个明显的、可重复的差异蛋白质，在退化菌株中分别为上调和下调表达，且 2 个退化菌株表现一致。根据质
谱（MALDI-TOF/MS）分析和数据库检索结果，2 个差异蛋白质初步鉴定为肌动蛋白和 NADH 脱氢酶铁硫蛋白 3。
关键词：食用菌，蛋白质组，双向电泳，差异蛋白质，质谱分析

Differential proteomics analysis of degeneration on the substrate-
decomposing of Agaricus bisporus
CHEN Mei-Yuan1, 2 WANG Ze-Sheng1 LIAO Jian-Hua1 LI Hong-Rong1 CAI Zhi-Xin1
XIE Bao-Gui2*
1Edible Fungi Institute of Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350014, China
2Mycological Research Center of Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China
Abstract: The technique of two-dimensional electrophoresis (2-DE or 2D-PAGE) was used to analyze the protein expression
differences between the wild type Agaricus bisporus CGMCC No. 0214 and its substrate-decomposing ability degenerated strains
0214-3, 0214-5. As a result, two proteins were found to be up- and down-expressed, respectively, with obvious and repeatable
profiles in both degenerated strains when grown in a liquid culture. Based on the results of MALDI-TOF/MS analysis and database
searching, these two proteins were identified as an actin and a putative NADH dehydrogenase iron-sulfur protein 3, respectively. The
results of this study provided a marker on the proteomics level for further study of the molecular mechanism of
substrate-decomposing ability degeneration in A. bisporus.
Key words: edible fungus, proteome, two-dimensional electrophoresis, differential protein, MALDI-TOF/MS analysis
DOI:10.13346/j.mycosystema.2011.03.014
Vol.30 No.3 509
菌物学报
双孢蘑菇 Agaricus bisporus (J.E. Lange) Imbach
杂交菌株 CGMCC No. 0214（中国普通微生物菌种
保藏中心保藏号，简称 0214，下同）是本单位选育
成功的优良商业蘑菇菌株，已在国内推广应用多年
（Wang 2005）。在该菌株多年试验研究及生产供应
的过程中我们偶然发现了 2 个自然突变体材料，在
基质降解能力上表现出严重的退化现象。为探讨该
退化性状发生的分子机理，在前期研究中，我们对
正常与退化菌株进行了多种同工酶的电泳分析，结
果发现退化菌株的酯酶（EST）和多酚氧化酶（PPO）
同工酶在不同培养基样品中存在上调或下调表达
的多个可重复差异条带（李洪荣等 2010）。对 3 个
菌株进行了 24 对引物组合的 mRNA 差异显示
（DDRT-PCR）分析，结果发现 8 对引物组合体现
了可重复的差异，并克隆了 9 条差异片段，序列分
析结果显示 9 条差异片段体现了 5 个基因的差异，
其中部分与基质降解相关酶类有较高的同源性（陈
美元等 2010）。
双向电泳（ two-dimensional electrophoresis，
2-DE 或 2D-PAGE）技术由 O′Farrell（1975）年首
