全 文 ：生防放线菌 Fq24 代谢产物对朱砂叶螨的生物活性*
陈红兵1 摇 马摇 林2 摇 韩巨才3**摇 刘慧平3 摇 闫彦萍4
( 1山西农业大学文理学院, 山西太谷 030801; 2江苏省农业科学院蔬菜研究所, 南京 210014; 3山西农业大学农学院, 山西太
谷 030801; 4河北威远生物化工股份有限公司, 石家庄 050031)
摘摇 要摇 菌株 Fq24 是从健康番茄植株分离得到的一株植物内生放线菌.为了研究它对朱砂
叶螨生物活性的影响,通过萃取、柱层析、气相色谱鄄质谱(GC鄄MS)等技术对 Fq24 代谢产物中
的杀螨活性物质进行了分离和结构鉴定,并采用玻片浸渍法和叶片残毒法测定了这些代谢产
物的生物活性.结果表明:石油醚萃取物对朱砂叶螨具有较强的触杀和产卵忌避作用.触杀作
用的 LC50为 52郾 57 mg·L-1,产卵忌避作用的 ODC50为 43郾 18 mg·L-1 . 经 GC鄄MS 分析,流份
S11的主要化学成分为棕榈酸甲酯,分子式为 C17H34O2,是代谢产物中的杀螨活性物质之一.质
量浓度为 5 mg·mL-1的棕榈酸甲酯对雌成螨的 24 h校正死亡率为 78郾 3% ,对雌成螨 24 h 产
卵驱避率为 81郾 6% .
关键词摇 内生放线菌 Fq24摇 朱砂叶螨摇 生物活性摇 棕榈酸甲酯
文章编号摇 1001-9332(2011)09-2419-05摇 中图分类号摇 S433. 7摇 文献标识码摇 A
Bioactivity of the metabolites from endophytic actinomycete Fq24 against Tetranychus cinna鄄
barinus. CHEN Hong鄄bing1, MA Lin2, HAN Ju鄄cai3, LIU Hui鄄ping3, YAN Yan鄄ping4 ( 1College
of Arts & Sciences, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China; 2 Institute of Veg鄄
etable Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 3College of Agri鄄
culture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China; 4Hebei Veyong Bio鄄chemical
Co. Ltd., Shijiazhuang 050031, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2011,22(9): 2419-2423.
Abstract: An endophytic actinomycete strain Fq24 was isolated from healthy tomato plants. The
acaricidal substances in the metabolites from Fq24 were collected and identified by the methods of
extraction, column chromatography, and gas chromatography鄄mass spectrometry ( GC鄄MS), and
their bioactivities against Tetranychus cinnabarinus were measured with slide鄄dip and leaf鄄residue
methods. Among the extracts, petroleum ether extract had high bioactivity in contact toxicity and
oviposition deterrent against T. cinnabarinus. Its lethal concentration of 50% (LC50) was 52郾 57
mg·L-1, and its oviposition deterrent concentration of 50% (ODC50) was 43郾 18 mg·L-1 . The
identification with GC鄄MS showed that the main chemical component of fraction S11 was methyl
hexadecanoate, whose molecular formula was C17H34O2, being one of the substances with acaricidal
activity in the metabolites from Fq24. The 24 h corrected mortality rate of female mite at
5 mg·mL-1 of methyl hexadecanoate was 78郾 3% , and the oviposition deterrent rate was 81郾 6% .
Key words: endophytic actinomycete Fq24; Tetranychus cinnabarinus; bioactivity; methyl hexade鄄
canoate.
*山西省科技攻关项目(2007031039,20100311038)和山西省留学基
金项目(2009043)资助.
**通讯作者. E鄄mail: sxndhjc@ yahoo. com. cn
2011鄄02鄄14 收稿,2011鄄06鄄08 接受.
