全 文 ：芘高效降解菌的分离鉴定及其降解特性*
钟摇 鸣**摇 张佳庆摇 吴小霞摇 杨摇 峰摇 马摇 慧摇 陈丽静
(沈阳农业大学辽宁省农业生物技术重点实验室, 沈阳 110161)
摘摇 要摇 以芘为唯一碳源,采用富集培养方法,从沈抚灌区石油污染土壤中分离得到一株芘
降解菌 ZQ5 .根据形态学观察、生理生化鉴定和 16S rDNA 序列分析结果,将菌株 ZQ5 鉴定为
寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp. ) .采用摇瓶振荡培养方法研究该菌株降解芘的特性及培
养条件对降解效能的影响.结果表明:菌株 ZQ5 在 30 益振荡培养 10 d后,对 100 mg·L-1的芘
降解率为 91郾 2% ,加入水杨酸(100 mg·L-1)作为共代谢底物可以提高菌株 ZQ5 对芘的降解
率.当培养基 pH为 7 ~ 8、盐浓度不高于 2%时,有利于菌株 ZQ5 降解效能的发挥.
关键词摇 芘摇 生物降解摇 多环芳烃摇 寡养单胞菌
文章编号摇 1001-9332(2010)05-1334-05摇 中图分类号摇 X172摇 文献标识码摇 A
Isolation, identification, and degrading characteristics of a high鄄efficient pyrene鄄degrading
bacterial strain. ZHONG Ming, ZHANG Jia鄄qing, WU Xiao鄄xia, YANG Feng, MA Hui, CHEN
Li鄄jing ( Liaoning Province Key Laboratory of Agricultural Biotechnology, Shenyang Agricultural
University, Shenyang 110161, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2010,21(5): 1334-1338.
Abstract: By using selective enrichment culture with pyrene as the sole carbon source, a pyrene鄄
degrading bacterial strain ZQ5 was isolated from the oil鄄contaminated soil in Shenfu Irrigation Area.
The strain was identified as Stenotrophomonas sp. , based on its morphological, physiological, and
biochemical characteristics, and similarity identification of 16S rDNA sequence. The pyrene鄄
degrading characteristics and the effects of culture condition on the degrading efficiency of the strain
were investigated by shaking flask culture. After shaking culture with the initial concentration of py鄄
rene being 100 mg·L-1 at 30 益 for 10 days, the degradation rate of pyrene was 91郾 2% . Adding
100 mg·L-1 of alicylic acid into culture medium could enhance the degrading efficiency of the
strain. For the degradation of pyrene by ZQ5, the optimal medium pH was 7-8, and the optimal
salt concentration was lower than 2% .
Key words: pyrene; biodegradation; PAHs; Stenotrophomonas sp.
*中国科学院陆地生态过程重点实验室开放课题项目和辽宁省自然
科学基金项目(20062111)资助.
**通讯作者. E鄄mail: mingzh1@ sina. com
2009鄄11鄄23 收稿,2010鄄03鄄10 接受.
摇 摇 多环芳烃 ( polycyclic aromatic hydrocarbons,
PAHs)是一类含有 2 个或 2 个以上苯环的稠环化合
物,主要来源于化石燃料的生产加工、不完全燃烧和
石油的泄漏[1] .近年来随着化石燃料的大规模开发
使用,环境中的 PAHs 呈不断增多的趋势. PAHs 具
有毒性、致癌性及致畸诱变作用[2],对人类健康和
生态环境具有潜在的生态风险[3-5] . 自然条件下
PAHs的水解和光解速率都非常缓慢,微生物降解
成为它们从环境中消失的主要途径[6] . 因此,高效
降解菌的筛选成为修复 PAHs污染生态系统的关键
环节之一[7-8] .