次建立，是目前唯一可将数千种蛋白质同时分离的
方法，成为蛋白质组研究的核心技术之一。它是等
电聚焦电泳（IEF）和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺
凝胶电泳（SDS-PAGE）的组合，即先进行 IEF（按
照 pI 分离），然后再进行 SDS-PAGE（按照分子量
大小分离），经染色得到的电泳图是个二维分布的
蛋白质图。该技术在生命科学的各个领域已得到广
泛的应用，但在食用菌研究中的报道并不多见，主
要有绣球菌和猴头菌功能蛋白组分的蛋白质组学
（Horie et al. 2008）、斑玉蕈低温胁迫下菌丝体的差
异蛋白质组学（胡开辉等 2009）、双孢蘑菇耐温差
异蛋白质组学（陆兆明等 2010）等的分析。在本
研究中，我们应用 2D-PAGE 技术，对正常与退化
菌株进行蛋白质组学水平上的分析，以期发现二者
在特定基质中蛋白质表达的差异。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
1.1.1 菌株：双孢蘑菇杂交菌株 CGMCC No. 0214
及其退化突变体菌株 0214-3（液氮保藏种变异）、
0214-5（草基保藏种变异）由福建省农科院食用菌
研究所种质资源与遗传育种研究室保藏并提供。
1.1.2 试剂：等电聚焦 IPG 预制胶条、40%丙烯酰
胺/甲叉双丙烯酰胺（37.5:1）溶液、载体两性电解
质购自 BioRad 公司，尿素、CHAPS、DTT、SDS、
甘氨酸、TEMED、考马斯亮蓝 G-250 为 BBI 公司
产品，Bradford 蛋白质定量试剂盒、蛋白质 Marker
及其他试剂均购自上海生工生物工程服务有限公司。
1.2 方法
1.2.1 菌丝的培养：菌种接入液体培养基（20%发酵
粪草浸汁，2%葡萄糖，pH 自然）中，24℃静置培
养 3 周。
1.2.2 蛋白质的提取：将菌丝体用无菌纱布挤干水
分，加液氮研磨成粉末，每 100mg 干粉加 0.5mL
蛋白质抽提液[500mmol/L Tris-HCl（ pH7.8），
50mmol/L EDTA ， 2% β- 巯基乙醇， 2mmol/L
PMSF]，冰浴 10min，加入等体积 Tris-饱和酚，旋
涡振荡混匀，4℃ 13,000×g 离心 15min，抽取下层
有机相，加入 4 倍体积预冷甲醇，−20℃放置过夜，
4℃ 13,000×g 离心 10min，蛋白质沉淀用预冷甲醇
洗涤一遍，置超净台内吹干，加适量裂解缓冲液
[8mol/L 尿素，2% CHAPS，50mmol/L DTT（使用
前加入），0.2%载体两性电解质，0.0002%溴酚蓝]
充分溶解，−70℃保存备用。
1.2.3 蛋白质的定量：使用改良 Bradford 法，按上
海生工生物工程服务有限公司改良Bradford蛋白质
定量试剂盒说明书进行。
1.2.4 蛋白质双向电泳及染色：使用 BioRad 双向电
泳设备，按 BioRad 蛋白质组双向电泳实验操作手
册进行，并进行摸索与优化，使用胶体考马斯亮蓝
对电泳后的凝胶进行染色。
1.2.5 凝胶扫描与分析：使用 UMAX Powerlook
2100XL-USB 扫描仪对脱色后的凝胶进行扫描，用
BioRad PDQuest8.01 软件进行分析。
1.2.6 质谱分析与数据库检索：差异蛋白质点用刀
片切下，送交北京蛋白质组研究中心进行质谱
（MALDI-TOF/MS）分析与数据库检索，包括 NCBI
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数据库（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）和双
孢蘑菇基因组数据库（ http://genome.jgi-psf.org/
Agabi_varbisH97_2/Agabi_varbisH97_2.home.html）。
2 结果与分析
2.1 双孢蘑菇蛋白质 2D-PAGE 技术的建立
对双孢蘑菇总蛋白质的双向电泳条件进行了
摸索与优化，建立了双孢蘑菇蛋白质的 2D-PAGE
技术，电泳条件优化如下：1）使用苯酚法抽提总
蛋白质。2）蛋白质样品溶解液配方为：8mol/L 尿
素，2% CHAPS，50mmol/L DTT（使用前加入），
0.2%载体两性电解质，0.0002%溴酚蓝。3）窄 pH
范围的 7cm 胶条加样量 125－150µL，400µg 左右
蛋白质，17cm 胶条加样量 300－350µL，1,400µg
左右蛋白质。4）第一向电泳达到聚焦电压后 7cm
胶条聚焦 20,000VHrs，17cm 胶条聚焦 90,000VHrs。