摇 摇 朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)是一种广
泛分布于世界温带的农林害螨,在我国各地均有发
生,可为害的植物有 32 科 113 种,具有个体小、繁殖
快、适应性强、危害重等特点[1] . 大量使用化学杀螨
剂使许多螨类已产生抗药性,甚至出现对杀螨剂的
交互抗性[2] .寻找新型、高效、安全的杀螨剂已成为
一个重要的课题[3] .在微生物代谢产物中寻找控制
有害生物的生物农药是新农药研究的一个重要方
向,而放线菌是开发微生物药物潜力最大的微生物
资源[4-6] .
植物内生菌具有分布广泛、生防性能好、保护生
态环境等优点,已成为植物病害生物防治的主要途
应 用 生 态 学 报摇 2011 年 9 月摇 第 22 卷摇 第 9 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Sep. 2011,22(9): 2419-2423
径之一[7-9] .因此,开展对植物内生放线菌的研究将
有利于寻找新的生防菌种和活性物质. 这在病虫害
的生物防治中具有重要的理论和实际意义[10-12] .
Fq24 菌株是从健康番茄植株的茎部分离得到的一
株有抗真菌活性的植物内生放线菌[13] . 马林等[14]
研究了 Fq24 菌株发酵液对番茄早疫病菌的抑制作
用,但其发酵液的杀螨活性和杀螨活性组分的研究
未见详细报道.为此,本试验研究了发酵液的杀螨活
性,并进一步从其发酵液中分离纯化活性组分,分析
其化学成分,并采用玻片浸渍法和叶片残毒法,测定
了其活性代谢产物对朱砂叶螨的生物活性,为进一
步将其开发成为生物农药新品种提供理论基础.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 供试材料与试剂
供试菌株放线菌 Fq24 从健康番茄植株的茎部
分离得到[13] .供试虫源朱砂叶螨采自山西农业大学
附近最近半年未施用农药的果园,为日龄和生长条
件一致,且未受农药污染的健康成螨,以盆栽豆叶室
内饲养多代供试. 温度(24依2) 益,相对湿度 RH =
(50依10)% ,光照(L 颐 D=18 h 颐 6 h).
所用石油醚、丙酮化学试剂均为分析纯(天津
市化学试剂六厂);土温 80(Tween 80)产自天津市
北辰方正试剂厂;硅胶 GF254 柱层析硅胶产自青岛
海洋化工厂;棕榈酸甲酯购自 Sigma 公司上海分公
司.
1郾 2摇 试验方法
1郾 2郾 1 活性物质的分离和纯化 摇 发酵使用的培养
基:玉米面 30 g、淀粉 10 g、葡萄糖 20 g、大豆粉 20
g、酵母粉 1 g、NaCl 2 g、MgSO4 0. 3 g、(NH4) 2 SO4 2
g、CaCO3 6 g、KH2 PO4 0. 2 g、H2 O 1000 mL. 菌株
Fq24 的发酵液在 28 益、160 rpm下发酵培养 6 d,然
后将发酵混合物经过双层灭菌定性滤纸初次过滤
后,再通过孔径为 0. 22 滋m 的滤膜再次过滤,所得
液体即 Fq24 发酵液,用于后续试验。
每次取发酵液 100 mL于分液漏斗中,用等体积
的石油醚对发酵液多次萃取. 收集有机相用旋转蒸
发仪减压浓缩至干,得到发酵液粗提物. 分别用水鄄
吐温 80 溶剂稀释配制成浓度为 10、20、40、80 和 160
mg·L-1 5 个不同质量浓度的粗提物供试药液,采用
FAO法推荐的玻片浸渍法[15]和叶片残毒法[16]对朱
砂叶螨进行生物活性测定,求出毒力回归方程、致死
中浓度(LC50)和产卵忌避抑制中浓度(ODC50).