芘作为 PAHs 中 4 个苯环的代表物,在环境中
广泛存在,是检测 PAHs污染的指示物[9-10] .本研究
以采自沈抚灌区石油污染土样作为供试材料,利用
芘为唯一碳源驯化筛选出一株高效降解芘的菌株
ZQ5,对其进行形态特征、生理生化特征和 16S rDNA
BLAST分析鉴定.测定菌株 ZQ5 对不同初始浓度芘
的降解率,并研究培养条件对菌株生长和芘降解效
能的影响,以期为治理 PAHs 污染提供适宜材料和
理论依据.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 供试材料
供试土壤采自沈抚石油灌区污染土壤. pH值为
7郾 4,有机质含量为(23郾 9 依0郾 3) g·kg-1,速效氮、
应 用 生 态 学 报摇 2010 年 5 月摇 第 21 卷摇 第 5 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, May 2010,21(5): 1334-1338
磷、钾含量分别为(253郾 4 依0郾 2) mg·kg-1、(11郾 4 依
0郾 6) mg·kg-1、(86郾 9依0郾 5) mg·kg-1,多环芳烃含
量(2郾 99依0郾 84) mg·kg-1 [11] .
主要试剂包括多环芳烃芘 ( pyrene,纯度为
98% ),为 Fluka 公司产品.甲醇(色谱纯)及环己烷
(分析纯).
液体筛选培养基为无机盐 MS液体培养基[12] .
1郾 2摇 菌株筛选
选择长年采用抚顺石油二厂污水灌溉的地区,
利用对角线采样法[13]采集土样.取 1 g 土样均匀地
分散在 10 ml无菌水中制成悬液,以 15%的接种量
接种于以芘(100 mg·L-1)为唯一碳源的液体筛选
培养基中,30 益好氧条件下 150 r·min-1摇床培养 3
~4 d后,吸取 1 ml转接至芘浓度为 150 mg·L-1新
鲜液体筛选培养基,3 d 后再转接至芘浓度为 200
mg·L-1的培养基连续富集.用接种环蘸取少许富集
培养液,涂于固体筛选培养基中,28 益恒温培养 4 ~
5 d 形成单菌落. 挑取生长迅速、丰满、边缘整齐的
菌落接入液体筛选培养基中,摇瓶复筛,得到目的菌
株.
1郾 3摇 降解率的测定
配置芘浓度为 100、150 和 200 mg·L-1的 MS
液体培养基,分别加入菌悬液后混匀,使细胞密度为
1伊108 CFU·ml-1,于 30 益下 150 r·min-1振荡培
养.
培养过程中每天取样 1 次,3 次重复,分别用环
己烷萃取 3 次,定容至 25 ml 并经滤膜过滤后用安
捷伦 1100 型液相色谱仪进行高效液相色谱分析.流
动相为 78%色谱纯甲醇水溶液,流速为 1郾 0 ml·
min-1,分离柱为 C18 反相色谱柱,柱温 25 益,进样
量为 20 滋l,检测波长 254 nm[11] .
1郾 4摇 芘降解培养条件试验
将菌株 ZQ5 分别接种于盐浓度为 2% 、5% 、
8% ,pH为 4、6、7、8、10,以及分别添加了 100 mg·
L-1的葡萄糖、水杨酸的培养基中,芘初始浓度均为
100 mg·L-1,振荡培养 7 d,测定在不同培养条件下
培养基中芘浓度和细菌数量[14] .
1郾 5摇 菌种鉴定
1郾 5郾 1 染色、形态观察及生理生化鉴定 摇 将活化菌
种在 LB平板上划线接种,30 益培养箱中倒置培养
2 d,观察菌落形态,测量菌落大小并对其进行革兰
氏染色.
采用甲基红试验(M. R)、接触酶检测、V鄄P 测
定、明胶液化试验、耐盐性测定及碳源利用方式对菌
株鉴定[15] .
