全 文 ：管凤贞，钟少杰，邱宏端，等．紫云英根瘤菌的分离与鉴定 ［Ｊ］．福建农业学报，２０１２，２７ （５）：５２４－５３２．
ＧＵＡＮ　Ｆ－Ｚ，ＺＨＯＮＧ　Ｓ－Ｊ，ＱＩＵ　Ｈ－Ｄ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ　ａｎｄ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｈｉｚｏｂｉａｌ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｉｌｋ　Ｖｅｔｃｈ ［Ｊ］．Ｆｕｊｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１２，２７ （５）：５２４－５３２．
紫云英根瘤菌的分离与鉴定
管凤贞１，２，钟少杰３，邱宏端２，林戎斌１，张　辉１，陈济琛１，林新坚１
（１．福建省农业科学院土壤肥料研究所，福建　福州　３５０００３；２．福州大学生物科学与工程学院，
福建　福州　３５０１０８；３．福建农林大学生命科学院，福建　福州　３５０００２）
收稿日期：２０１２－０３－２２初稿；２０１２－０５－０１修改稿
作者简介：管凤贞 （１９８６－），女，在读硕士，研究方向：应用微生物
通讯作者：林新坚 （１９５５－），男，研究员，研究方向：微生物与土壤培肥（Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｉｎｊｉａｎｌｉｎ＠１６３．ｎｅｔ）
基金项目：福建省科技计划项目———省属公益类科研院所基本科研专项 （２０１０Ｒ１０２４５）
摘　要：从采自福建各地紫云英的根瘤中分离出具有一般根瘤菌特征的菌株１８株，在对其进行初步细菌学特性
鉴定的基础上，利用１６ＳｒＤＮＡ进行序列分析，确定其系统发育地位。鉴定结果为：ＹＸ、Ｚ３、ＧＺ与ＺＫ１为中
慢生根瘤菌属Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ菌种，Ｂ３、ＸＺ、Ｍ６与百脉根中生根瘤菌 Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｏｔｉ可能为同一菌属的不
同变种；ＺＬＨ２为黄单孢菌属Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌种；Ｍ３、Ｍ１０、ＺＫ７、ＺＱＨ、Ｂ４、Ｂ７为土壤杆菌属Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌种；
Ｂ６、Ｂ５、Ｂ１、Ｚ１为根瘤菌属Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ菌种。为了进一步考察各鉴定菌株的结瘤情况，利用琼脂试管法和水培
法将部分菌株与紫云英闽紫品种 （１号、５号、６号、７号）和８０４１０４１１品系进行配对结瘤，研究结果不仅进一
步阐明了紫云英根瘤菌的系统发育多样性，并且通过对比琼脂试管法和水培法在结瘤结果上的异同，为探究紫
云英与不同根瘤菌结瘤能力的差异提供了一种简便可行的研究方法。
关键词：紫云英根瘤菌；分离；１６ＳｒＤＮＡ；鉴定；琼脂试管法；水培法；结瘤
中图分类号：Ｓ　１４４．３ 文献标识码：Ａ
Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ　ａｎｄ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｈｉｚｏｂｉａｌ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｉｌｋ　Ｖｅｔｃｈ
ＧＵＡＮ　Ｆｅｎｇ－ｚｈｅｎ１，２，ＺＨＯＮＧ　Ｓｈａｏ－ｊｉｅ３，ＱＩＵ　Ｈｏｎｇ－ｄｕａｎ２，ＬＩＮ　Ｒｏｎｇ－ｂｉｎ１，ＺＨＡＮＧ　Ｈｕｉ　１，
ＣＨＥＮ　Ｊｉ－ｃｈｅｎ１，ＬＩＮ　Ｘｉｎ－ｊｉａｎ１
（１．Ｓｏｉｌ　ａｎｄ　Ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｆｕｊｉａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ　３５０００３，
Ｃｈｉｎａ；２．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｆｕｚｈｏｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ　３５０１０８，
Ｃｈｉｎａ；３．Ｌｉｆｅ　ｓｃｉｅｎｃｅ　ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｆｕｊｉａｎ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ　３５０００２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ　ｔｏｔａｌ　ｏｆ　１８ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｗｉｔｈ　ｇｅｎｅｒａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｒｏｏｔ　ｎｏｄｕｌｅｓ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ
ｍｉｌｋ　ｖｅｔｃｈ　ｆｒｏｍ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ａｒｅａｓ　ｏｆ　Ｆｕｊｉａｎ．１６ＳｒＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｗａｓ　ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅｓｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ
ｐｕｒｐｏｓｅ　ｏｆ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｅｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＹＸ、Ｚ３、ＧＺ　ａｎｄ　ＺＫ１ ｗｅｒｅ
Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ；Ｂ３、ＸＺ、Ｍ６ｗｅｒｅ　Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｌｏｔｉ　ｏｒ　ｖａｒｉｅｔｉｅｓ，ＺＬＨ２ｗａｓ　Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ，Ｍ３、Ｍ１０、Ｂ４、
Ｂ７、ＺＫ７ａｎｄ　ＺＱＨ　ｗｅｒｅ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｂ６、Ｂ５、Ｂ１ａｎｄ　Ｚ１ｗｅｒｅ　Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ．Ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｕｒｐｏｓｅ　ｏｆ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ
ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ，ｗａｔｅｒ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　ａｇａｒ　ｔｕｂｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｗｅｒｅ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｐａｒｔ
ｏｆ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｒｈｉｚｏｂｉａｌ　ｓｔｒｉａｉｎｓ　ａｎｄ　ｍｉｌｋ　ｖｅｔｃｈ　Ｍｉｎｚｉ　１、Ｍｉｎｚｉ　５、Ｍｉｎｚｉ　６、Ｍｉｎｚｉ　７ａｎｄ　８０４１０４１１．Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｎｏｔ
ｏｎｌｙ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｅｌｕｃｉｄａｔｅ　ｔｈｅ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｉｌｋ　ｖｅｔｃｈ　ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ，ｂｕｔ　ａｌｓｏ　ｐｒｏｖｉｄｅｓ　ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ａｎｄ　ｆｅａｓｉｂｌｅ　ｍｅｔｈｏｄ
ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｃｏｎｔｒａｓｔ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｏｆ　ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ
ｔｈｅ　ａｇａｒ　ｔｕｂｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｗａｔｅｒ　ｃｕｌｔｕｒｅ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｉｌｋ　ｖｅｔｃｈ　ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ；ｓｅｐａｒａｔｅ；１６ＳｒＤＮＡ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ａｇａｒ　ｔｕｂｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ；ｗａｔｅｒ　ｃｕｌｔｕｒｅ；
ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ
　　紫云英Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ　ｓｉｎｉｃｕｓ　Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ别称
翘摇、红花草、草子等，豆科黄芪属一年生或越年
生草本植物。因其柔嫩多汁，蛋白质含量高，一直
以来都作为优良的牧草和重要的绿肥，在我国长江
福建农业学报２７（５）：５２４～５３２，２０１２
Ｆｕｊｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
文章编号：１００８－０３８４ （２０１２）０５－５２４－０９
中下游地区广泛种植。加之其淀粉、氨基酸等含量
丰富，近年来利用紫云英花粉开发出来的紫云英蜂
蜜，更是以其优良的口感和良好的保健功能受到了
许多消费者的青睐。
根瘤菌作为一种革兰氏阴性短杆菌，菌体感染
豆科植物根后会与豆科植物共生形成根瘤。豆科植
物与根瘤菌共生具有固氮能力强、固氮量大、抗逆
性强的优点，是生物固氮中最高效的体系，固氮量
约占生物固氮总量的６５％［１］。因此，高效根瘤菌
的选育已成为豆科作物增产增效的关键。目前常用
的选育方法包括自然选育［２］、杂交选育［３］、诱变选
育［４－６］、原生质体融合选育［７］及基因工程选育［８］
等，由于自然界是１个庞大的菌种资源库，因此自