将菌株 Fq24 发酵液粗提物上硅胶柱(柱长 45
cm,直径 2郾 5 cm),湿法上样,以石油醚、石油醚 颐 氯
仿=3 颐 2(V 颐 V)、石油醚 颐 氯仿= 2 颐 3(V 颐 V)、氯
仿、氯仿 颐 甲醇 = 49 颐 1 ( V 颐 V)、氯仿 颐 甲醇 =
24 颐 1(V 颐 V)、甲醇 7 种洗脱剂各 1500 mL 进行洗
脱.在洗脱过程当中,洗脱液的流速为每秒 3 ~ 4 滴,
流出液以 50 mL为一个单位收集.将流份分别用旋
转蒸发仪减压浓缩,用毛细管沾取小量浓缩液经薄
层层析( TLC)后,把层析板置于荧光检测灯(254
nm,356 nm)下检测,做好标记.将相同成分合并,用
水鄄吐温 80 溶剂稀释浓度为 6 mg·mL-1,以蒸馏水
加 1%体积的吐温 80 为空白对照进行生物活性测
定,以确定活性成分所在流份.
1郾 2郾 2 生物活性的测定摇 朱砂叶螨成螨触杀作用采
用 FAO法[15],即玻片浸渍法,将处理药剂用水鄄吐温
80 溶剂稀释浓度为 5 mg·mL-1,以蒸馏水加 1%体
积的吐温 80 为空白对照. 用毛笔挑取健康活泼、大
小一致的朱砂叶螨雌成螨,将其背朝下粘在贴有双
面胶的载玻片上,每片 40 ~ 50 头.将黏有螨的载玻
片浸入不同药液 5 s 后取出,用吸水纸吸干虫体周
围的药液,移入(24依2) 益室内. 24 h 后检查死活螨
数,计算校正死亡率,重复 3 次.并用 Duncan新复极
差法比较各处理间的差异.校正死亡率= (对处理死
亡率-对照死亡率) / (1-对照死亡率)伊100% .
朱砂叶螨产卵忌避作用采用叶片残毒法[16],取
平整干净的新鲜菜豆叶片,叶柄用湿棉球包裹,放在
保湿培养皿中,叶子一半浸渍不同的药液,以蒸馏水
加 1%体积的吐温 80 为空白对照.待叶片自然风干
后,每片接雌成螨 10 头,重复 3 次,在 25 益下放置
24 h,除去雌成螨后记录各处理和对照的螨卵数,用
产卵忌避率(oviposition deterrent rate,ODR) [17]评价
药剂对朱砂叶螨产卵的驱避作用,产卵忌避率= (对
照产卵量-处理产卵量) / (对照产卵量+处理产卵
量)伊100% .并用 Duncan新复极差法比较各处理间
的差异.
数据用 DPS 3郾 01 统计软件进行分析,采用
Duncan氏新复极差法进行差异显著性分析.
1郾 2郾 3 活性成分的分析摇 Fq24 菌株杀螨活性成分用
气相色谱鄄质谱(GC鄄MS)联用检测所含物质的化学
结构.使用美国 Agilent HP6890N 气相色谱仪,Dex鄄
sil鄄300GC熔融弹性石英毛细管柱(30 m伊0. 25 mm伊
0. 25 滋m);GC鄄MC 联用条件:柱温:初温 50 益 (2
min),气化室以 3 益·min-1称序升温至 250 益 (10
min);载气:高纯氮气;进样方式:分流 30 颐 1;进样
口温度 250 益;尾吹 0郾 4 kg·cm-2,进样量 0郾 15 滋L;
0242 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 22 卷
灵敏度 10-10,配用 CDMC鄄IB 色谱数据处理系统进
行数据处理;离子源:EI 源(70 eV);倍增器电压
1900 V;GC鄄MC 接口温度 280 益;扫描质量范围为
45 ~ 380 m·Z-1,扫描速度 1 s·DEC-1 .由上述条件
得到各化合物质谱碎片,获得质谱数据直接由联机
的 NIST98 数据系统进行检索,然后对照 EPA / NIH /
MSDS 谱库进行物质鉴定. 其中化合物相对含量由
峰面积归一法计算.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 Fq24 粗提物对朱砂叶螨的触杀作用和产卵忌
避作用
从表 1 可以看出,粗提物对朱砂叶螨的触杀作
用和产卵忌避作用都很明显,触杀作用的 LC50为
52郾 57 mg·L-1,产卵忌避作用的 ODC50为 43郾 18
mg·L-1,具有较好的生物活性.