1郾 5郾 2 16S rDNA序列分析法鉴定 摇 用常规方法提
取菌株总 DNA[16],以菌株的总 DNA 为模板,P1 和
P2 通用引物对菌株的 16S rRNA 基因进行扩增:P1:
5 爷鄄AGAGTTTGATCCTGGCTCAG鄄3 爷, P2: 5 爷鄄AAG鄄
GAGGTGATCCAGCCGC鄄3爷.反应条件:94 益 4 min,
94益 1 min,55 益 1 min,72 益 2 min,29 个循环,72
益 10 min.在 25 滋l的反应体系中加入 12郾 3 滋l 超纯
水(ddH2O),2郾 5 滋l 10伊PCR 缓冲液,2 滋l dNTP(10
mmol·L-1),2 滋l MgCl2(25 mmol·L-1),引物(0郾 1
滋mol·L-1)各 2 滋l,2 滋l模板(20 ng·滋l-1),0郾 2 滋l
Taq酶(5 U·滋l-1).扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检
测,并用北京天根生化科技公司的 DNA凝胶回收试
剂盒回收目的条带. 测序由北京天根生化科技有限
公司完成.
1郾 5郾 3 系统发育分析 摇 将测序结果用 BLAST 软件
与 GenBank 中 16S rRNA 基因序列进行相似性比
较,获得相关菌株的序列,利用 MEGA 4郾 0 软件构建
系统发育树,采用 Neighbor鄄Joining 法进行系统发育
分析[17] .
2摇 结果与分析
2郾 1摇 菌种的分离纯化及其降解率
将富集培养液在 200 mg·L-1芘的 MS 固体培
养基平板上多次划线对菌种进行分离获得 7 种纯菌
分别命名为 ZQ1、ZQ2、ZQ3、ZQ4、ZQ5、ZQ6、ZQ7 .
从图 1 可以看出,ZQ1、ZQ2、ZQ3、ZQ4、ZQ5、ZQ6
和 ZQ7 的 降 解 率 分 别 为 44郾 67% 、 57郾 34% 、
39郾 33% 、49郾 34% 、83郾 25% 、60郾 13%和 46郾 27% . 其
中 ZQ5 为高效降解菌,被确定为目的菌株.
摇 摇 将菌株 ZQ5 活化并配制成菌悬液后接种到含
有不同浓度芘的 MS 液体培养基中,测定降解率与
OD600值(图2) . 从图2可以看出,芘的降解率与菌
图 1摇 7 种菌株的芘降解率
Fig. 1摇 Degradation rate of pyrene by seven strains.
53315 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 钟摇 鸣等: 芘高效降解菌的分离鉴定及其降解特性摇 摇 摇 摇 摇
图 2摇 菌株 ZQ5 在不同芘浓度下的生长和降解曲线
Fig. 2摇 Growth and degradation curves of strain ZQ5 under dif鄄
ferent pyrene concentrations.
虚线为生长曲线,实线为降解曲线 Dashed line was growth curve, and
real line was degradation curve.
株 ZQ5 生长量的变化趋势基本吻合,且芘浓度越
高,菌株 ZQ5 生长量越大,符合微生物生长与代谢
底物之间关系的一般规律,而降解率随芘浓度升高
有所降低,在 100 mg·L-1芘浓度下降解率高达
91郾 2% ,在 200 mg·L-1时降解率降低较明显.
2郾 2摇 培养条件对菌株 ZQ5 芘降解能力的影响
2郾 2郾 1 共代谢底物的影响摇 高分子量 PAHs 很难降
解,微生物常以共代谢方式进行降解.常见的共代谢
底物是和 PAHs本身结构相似的有机物或是其中间
代谢产物.本研究选取葡萄糖和水杨酸作为外加碳
源,结果见表 1. 从表 1 可以看出,水杨酸作为共代
谢底物提高了芘的降解率,而加入葡萄糖的情况下,
菌株降解芘的效能降低.这是因为,芘降解酶属诱导
酶,当加入速效碳源葡萄糖时,细菌大量利用速效碳
源,抑制了其芘降解基因的表达;而水杨酸是芘的中
间代谢产物之一,能诱导相关酶的表达,从而可以促
进芘的降解.
2郾 2郾 2 pH值的影响摇 从表 2 可以看出,菌株 ZQ5 在
酸性环境下生长困难,在弱酸性环境中生长受到一
定程度的抑制,在碱性环境下生长繁殖受影响较少.