然选育在各种选育方法中仍处于重要的地位。虽然
自然界根瘤菌资源广泛，但根瘤菌与豆科植物之间
的共生结瘤是１个复杂的过程，表现出一定的专一
性，只有对目标豆科作物接以合适的根瘤菌，才能
促使其形成有效的根瘤以提高植株的固氮效率和产
量。目前，对于根瘤菌与豆科植物匹配性能的研究
主要采用水培法和琼脂试管培养法［９］，２种方法各
有优缺点。因此，本试验从紫云英根瘤中分离出
１８株固氮菌，对各菌株菌落形态、生理生化特性、
１６ＳｒＤＮＡ等方面进行分析和鉴定，初步确定１８
株菌的系统发育地位，并采用琼脂试管法和水培法
将部分菌株与闽紫１号、闽紫５号、闽紫６号、闽
紫７号和８４１０４４１进行配对结瘤，进而对配对结果
进行对比，分析２种方法在紫云英品种与根瘤菌配
对能力上的差异。
１　材料与方法
１．１　材料
１．１．１　１８株紫云英根瘤菌株　从采自福建永泰、
闽清和浦城等地紫云英的根瘤中分离获得，分离后
分别命名为Ｚ１、Ｚ３、ＺＫ１、ＺＫ７、ＺＬＨ２、ＺＱＨ、ＧＺ、
ＸＺ、Ｍ３、Ｍ６、Ｍ１０、Ｂ１、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、ＹＸ。
１．１．２　紫云英　闽紫１号、闽紫５号、闽紫６号、
闽紫７号和８０４１０４１１由福建省农业科学院土壤肥
料研究所选育。
１．１．３　培养基　
（１）ＹＭＡ固体培养基：甘露醇１０．０ｇ、酵母
粉０．４ｇ、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ　０．２ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ、
ＮａＣｌ　０．２ｇ、ＣａＣＯ３３．０ｇ、琼脂１５ｇ、微量元素
液１ｍＬ、Ｈ２Ｏ　１　０００ｍＬ，ｐＨ　７．２。其中，微量元
素液：Ｈ３ＢＯ３２．８６ｇ、ＭｎＳＯ４１．８１ｇ、ＺｎＳＯ４０．２２
ｇ、ＣｕＳＯ４０．８０ｇ、Ｈ２ＭＯＯ２０．０２ｇ、加蒸馏水至
１　０００ｍＬ。
（２）ＹＭＡ液体培养基：蔗糖１０．０ｇ、酵母粉
１．０ｇ、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ　０．２ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ、
ＮａＣｌ　０．１ｇ、ＣａＣｌ２０．０５ｇ、Ｒｈ微量元素液４．０
ｍＬ、Ｈ２Ｏ　１　０００ｍＬ，ｐＨ　６．８～７．０。
（３）琼脂试管法培养基：Ｋ２ＨＰＯ４０．１３６ｇ、
ＭｎＳＯ４１．８１０ｇ、ＫＣｌ　０．０７５ｇ、ＺｎＳＯ４０．２２０ｇ、
ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ　０．０６０ｇ、Ｈ３ＢＯ３２．８６０ｇ、ＣａＳＯ４
０．４６０ｇ、ＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ　０．８００ｇ、Ｈ２ＭｏＯ２０．０２０
ｇ、Ｃａ（ＮＯ３）２０．０３０ｇ、柠檬酸铁０．０７５ｇ、琼脂
８～１０ｇ。
（４）水培法培养基：ＫＨ２ＰＯ４２．２ｇ、ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ
１００．０ｍｇ、ＫＣｌ　１５．５ｇ、ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ　２５．０ｍｇ、
ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ　２５．０ｇ、Ｈ３ＢＯ３２５．０ｍｇ、ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ
２１．５ｇ、ＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ　２５．０ｍｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４·２Ｈ２Ｏ
５．０ｍｇ、ＮａＮＯ３３．０ｇ、柠檬酸铁３．０ｇ。
１．１．４　主要仪器设备　ＰＣＲ仪、水浴锅、电泳
仪、凝胶成像系统、三角瓶、１．８ｃｍ×１８ｃｍ滤纸
条、试管架、镊子、烧杯、带滤纸的灭菌培养皿、
不带滤纸的灭菌培养皿、聚乙烯薄膜、光照培养
箱、超净工作台等。
１．２　方法
１．２．１　紫云英根瘤菌的分离　 从福建永泰、闽
清、浦城等地获得的紫云英中选取生长状态良好的
植株，取其根部肥大、饱满、粉红色的根瘤，用水
冲洗去泥，然后用无菌水反复冲洗，滤纸吸干，再
用７５％乙醇浸泡２ｍｉｎ，０．１％氯化汞浸泡２～５
ｍｉｎ，无菌水冲洗５～６次，于无菌条件下，用镊
子将根瘤压碎。将挤出液接种到斜面试管内，２８℃
培养，长出菌落之后，进行平板稀释分离，将单菌
落接到斜面上。重复进行稀释分离，获得单菌落接
种到斜面上保存［９］。
１．２．２　根瘤菌的细菌学鉴定
（１）形态学鉴定：参照根瘤菌常规鉴定方
法［１０－１２］进行革兰氏染色及对菌落特征进行描述。
（２）生理生化试验：ＹＭＡ刚果红反应、牛肉
膏－蛋白胨反应、ＢＴＢ反应、石蕊牛奶反应、３－酮
基乳糖反应、柠檬酸盐反应。
１．２．３　菌株１６ＳｒＤＮＡ的测定　根瘤菌ＤＮＡ提
取参照文献 ［１３］方法进行。ＰＣＲ扩增扩增体系
２５μＬ：１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　２．５μＬ、ｄＮＴＰ　２．５μＬ、
模板 ＤＮＡ　１．０μＬ、Ｓｅｒｉｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－１　０．５μＬ、
Ｓｅｒｉｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－２　０．５μＬ、ｒ　Ｔａｑ 酶 ０．２５μＬ、
ｄｄＨ２Ｏ　１７．７５μＬ。