5）第二向 SDS-PAGE 使用 12.5%的聚丙烯酰胺凝
胶。按照以上的优化电泳条件获得了清晰的
2D-PAGE 图谱，结果表明双孢蘑菇的蛋白质大部分
集中在分子量 20－120kDa、等电点 pI5.2－7.8 的范
围内（图 1），因此第一向使用 pH5－8 胶条可以检
测双孢蘑菇的多数蛋白质。
2.2 双孢蘑菇 0214 及其退化菌株的 2D-PAGE 分析
按照上述建立的双孢蘑菇 2D-PAGE 技术，对
0214 及其 2 个退化菌株在同工酶和 DDRT-PCR 分
析中产生较多差异的培养基（陈美元等 2010；李
洪荣等 2010）培养的菌丝体样品的总蛋白质进行
了分析。结果表明正常与退化菌株的 2D-PAGE 图
谱较为相似，比较明显的差异为数不多，其中差异
蛋白点 1 和 2 各自在两个退化菌株中表现一致（图
2），差异蛋白质 1 在两个退化菌株中均为上调表达，
而差异蛋白质 2 则为下调表达。它们在不同批次培
养和提取的蛋白质样品的 2D-PAGE 中具有良好的
重复性（图 3）。
2.3 差异蛋白质点的质谱分析与鉴定
差异蛋白质点 1 和 2 在北京蛋白质组研究中心
进行质谱（MALDI-TOF/MS）分析，获得二级肽指
纹图谱，并在 NCBI 数据库与双孢蘑菇基因组数据
库中进行检索。其中差异蛋白质 1 在 NCBI 数据库
中与裂褶菌 Schizophyllum commune 的一种肌动蛋
白（Actin-1，登录号为 gi|14194451）匹配肽段数为
13 条，其序列分别为：AGFAGDDAPR，GYPF
TTTAER，QEYDESGPGIVHR，IWHHTFYNELR，
MQKELTALSPSSMK ， QEYDESGPGIVHRK ，
SYELPDGQVITIGNER，VAPEEHPVLLTEAPLNPK，
ELTALSPSSMKVKIVAPPER，AGFAGDDAPRAVF
PSIVGRPR ， DLYGNVVLSGGTTMFPGIADR ，
NLMERGYPFTTTAEREIVR，HQGVMVGMGQKD
SYVGDEAQSKR。匹配的综合得分（Protein Score）
为 121，综合可信度（Protein Score C.I.%）为 100，

图 1 双孢蘑菇菌丝体总蛋白质的 2D-PAGE 图谱 A：等电聚焦电泳使用 pH5-8、7cm 胶条；B：等电聚焦电泳使用 pH5-8、17cm 胶条.
Fig. 1 2D-PAGE patterns of total proteins extracted from Agaricus bisporus mycelia. A: pH5-8, 7cm IPG strip for IEF; B: pH5-8, 17cm IPG strip for
IEF.
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因此可以鉴定为肌动蛋白（Actin）。它在双孢蘑菇
基因组数据库中与某种预测蛋白（编号为
>jgi|Agabi_varbisH97_2|117354|Genemark.3822_g ）
有最佳匹配，而该预测蛋白与上述裂褶菌的肌动蛋
白同源性最高，进一步确定差异蛋白质 1 即为肌
动蛋白。

图 2 双孢蘑菇 0214 及其退化菌株菌丝体总蛋白质的 2D-PAGE 图谱 I A：0214；B：0214-3；C：0214-5. 数字与箭头指示差异并放大
显示.
Fig. 2 2D-PAGE patterns I of total proteins extracted from the mycelia of Agaricus bisporus 0214 and its degenerated mutants. A: 0214; B: 0214-3; C:
0214-5. The numbers and arrows showed and magnified the differences.

图 3 双孢蘑菇 0214 及其退化菌株菌丝体总蛋白质的 2D-PAGE 图谱 II A：0214；B：0214-3；C：0214-5. 数字与箭头指示差异并放大
显示.
Fig. 3 2D-PAGE patterns II of total proteins extracted from the mycelia of Agaricus bisporus 0214 and its degenerated mutants. A: 0214; B: 0214-3;
C: 0214-5. The numbers and arrows showed and magnified the differences.