对沈抚污灌区干渠及支渠上、中、下游地区 13 个采
样点pH值的调查发现,污染土壤为弱碱性[18] ,表
表 1摇 不同共代谢底物对芘降解的影响
Tab. 1摇 Effect of different co鄄metabolism substrates on py鄄
rene degradation by strain ZQ5
共代谢底物
Co鄄metabolism
substrate
降解率
Degradation rate
(% )
细胞数量
Cell number
(伊108 CFU·ml-1)
对照 CK 72郾 43依4郾 26 15郾 9
葡萄糖 Glucose 61郾 82依2郾 41* 18郾 7
水杨酸 Salicylic acid 84郾 37依1郾 12 17郾 4*
*P<0郾 05郾
表 2摇 不同 pH值对芘降解的影响
Tab. 2 摇 Effect of different pH on pyrene degradation by
strain ZQ5
pH 降解率
Degradation rate
(% )
细胞数量
Cell number
(伊108 CFU·ml-1)
对照 CK(pH=7) 72郾 43依4郾 26 15郾 9
4 9郾 87依0郾 96 0郾 96
6 43郾 25依5郾 12 9郾 74
8 63郾 74依8郾 45 11郾 5
10 31郾 49依2郾 53 4郾 38
明菌株 ZQ5 具有原位修复的潜力.
2郾 2郾 3 盐浓度的影响摇 由表 3 可知,盐浓度低于 2%
时,菌株 ZQ5 对芘的降解效能受盐浓度的影响较
小.当盐浓度达到 5%时,菌株 ZQ5 的生长受到抑
制,降解效能降低. 随着盐浓度的进一步提高,抑制
作用明显,菌株 ZQ5 在 8%盐浓度下生长困难.由于
沈抚污灌区土壤污染不只是多环芳烃污染,还有盐
渍化、碱化、重金属等[19],因此土壤本身的盐浓度会
对菌 ZQ5 的多环芳烃降解效果产生一定的影响.
2郾 3摇 菌种鉴定
2郾 3郾 1 染色、形态学鉴定摇 菌株 ZQ5 在 LB固体培养
基上呈现乳白色菌落,边缘光滑,无夹膜,好氧,最适
温度 26 益 ~32 益 .菌落圆形,呈针尖状,直径 0郾 5 ~
1 mm,中央突起.菌落与培养基紧贴,湿润、不透明,
不易挑取.革兰氏染色反应为阴性.
2郾 3郾 2 生理生化特征 摇 根据表 4 所示形态特征、生
理生化特征初步判断菌株 ZQ5 属于寡养单胞菌属
(Stenotrophomonas sp. ) .
2郾 3郾 3 16S rDNA序列分析法鉴定结果摇 以菌株 ZQ5
总 DNA为模板,用细菌 16S rRNA 基因的通用引物
P1 和 P2 进行 PCR 扩增,产物经检测、回收、测序确
定为 1520 bp的片段.将测序结果用 BLAST 软件与
GenBank 中的序列进行比较发现, ZQ5 菌株 16S
rRNA序列与寡养单胞菌属的Stenotrophomonas sp.
表 3摇 不同盐浓度对芘降解的影响
Tab. 1 摇 Effect of different salt concentrations on pyrene
degradation by strain ZQ5
盐浓度
Salinity
降解率
Degradation rate
(% )
细胞数量
Cell number
(伊108 CFU·ml-1)
对照 CK(0郾 2% ) 72郾 43依4郾 26 15郾 9
2% 58郾 97依3郾 78 12郾 4
5% 26郾 45依2郾 59 2郾 33
8% 6郾 32依0郾 87 0郾 0107
6331 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 21 卷
YC鄄1 [ DQ537219郾 1 ]、 Stenotrophomonas sp. LZ鄄1
[ DQ784545郾 1 ]、 Stenotrophomonas sp. Dsp鄄4
[DQ482654郾 1]等的 16S rRNA 序列相似性都高达
99% ,与 Stenotrophomonas sp. FG鄄6 [EF017810郾 1]、
微嗜酸寡养单胞菌 ( S. acidaminiphila AMX 19
[NR025104郾 1])、嗜麦芽寡养单胞菌(S郾 maltophilia
IdR[EU442189郾 1])等的 16S rRNA 序列相似性为
98% .基于 16S rRNA 序列的 ZQ5 菌株与寡养单胞
菌各菌株之间的系统发育树(图 3)可知,菌株 ZQ5
在分子系统发育分类学上属于寡养单胞菌,这与形
态及生理生化鉴定结果相吻合.