反应条件：９５℃预变性５ｍｉｎ，９４℃变性１
５２５第５期 管凤贞等：紫云英根瘤菌的分离与鉴定
ｍｉｎ，５６℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸２ｍｉｎ，共进行２９
个循环，７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃保存。ＰＣＲ扩增结
束后，产物在电压为５Ｖ·ｃｍ－１的１．０％琼脂糖凝
胶中电泳 （缓冲液为１×ＴＢＥ）３０ｍｉｎ，电泳结束
后，ＥＢ染色１０～１５ｍｉｎ，观察结果。
（３）ＰＣＲ产物回收按照博大泰克胶回收试剂
盒步骤进行。
１．２．４　序列测定及序列数据分析　将ＰＣＲ产物送
至华大基因公司测序，通过Ｉｎｔｅｒｎｅｔ网 （ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ　ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ），将所测序列
与ＧｅｎＢａｎｋ数据库中已报道的序列进行相似性比
较，并 与 Ｇｅｎｂａｎｋ 中的相似性序列在 Ｃｌｕｓｔａｌ
（１．８）程序包中进行多重序列匹配排列 （Ｍｕｌｔｉｐｌｅ
Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）分析，最后形成１个多序列匹配排列
阵，其中形成的缺口用横杠 “—”填补，再用
Ｍｅｇａ（４．０）程序包中的 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ法构建
系统进化树，确定各根瘤菌在微生物系统发育学上
的地位。
１．２．５　２种匹配方法下根瘤菌结瘤能力对比
（１）拌种根瘤菌液的制备：将供试菌株于
ＹＭＡ斜面培养基中活化后，挑１～２环接至无菌
的ＹＭＡ液体试管培养基中，置于恒温摇床上，
３０℃、１８０ｒ·ｍｉｎ－１培养４８ｈ。
（２）琼脂试管培养法：将供试根瘤菌株与供试
紫云英品种按以下步骤做结瘤试验，每个处理设５
个重复，每个紫云英品种各设５棵不接菌的植株作
为对照。
① 种子表面灭菌。将种子放在无菌平板中，用
７５％酒精浸５ｍｉｎ，倒去酒精。加入０．１％氯化汞溶
液浸５ｍｉｎ，后用无菌水洗４～６次，洗时需振摇，每
次５ｍｉｎ。（硬皮小种子可先用浓硫酸处理１０～２０
ｍｉｎ）。过程中注意去掉漂浮在水面的轻种。
② 种子催芽。视种皮吸水能力而定。如果种
皮不易吸水，需将种子在无菌水中浸２～３ｈ，然
后将消毒的种子点种于琼脂表面，或浸湿灭菌滤纸
上，在２０℃催芽。还可以把种子插入在灭菌的装
有滤纸的试管中，在２０℃催芽。经２４～４８ｈ，出
芽长度在０．５～１．０ｃｍ时即可使用。
③ 接种和播种。经催芽的种子先用来播种作
对照处理 （即种子表面不带有根瘤菌）。余下的种
子进行根瘤菌接种用。接种方式同水培法。
④ 试验设计。结瘤试验采用简单对比法，各
组按５次重复进行设计，即１８株根瘤菌株分别与
５个紫云英品种组合，每株根瘤菌与每个紫云英品
种进行５次重复配对试验，因此，每个紫云英品种
与１８株根瘤菌组成９０个配对，同时每个紫云英品
种设置５个重复的不接菌对照，使得同一紫云英品
种有９５个试验。接种完毕封口后置于光照培养箱
内培养，设定培养条件为：２３℃、６６％光照１２ｈ；
１８℃、无光照１２ｈ。
⑤ 结果检查。豆科植物从生长到开始出现根
瘤的时期为植株长出１～４片真叶时。为了观察根
瘤的有效性，在播种后１５～３０ｄ开始进行观察，
并于１２０ｄ时结束试验。检查时，从试管中小心取
出植株，不要损伤根系，并将根系洗净，观察记录
检查结果。
１．２．６　水培试管培养法　试验设计处理同琼脂试
管培养法。
① 制作滤纸桥：将滤纸裁成条状，其宽度分
别为１．３ｃｍ，制成 Ｍ型，中间凹处根据幼苗的大
小制成Ｖ型小孔，Ｍ 型滤纸的高度为试管的长度
减去４ｃｍ。
② 制备无菌水培营养液：按水培营养液的配
方配置水培液分装入１．８ｃｍ×１８ｃｍ试管中，每管
约２２ｍＬ，然后每管放入滤纸条，用聚丙烯纤维塑
料薄膜封口，１２１℃下灭菌３０ｍｉｎ，待用。
③ 种子的制备：种子先用９５％乙醇浸泡５
ｍｉｎ后再用０．１％的 ＨｇＣｌ２表面灭菌５ｍｉｎ，然后
用无菌水清洗１０次。将消毒后的种子播于铺有无
菌湿润滤纸的平皿内，封好后置于２５～２８℃温箱
中保温催芽４８ｈ，一般小粒种子催芽长为０．５～
１．０ｃｍ。
④ 接种：将催芽成功的种子放入事先制备好
的根瘤菌悬液中浸泡３０ｍｉｎ。
⑤ 播种：将幼苗用无菌的镊子小心夹出放入
水培液试管的滤纸桥中固定好，将菌悬液定量吸入
试管中。封口后于光照培养箱内培养，培养条件
为：２３℃、６６％光照１２ｈ；１８℃、无光照１２ｈ。
同时培养期间注意及时补充营养液，观察结瘤和生
长情况。
⑥ 结果检查。豆科植物从生长到开始出现根
瘤的时期为植株长出１～４片真叶时。为了观察根
瘤的有效性，可在播种后１５～３０ｄ开始进行观察，
并于１２０ｄ时结束试验。检查时，必须小心地将植
株从试管中取出，不要损伤根系，将根系洗净，观
察记录检查结果。
２　结果与分析
２．１　紫云英根瘤菌的分离
从福建永泰、闽清、浦城等地采集紫云英植
６２５ 福建农业学报 第２７卷
株，从其根瘤中分离、纯化根瘤菌，获得菌株１８
株，代 号 分 别 为 Ｚ１、Ｚ３、ＺＫ１、ＺＫ７、ＺＬＨ２、
ＺＱＨ、ＧＺ、ＸＺ、Ｍ３、Ｍ６、Ｍ１０、Ｂ１、Ｂ３、Ｂ４、
Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、ＹＸ。
２．２　紫云英根瘤菌的细菌学鉴定
２．２．１　紫云英根瘤菌的形态学鉴定　从不同生境
采集的紫云英根瘤中分离得到的根瘤菌菌株，经革
兰氏染色分析皆为阴性短杆菌 （图１）。经 ＹＭＡ
培养基于２８℃下培养３ｄ后，出现肉眼可见单菌
落，菌落直径为２～８ｍｍ （图２）。一般为水泡状、
水润圆整透明、生长旺盛时有流动胶质，具有一般