2郾 2摇 柱层析流份对朱砂叶螨的触杀作用
植物内生放线菌 Fq24 的发酵液先用石油醚萃
取后得到粗提物,再经过柱层析得到 15 个流份,15
个流份的得率分别为 2郾 23% 、 1郾 12% 、 1郾 56% 、
1郾 78% 、1郾 35% 、 0郾 64% 、 0郾 68% 、 1郾 85% 、 0郾 66% 、
0郾 85% 、2郾 69% 、1郾 22% 、1郾 58% 、1郾 38%和 2郾 23% .
质量浓度为 6 mg·mL-1的各个流份对朱砂叶螨雌
成螨触杀作用如图1所示,其中作用最好的流份有
图 1摇 Fq24 柱层析流份对朱砂叶螨的触杀作用
Fig. 1 摇 Contact toxicity of Fq24 fraction by column chromato鄄
graph against Tetranychus cinnabarinus.
S1、S8和 S11,校正死亡率分别为 96郾 6% 、100% 和
100% ,其他 12 个流份的校正死亡率都在 50% 以
下.说明发酵液中含有多种杀螨活性物质,杀螨活性
物质主要集中在流份 S1、S8和 S11之中.
2郾 3摇 GC鄄MS分析结果
Fq24 代谢物经过柱层析后得到的流份 S11的触
杀作用较好,所以进一步研究了流份 S11中所含物质
结构.从图 2 可以看出,流份 S11以保留时间为 12郾 62
min的化合物为主,根据该化合物的质荷比和相对
丰度,其质谱数据直接由联机的 NIST98 数据系统进
行检索,然后对照 EPA / NIH / MSDS谱库进行对照分
析,将其鉴定为棕榈酸甲酯,分子式为 C17H34O2,相
似度为 99% ,分子量为 270. 29.
2郾 4摇 不同药剂对朱砂叶螨的触杀作用和产卵忌避
作用
从表 2 可以看出,质量浓度为 5 mg·mL-1的各
处理对雌成螨 24 h 后的死亡率和校正死亡率均为
发酵液<棕榈酸甲酯<流份 S11<粗提物,24 h 后的产
卵忌避率为发酵液<流份 S11 <棕榈酸甲酯<粗提物.
质量浓度为 5 mg·mL-1的粗提物对朱砂叶螨的触
杀作用和产卵忌避作用明显,且含有多种杀螨活性
物质的粗提物比纯化后的流份S11和棕榈酸甲酯的
图 2摇 流份 S11的总离子流色谱图
Fig. 2摇 Total ion current chromatogram of fraction S11 .
图 3摇 棕榈酸甲酯分子结构
Fig. 3摇 Structure of methyl hexadecanoate.