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差异蛋白质 2 在所检索的数据库中都没有可信
度超过 95%的匹配结果，位于得分前列的为致倦库
蚊 Culex quinquefasciatus 的 NADH 脱氢酶铁硫蛋
白 3（NADH dehydrogenase iron-sulfur protein 3），
其综合得分为 79，综合可信度为 89.3，共有 15 条
肽段得到匹配，其序列分别为：YDDEKKR，
YVAECMPK，KLFGMASILR，RDFPLTGYVELR，
YVAECMPKYVQK，CKSEAAAESRPTVR，QYRFE
VIYNILSLR，KLFGMASILRSLATVAR，SGVLA
GNGLARSATVPALIR，FDLSAPESAEQFYFLCR，
SGVLAGNGLARSATVPALIRCK ， EIWDMYGVF
FANHPDLRR，ASILRSLATVARSGVLAGNATVR，
KPDAAARADLSDFGKYVAECMPK，DHHQAQFA
NLVDIAGMDVPSRQYR。因此，差异蛋白质 2 可
能为 NADH 脱氢酶铁硫蛋白的一种（NADH
dehydrogenase iron-sulfur protein 3）。
3 讨论
双向电泳技术对供试的总蛋白质质量要求较
高。为提取获得高质量的双孢蘑菇总蛋白质，我们
试验了 TCA/丙酮法和苯酚抽提法。结果表明苯酚
抽提法对双孢蘑菇菌丝体较为合适，与 TCA/丙酮
法相比，其提取的蛋白质杂质较少，易于溶解，得
率也较高，达 8－10mg/g 湿菌体。SDS-PAGE 检测
结果表明其蛋白质质量也较好，降解少，在高分子
量区域比 TCA/ 丙酮法多出多个条带，适于
2D-PAGE 分析。这与刘晓云等（2009）在药用菌灵
芝子实体原基的总蛋白质提取中的结论类似。
本研究通过 2D-PAGE 技术获得与双孢蘑菇基
质降解能力退化相关的 2 个差异蛋白质，分别鉴定
为肌动蛋白与 NADH 脱氢酶铁硫蛋白。有关文献显
示肌动蛋白是真核细胞骨架微丝的主要成分，对于
多种细胞功能都是必需的，参与细胞分裂、运动、
胞内信号传导等重要生理事件，最近的研究表明细
胞核内也存在肌动蛋白，且参与核内 3 种 RNA 聚
合酶所介导的基因转录过程（王卓等 2007；王洪
振和程焉平 2005）。真核生物线粒体中 NADH 脱氢
酶铁硫蛋白所在的铁硫中心是超氧阴离子产生的
部位，与细胞中活性氧的含量及浓度关系密切。而
细胞内活性氧与线粒体代谢、胞内信号通路、核
DNA 转录调控等有关（孙海平和汪晓峰 2009）。本
研究结果提供了一种可能性，就是这 2 个差异蛋白
基因的变异可能影响到细胞内信号传导或转录调
控等过程，进而造成一系列基因转录与表达的差
异，比如我们之前在同工酶和 mRNA 上获得的系列
差异。这些差异之间并无直接的同源性，但不排除
它们有间接的相关性，表明基质降解能力上的退化
现象不是单一结构蛋白基因的变异，而可能是调控
基因的变异，导致基因表达网络的改变，最终在转
录水平、蛋白质水平、细胞水平及生物体上表现出
系列差异。这是一个初步的假设，需要更多进一步
的研究和验证。
本研究室率先对双孢蘑菇基质降解能力退化
现象的分子机理开展了探索性研究，通过设计不同
的培养基培养正常与退化菌株，在同工酶、mRNA
和蛋白质方面均发现了一些明显的、可重复的差
异，首次分离、鉴定了一批与双孢蘑菇基质降解能
力退化相关的差异 cDNA 片段和蛋白质，为该项研
究的深入开展奠定了良好的基础。
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