根瘤菌特征。各菌株的菌落形态具体描述如表１，
大致可以分为３大类： （１）菌落水泡状呈白色的
Ｚ１、Ｂ１、Ｂ５、Ｂ７、Ｂ６、ＺＫ７、ＧＺ、Ｂ３、ＺＫ１、
Ｍ６、Ｚ３、ＸＺ、ＹＸ； （２）菌落水泡状呈浅黄色或
黄绿色ＺＬＨ２、ＺＱＨ、Ｂ４； （３）菌落为非水泡状
的 Ｍ３、Ｍ１０。
图１　ＸＺ革兰氏染色 （４０×）
Ｆｉｇ．１　Ｇｒａｍ　ｓｔｒａｉｎ　ＸＺ４０×
图２　ＸＺ菌落形态
Ｆｉｇ．２　Ｃｏｌｏｎｙ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ＸＺ
表１　分离株菌菌落形态
Ｔａｂｌｅ　１　Ｃｏｌｏｎｙ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｉｇｈｔｅｅｎ　ｓｔａｉｎｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ
菌株 　　　形　态
Ｍ６ 水泡状，较干，半透明，圈中，白色，流动胶质
ＺＬＨ２ 水泡状，水润圆整，半透明，圈中，绿黄色，流动胶质
ＺＱＨ 水泡状，较干，半透明，圈中，浅黄色，流动胶质
Ｍ３ 非水泡状，扁平，较干，圈小，白色，无流动胶质
Ｍ１０ 非水泡状，扁平，较干，圈小，浅黄色，无流动胶质
Ｚ１ 水泡状，水润圆整，半透明，圈大，白色，流动胶质
ＺＫ７ 水泡状，水润圆整，半透明，圈大，白色，流动胶质
ＧＺ 水泡状，水润圆整，半透明，圈中，白色，流动胶质
ＺＫ１ 水泡状，水润圆整，半透明，圈中，白色，流动胶质
Ｚ３ 水泡状，水润圆整，半透明，圈小，白色，流动胶质
ＸＺ 水泡状，水润圆整，半透明，圈中，白色，流动胶质
ＹＸ 水泡状，水润圆整，半透明，圈中，白色，流动胶质
Ｂ１ 水泡状，水润圆整，半透明，圈中，白色，流动胶质
Ｂ３ 水泡状，水润圆整，半透明，圈中，白色，流动胶质
Ｂ４ 水泡状，较干，半透明，圈中，浅黄色，流动胶质
Ｂ５ 水泡状，水润圆整，半透明，圈中，白色，流动胶质
Ｂ６ 水泡状，水润圆整，半透明，圈大，白色，流动胶质
Ｂ７ 水泡状，水润圆整，半透明，圈小，白色，流动胶质
２．２．２　生理生化试验　１８株紫云英根瘤菌各生
理生化特性结果见表２。
（１）ＹＭＡ刚果红培养基培养：１８株菌分别接
种于ＹＭＡ刚果红培养基中，置于２８℃培养箱培
养３～７ｄ后，除Ｚ１、ＺＫ７、Ｂ４外，其余菌株在
ＹＭＡ刚果红培养基中都不吸色，相反，ＺＫ７对刚
果红有一定的吸收能力，而Ｚ１及Ｂ４不仅对刚果
红有吸色作用，还能分解培养基中的刚果红；
（２）牛肉膏－蛋白胨反应：３０℃培养４８ｈ后，
牛肉膏－蛋白胨培养液未见浑浊，菌体未生长，表
明１８株菌对牛肉膏－蛋白胨利用率很低，不能在牛
肉膏蛋白胨培养基上生长。
（３）ＢＴＢ反应：２８℃培养箱培养３～７ｄ后，除
接种有 Ｍ６、Ｍ３、ＸＺ、ＹＸ、Ｂ１、Ｂ３的ＢＴＢ培养基不
变色外，其余１２株菌都可使ＢＴＢ培养基变黄，表明
该１２株菌在ＢＴＢ培养基上产酸，属快生型菌株。
（４）石蕊牛奶反应：Ｍ３、ＸＺ、ＹＸ、Ｂ１、Ｂ６
在石蕊牛奶培养基中生长能使培养基变蓝，且ＸＺ
和Ｂ１能形成明显的乳清环，表明这些菌产碱，属
慢生型菌株；其余菌株在石蕊牛奶培养基中变红，
且Ｚ１、ＺＫ７、Ｂ４、Ｂ７能形成明显的乳清环，表明
这些菌产酸，属快生型菌株。
７２５第５期 管凤贞等：紫云英根瘤菌的分离与鉴定
（５）３－酮基乳糖反应：加入本尼迪克特试剂后，
１８株菌的菌落周围均未出现黄褐色沉淀，属阴性反
应，表明所分离菌株均不属于土壤杆菌属菌株。
（６）柠檬酸盐利用情况：１８株供试菌株中，
除Ｍ６、ＧＺ、ＸＺ、ＹＸ与Ｂ３不能利用柠檬酸盐外，
其余菌株均可利用柠檬酸盐，过去认为土壤杆菌属
能利用柠檬酸盐，而根瘤菌不能利用，但近几年来
国内外也有报道有些根瘤菌也可以利用柠檬酸盐，
随着根瘤菌资源的不断丰富，其代谢类型也更为多
样，传统试验中通过柠檬酸盐利用情况判定菌株是
否为根瘤菌的方法已经无法实现，反而可能使得一
些实属根瘤菌的菌株被遗漏，正如本试验的Ｂ１、
Ｂ５、Ｂ６等菌株。因此，该方法在后期试验中很可
能被逐渐淘汰。
表２　不同菌株若干项生理生化特征
Ｔａｂｌｅ　２　Ｓｏｍｅ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎｓ
菌株 ＹＭＡ刚果红 牛肉膏－蛋白胨 ＢＴＢ 石蕊牛奶 ３－酮基乳糖 柠檬酸盐
Ｍ６ － － － ＋ － －
ＺＬＨ２ － － ＋ ＋ － ＋
ＺＱＨ － － ＋ ＋ － ＋
Ｍ３ － － － － － ＋
Ｍ１０ － － ＋ ＋ － ＋
Ｚ１ ＋＊ － ＋ ＋＊ － ＋
ＺＫ７ ＋ － ＋ ＋＊ － ＋
ＧＺ － － ＋ ＋ － －
ＺＫ１ － － ＋ ＋ － ＋
Ｚ３ － － ＋ ＋ － ＋
ＸＺ － － － －＊ － －
ＹＸ － － － － － －
Ｂ１ － － － －＊ － ＋
Ｂ３ － － － ＋ － －
Ｂ４ ＋＊ － ＋ ＋＊ － ＋
Ｂ５ － － ＋ ＋ － ＋
Ｂ６ － － ＋－ － － ＋
Ｂ７ － － ＋ ＋＊ － ＋
注：ＹＭＡ刚果红反应中，＋为吸色，－为不吸色，＋＊为分解颜色；牛肉膏－蛋白胨反应中，＋表示有菌体生长，－表示无菌体生长；ＢＴＢ反应中，
＋为培养基变黄，－为培养基不变，＋－为微变黄；石蕊牛奶反应中，＋表示变红，－表示变蓝，加＊表示能形成明显的乳清环；３－酮基乳糖反应
中，＋为加入本尼迪克特试剂有黄褐色沉淀，－为加入本尼迪克特试剂无黄褐色沉淀；柠檬酸盐反应中，＋为可以利用柠檬酸盐，－为不能利用
柠檬酸盐。
２．３　１６ＳｒＤＮＡ鉴定
２．３．１　ＰＣＲ结果与分析　提取各分离菌株的总
ＤＮＡ，使用通用引物进行ＰＣＲ扩增 （图３），扩增
条带大小在１　４００ｂｐ左右，再将ＰＣＲ产物纯化，
进行测序。
２．３．２　序列测定及系统发育地位　将测定的序列
利用 ＮＣＢＩ上 的 ＢＬＡＳＴ （ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．
ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）和已知物种序列进行比
对，发现ＸＺ、ＹＸ、Ｂ３、Ｍ６、Ｚ３、ＧＺ、ＺＫ１与中
慢生根瘤菌属 Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ 菌种的相似性最高，
达到９６％，亲缘关系最近，可能隶属于该属菌株；
ＺＬＨ２与黄单孢菌属Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌种的相似性最
高，达到９６％，亲缘关系最近，可能为该属菌株；
Ｍ３、Ｍ１０、ＺＫ７、Ｂ４、Ｂ７、ＺＱＨ 与土壤杆菌属
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌种的相似性达９５％，可能为该属
菌种；Ｂ６、Ｂ５、Ｂ１、Ｚ１与根瘤菌属Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ 相
似性最高，达到９５％，亲缘关系最近，可能都是
该属菌株。一般来说紫云英根瘤菌都归属于中慢生
根瘤菌属Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ，但是后期又相继报道了
土壤杆菌属Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、根瘤菌属Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、
中华根瘤菌属Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ的菌株也可与紫云英
结瘤固氮，本试验所筛选菌株除ＺＬＨ２外分别属
于所报道的前３个属，后期的水培法试验也间接验
证了归属于土壤杆菌属Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 的Ｂ４、Ｂ７
和归属于根瘤菌属Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ的Ｂ１、Ｂ５、Ｂ６都能
与紫云英结瘤。而ＺＬＨ２与黄单孢菌属的好几个
８２５ 福建农业学报 第２７卷
图３　部分菌株１６ＳｒＤＮＡ的ＰＣＲ结果
Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅ　１６Ｓ　ｒＤＮＡ　ＰＣＲ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｐａｒｔｌｙ　ｓｔｒａｉｎｓ
注：１－ＸＺ；２－ＹＸ；３－Ｂ３；４－Ｍ６；５－Ｚ３；６－ＧＺ；７－ＺＫ１；８－Ｍ３；９－Ｍ１０；１０－Ｚ１；Ｍ－ｍａｒｄｅｒ。
菌种相似性都达到９６％，但至今尚未有该属菌株
的共生结瘤报道，水培试验也无结瘤表现，究其原
因，可能是受环境条件限制，也可能是其专一性比
较高，能使之共生结瘤的紫云英品种较少，因此还
有待进一步验证。
将 各 序 列 输 入 ＭＥＧＡ４．０ 软 件，通 过
Ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ法构建系统进化树 （图４），结
果可以把所研究的菌种分为３大类：ＸＺ、ＹＸ、
Ｂ３、Ｍ６、Ｚ３、ＧＺ、ＺＫ１聚成１类，有较近的亲缘
关系；ＺＫ７、Ｂ４、Ｂ７、Ｍ３、Ｍ１０、ＺＬＨ２、ＺＱＨ
聚成１类，在发育系统上有较近的亲缘；Ｂ６、Ｂ５、
Ｂ１、Ｚ１聚成１类，与其他菌种有较远的亲缘关系。
图４　Ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ法构建的系统进化树
Ｆｉｇ．４　Ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ－ｊｉｏｎｉｎｇ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｏｆ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ
ｓｔｒａｉｎｓ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｒｅｆｒｅｎｃｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　１６Ｓ
ｒＤＮＡ　ｐａｒｔｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ
２．４　２种配对方法下回接试验结果
２．４．１　琼脂比较不同根瘤菌株对不同紫云英品种
的匹配的影响　 由图５、６可以看出，未接根瘤菌
菌株 （ＣＫ）的紫云英细弱矮小，叶色偏黄，未见
根瘤；而接种根瘤菌的，紫云英根系有根瘤菌，且
植株颜色深绿、长势高大。配对结果见表３，１１株
根瘤菌对５个紫云英品种的结瘤能力存在较大差
异。其中，ＧＺ和ＸＺ与５个紫云英品种都可结瘤，
具有广谱性；Ｍ３、Ｍ６、Ｍ１０的匹配能力位居第
２，除 Ｍ１０不能使闽紫１号、闽紫５号结瘤外，
Ｍ３、Ｍ６能使除闽紫１号外的其他４个紫云英品种
结瘤；ＺＫ１、ＺＫ７诱导紫云英结瘤能力较低，仅能
使闽紫５号结瘤；Ｚ１、Ｚ３、ＺＬＨ２、ＺＱＨ 匹配结瘤率
为０。总之，根瘤菌结瘤顺序为：ＧＺ、ＸＺ＞Ｍ３、Ｍ６
＞Ｍ１０＞ＺＫ７、ＺＫ１＞Ｚ１、Ｚ３、ＺＬＨ２、ＺＱＨ。
表３　脂法验证菌株与紫云英品种间的配对
Ｔａｂｌｅ　３　Ｅｘａｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｂｙ　ａｇａｒ　ｍｅｔｈｏｄ．
菌株 闽紫６号 ８０４１０４１１ 闽紫７号 闽紫１号 闽紫５号
Ｚ１　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ０／５