表 1摇 粗提物对朱砂叶螨的触杀和产卵忌避作用
Table 1摇 Contact toxicity and oviposition deterrent of extracts against Tetranychus cinnabarinus
作用方式
Mode of action
毒力回归方程
Regressive equation
LC50 / ODC50
(mg·L-1)
95%置信限
95% FL (mg·L-1)
相关系数
r
触杀作用 Contact toxicity Y=3郾 0023+1郾 1610x 52郾 57 41郾 43 ~ 66郾 69 0郾 982
产卵忌避作用 Oviposition deterrent Y=2郾 1561+1郾 7391x 43郾 18 36郾 72 ~ 50郾 77 0郾 976
12429 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 陈红兵等: 生防放线菌 Fq24 代谢产物对朱砂叶螨的生物活性摇 摇 摇 摇 摇 摇
表 2摇 4 种物质对朱砂叶螨的触杀和产卵忌避作用
Table 2摇 Contact toxicity and oviposition deterrent of four acaricidal substances against Tetranychus cinnabarinus
药摇 剂
Acaricidal substance
成螨死亡率
Mortality of adult (% )
校正死亡率
Corrected mortality (% )
产卵忌避率
ODR (% )
发酵液 Fermentation liquor 56郾 49依0郾 86cC 55郾 90依1郾 23cC 78郾 62依1郾 35cC
粗提物 Crude extracts 98郾 25依0郾 11aA 97郾 36依0郾 18aA 96郾 48依1郾 25aA
流份 S11 Fraction S11 79郾 32依1郾 43bB 78郾 54依1郾 72bB 72郾 79依1郾 12dD
棕榈酸甲酯 Methyl hexadecanoate 78郾 26依1郾 22bB 77郾 45依0郾 86bB 81郾 56依1郾 63bB
不同小、大写字母分别表示差异显著(P<0郾 05)和极显著(P<0郾 01) Different small and captical letters meant significant difference at 0郾 05 and 0郾 01
levels, respectively.
生物活性更强,其具体原因尚需进一步分析.
3摇 讨摇 摇 论
植物内生放线菌 Fq24 的发酵液经石油醚萃取
后,得到的粗提物对朱砂叶螨的触杀作用和产卵忌
避作用都很明显, 触杀作用的 LC50 为 52郾 57
mg·L-1,产卵忌避作用的 ODC50为 43郾 18 mg·L-1 .
产卵刺激物质和驱避物质在调节昆虫产卵行为过程
中起着十分重要的作用,如丙基酚类物质对朱砂叶
螨有较好的毒杀、杀卵和抑制产卵作用[18],牵牛子
石油醚提取物对朱砂叶螨雌成螨 24 h 后的产卵抑
制率和驱避率分别达到 82. 5%和 94. 5% [19],亚油
酸甲酯具有较强的触杀、产卵抑制和驱避作用,浓度
为 5 mg·mL-1时,对朱砂叶螨的雌成螨和卵 24 h 后
的校正死亡率分别达到 82. 8%和 78. 5% [20] . 来源
于植物的产卵驱避活性物质有大量的报道,但是来
源于微生物代谢产物的产卵驱避活性物质报道很
少[21] .本试验结果表明,菌株 Fq24 发酵液的粗提物
和柱层析分离得到的流份 S11使朱砂叶螨在菜豆叶
片上的产卵量明显减少,从而可以减少朱砂叶螨对
植物的侵害,这对农业害虫的防治有重要价值.有害
生物综合治理(IPM)策略并不总是以毒杀有害生物
为目标,而强调充分利用各种措施将有害生物种群
控制在经济允许的受害水平之下,以达到适合农林
业可持续发展的需求平衡.菌株 Fq24 发酵液中的活
性物质对试验朱砂叶螨的产卵驱避效应恰恰符合有
害生物综合治理策略,值得深入研究.
粗提物中的杀螨活性物质棕榈酸甲酯是脂肪酸
甲酯,广泛存在于自然界许多植物的组织中[22-24] .
它是多种昆虫的化学信息素,对昆虫有拒食[25]、驱
避[26]或抑制葡萄花翅小卷蛾产卵[27]等作用,其来
源广、与环境兼容性好,但是来源于微生物的活性代
谢产物还未见有报道.此外,本试验只对 3 个有较高
杀螨活性流份中的 S11进行了化学成分分析,而其他
两个流份 S1、S8中活性物质的化学成分还需要进行
后续研究.
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作者简介摇 陈红兵,男,1972 年生,副教授.主要从事有机化
学与生物源农药研究. E鄄mail: ndchb@ 126. com
责任编辑摇 肖摇 红
32429 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 陈红兵等: 生防放线菌 Fq24 代谢产物对朱砂叶螨的生物活性摇 摇 摇 摇 摇 摇