表 4摇 菌株 ZQ5 的生理生化特征
Tab. 4 摇 Physiological and biochemical characteristics of
strain ZQ5
项目
Item
菌株 ZQ5
Strain
ZQ5
项目
Item
菌株 ZQ5
Strain
ZQ5
甲基红试验
Methyl red test
- 碳源利用
Carbon utilization
乙酰甲基甲醇试验
Voges鄄Proskauer test
+ 葡萄糖
Glucose
+
接触酶
Scavenger enzyme
+ 蔗糖
Sucrose
+
明胶液化
Gelatin liquefaction
+ 酪氨酸
Tyrosine
+
耐盐性 5%
Salt tolerance 10%
-
-
谷氨酸
Glutamic acid
+
硝酸盐还原
Nitrate reduction
+ 甘露醇
Mannitol
+
淀粉水解
Amylolysis
+
+: 阳性 Positive; -: 阴性 Negative.
图 3摇 基于 16S rDNA序列的 ZQ5 菌株与寡养单胞菌菌株系
统发育树
Fig. 3摇 Phylogenetic tree of strain ZQ5 and strains of Stenotroph鄄
omonas based on 16S rDNA sequence.
结点处数字表示 bootstrap 值 Numbers at the nodes indicated the per鄄
centages of bootstrap sampling.
3摇 结摇 摇 语
沈抚灌区是我国最大的石油污水灌区之一.长
期的污水灌溉使土壤受到严重的 PAHs 污染,因此
灌区 PAHs污染的控制和修复是一个重要的研究课
题.获得高效降解 PAHs 的优势微生物是进行污染
环境生物修复的首要条件之一[20],是深入开展理论
研究和实践应用的基础[21] .研究表明,PAHs污染土
壤中微生物降解 PAHs的能力远远高于未受污染的
土壤[22],本研究从沈抚石油灌区污染土壤中分离得
到一株芘高效降解菌株 ZQ5,鉴定为寡养单胞菌,具
有原位修复的潜力.
目前已报道的能够降解芘的微生物种属分布广
泛,典型的有假单胞菌属(Pseudomonos) [23]、鞘氨醇
单胞菌属( Sphingomonos) [24]、黄杆菌(Flavobacteri鄄
um) [25]、黑曲霉(Aspergillusniger) [26]、黄孢原毛平革
菌(Phanerochaet chrysosporium) [20]等.已有报道寡养
单胞菌属的微生物具有一定的降解有机污染物的能
力,其中嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas malto鄄
philia)能降解阿特拉津和聚丙烯乙二醇[27],微嗜酸
寡养单胞菌( Stenotrophomonas acidaminiphila)能降
解菲[28] .本研究证明,寡养单胞菌属细菌 ZQ5 具有
高效降解芘的能力,可在以芘为唯一碳源、能源的培
养基上迅速生长,较快适应降解环境,且菌体数量在
一定范围内能随芘浓度的增高而增加,当芘浓度为
100 mg·L-1时,降解能力发挥比较充分. 芘降解菌
株 ZQ5 的发现丰富了多环芳烃芘的微生物降解种
群,对其培养条件的研究也为进一步原位修复土壤
多环芳烃污染奠定了基础.
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作者简介摇 钟摇 鸣,女,1971 年生,副教授.主要从事污染生
物修复研究,发表论文 30 余篇. E鄄mail: mingzh1@ sina. com
责任编辑摇 肖摇 红
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