Ｚ３　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ０／５
ＺＫ１　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ２／５
ＺＫ７　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ３／５
ＺＬＨ２　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ０／５
ＺＱＨ　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ０／５
ＧＺ　 ５／５　 ４／５　 ４／５　 ３／５　 ４／５
ＸＺ　 ４／５　 ５／５　 ２／５　 ３／５　 ５／５
Ｍ３　 ３／５　 ３／５　 ２／５　 ０／５　 １／５
Ｍ６　 ３／５　 ３／５　 １／５　 ０／５　 ３／５
Ｍ１０　 ３／５　 ２／５　 １／５　 ０／５　 ０／５
注：“／”前为结瘤株数、后为试验重复数。
９２５第５期 管凤贞等：紫云英根瘤菌的分离与鉴定
图５　ＧＺ接种闽紫１号
Ｆｉｇ．５　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ＧＺ　ａｎｄ　Ｍｉｎ１　ｂｙ　ａｇａｒ　ｍｅｔｈｏｄ
注：试管１、２为无结瘤植株；试管３～５为结瘤植株。
图６　 左侧结瘤试管放大
　Ｆｉｇ．６　Ｔｈｅ　ｐｉｃｔｕｒｅ　ｉｓ　ｔｈｅ　Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｍａｐ　ｔｏ　ｅｎｌａｒｇｅ　ｏｆ
ｌｅｆｔ　ｔｕｂｅ
２．４．２　水培法比较不同根瘤菌对不同紫云英品种
匹配的影响　 从表４可以看出，在水培法下，各
菌株与紫云英品种的匹配性能出现了比琼脂试管培
养法更大的差异。ＧＺ和ＸＺ能使供试的紫云英品
种结瘤 （８０４１０４１１除外），其余的根瘤菌菌株与紫
云英品种间都未表现出结瘤现象，结瘤率均为０。
虽然ＧＺ和ＸＺ具有广谱性，但二者还是有所差异
的，如ＧＺ不能使８０４１０４１１匹配结瘤。
表４　水培法验证菌株与紫云英品种间的配对
Ｔａｂｌｅ　４　Ｅｘａｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｗａｔｅｒ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｔｈｏｄ
菌株 闽紫６号 ８０４１０４１１ 闽紫７号 闽紫１号 闽紫５号
Ｚ１　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ０／５
Ｚ３　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ０／５
ＺＫ１　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ０／５
ＺＫ７　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ０／５
ＺＬＨ２　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ０／５
ＺＱＨ　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ０／５
ＧＺ　 ２／５　 ０／５　 ５／５　 ３／５　 ４／５
ＸＺ　 ５／５　 ２／５　 １／５　 ４／５　 ５／５
Ｍ３　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ０／５
Ｍ６　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ０／５
Ｍ１０　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ０／５　 ０／５
３　讨　论
３．１　从福建永泰、闽清和蒲城等地采集的紫云英
根瘤中分离获得的１８株根瘤菌，均为革兰氏阴性
短杆菌，经过形态、生理生化等初步细菌学鉴定，
除 Ｍ３、Ｍ１０外，均为水泡状菌体，具备一般根瘤
菌的特征。在后期进行的１６ＳｒＤＮＡ鉴定中，确定
了 ＹＸ、Ｚ３、ＧＺ、ＺＫ１ 为 中 慢 生 根 瘤 菌 属
Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ，Ｂ３、Ｍ６、ＸＺ与百脉根中生根瘤
菌 Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｌｏｔｉ可能为同一菌种的不同变
种；ＺＬＨ２为黄单孢菌属Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌株；Ｍ３、
Ｍ１０、ＺＫ７、Ｂ４、Ｂ７、ＺＱＨ 为 土 壤 杆 菌 属
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株；Ｂ６、Ｂ５、Ｂ１、Ｚ１为根瘤菌
属Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ 菌株。鉴定结果表明，所筛选菌株
除ＺＬＨ２外分别属于所报道的前３个属，后期的水
培法 试 验 也 间 接 验 证 了 归 属 于 土 壤 杆 菌 属
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 的 Ｂ４、Ｂ７ 和 归 属 于 根 瘤 菌 属
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ的Ｂ１、Ｂ５、Ｂ６都能与紫云英结瘤，这
与Ｊｏｒｄａｎｄ［１４］对根瘤菌进行的分类结果一致。
ＺＬＨ２虽与黄单孢菌属的好几个菌种相似性达到
９６％，但至今尚未有该属菌株的共生结瘤报道，水
培试验也无结瘤表现，究其原因，可能是受环境条
件限制，也可能是其专一性比较高，能使之共生结
瘤的紫云英品种较少，因此还有待进一步验证。
从上述紫云英根瘤分离得到的菌株多样性说
明，紫云英除了能与互惠种族结瘤固氮外，还有其
他细菌的参与，国内外的科学家对此进行了大量的
研究，他们从植株根瘤中分离到多种具有固氮功能
的微生物，进行分类鉴定，并对它们的生理功能，
０３５ 福建农业学报 第２７卷
特别是与促进豆科植物结瘤固氮方面的功能进行了
细致的研究，比起传统研究关于豆科作物结瘤的观
点，他们的研究表明，除了根瘤菌属微生物，诸如
从根瘤内分离的能够侵入豆科植株根部形成根瘤进
行固氮的土壤杆菌［１５］、位于根际土壤或者根部表
面进行自身固氮的类芽孢杆菌和芽孢杆菌［１６］等对
豆科植物的增产增效起到重要的作用。本试验从紫
云英根瘤中分离出多种固氮菌，除各类根瘤菌属菌
株外，也分离出 Ｍ３、Ｍ１０、ＺＫ７等土壤杆菌属菌
株及黄单孢菌属菌种ＺＬＨ２，说明土壤杆菌属等固
氮菌广泛存在于各类豆科植物根瘤内，极大地丰富
了根瘤菌的多样性，同时，此类固氮菌对豆科植物
的结瘤固氮具有重要的作用，这为人类研究丰富根
瘤菌的固氮机制提供了新的方向。
３．２　考虑到根瘤菌与寄主之间只有很好的搭配才
能使豆科植物获得最佳的固氮效果［１７］，若匹配性
能不好，即使是再高效的根瘤菌也不能充分发挥应
有的共生固氮性能［１８－１９］，也就是说接种根瘤菌的
结瘤能力是接种成功的关键［２０］。因此。本试验采
用琼脂试管培养法和水培法考查１１株紫云英根瘤
菌对５个紫云英品种 （系）匹配的影响。比较２种
方法的结瘤效果可知，ＧＺ和ＸＺ　２种方法均表现出
较为广谱的结瘤能力，说明根瘤菌与紫云英的共生
存在多样性；其余９株根瘤菌在２种培养方法下表
现出较大的差异，在水培法中，全部表现出阴性，
即不结瘤，而在琼脂试管培养法中却可以表现出一
定的结瘤能力，Ｍ３、Ｍ６甚至能使除闽紫１号外的
其他４个紫云英品种都产生不同程度的结瘤现象。
由此可见，根瘤菌的有效性受到很多环境因素的影
响［２１］。目前的研究认为根瘤的形成与根瘤菌和宿
主植物交换调节信号分子过程相关［２２－２３］，豆科植
物的根或种子分泌类黄酮物质，诱导根瘤菌的结瘤
基因产生结瘤因子［２４］，当根瘤菌分泌的结瘤达到
一定浓度时，能够有效刺激豆科植物结瘤，琼脂试
管法由于琼脂能够将根瘤菌的分泌物保持在一定的
浓度，故使植株根部形成根瘤，这种根瘤的组织结
构和典型的根瘤相同，但是是空心的，为阴性根
瘤［２５］；而水培法由于根瘤菌的分泌物被水培液大
幅度的稀释，致使假阳性根瘤无法形成。其次，琼
脂的组成成分比较复杂，含有寡糖等物质，这与某
些根瘤菌如苜蓿根瘤菌和豌豆根瘤菌中观察到的结
瘤因子结构相似［２６－２７］，因此也可能刺激植株结瘤，
产生假阳性反应，但这种根瘤一般没有固氮活性。
李湘等［２８］的研究也为这种猜测提供了科学根据，
假阳性根瘤由于积累了大量的淀粉，使瘤体呈淡绿
色，其内可能也含有短杆状菌体，但菌体不膨大形
成类菌体，这种根瘤因不含豆血红蛋白，因此无固
氮性能。在研究各类结瘤微生物结瘤固氮能力差异
中，水培法和琼脂试管培养法由于栽培周期短，便
于操作和观察，特别是水培法结果不受土壤等外界
因素的干扰，因此是研究各种具有结瘤固氮能力的
微生物与豆科植物的结瘤配对的较佳方法，具有较
强的使用价值。
综上所述，紫云英根瘤菌具有多样性，本文不
仅从紫云英根瘤中分离出１８株具有固氮性能的菌
株，并对其进行初步鉴定，构建了系统发育树，为
更好地分析各菌株间的亲缘关系打下了基础。试验
还比较了部分菌株在琼脂试管法和水培法下结瘤能
力的差异，表明水培法比琼脂试管培养法在紫云英
根瘤菌与紫云英品种的匹配性能研究上要求更为严
格，不易出现假阳性配对情况。加之，水培法操作
较为简便，试验结果易于观察和记录，具有快捷、
简便、直观、可靠等优点，是一种研究根瘤菌与豆
科植物间匹配关系的好方法，有望在该研究领域进
行进一步的推广和完善。
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６７０－６７３．
［２６］ＬＥＲＯＵＧＥ　Ｐ，ＲＯＣＨＥ　Ｐ，ＦＡＵＣＨＥＲ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ
ｈｏｓｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ｉｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ａ
ｓｕｌｐｈａｔｅｄ　ａｎｄ　ａｃｙｌａｔｅｄ　ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ　ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｓｉｇｎａｌ［Ｊ］．
Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，３４４，７８１－７８４．
［２７］ＳＰＡＩＮＫ　Ｈ　Ｐ，ＳＨＥＥＬＹ　Ｄ，ＶＡＮ　ＢＲＵＳＳＥＬ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｎｏｖｅｌ
ｈｉｇｈｌｙ　ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｍｏｉｅｔｙ　ｏｆ　ｌｉｐｏ－ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ
ｓｉｇｎａｌｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ　ｈｏｓｔ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，
１９９１，３５４：１２５－１３０．
［２８］李湘，杨红玉．豆科植物根瘤形成条件初探 ［Ｊ］．西南农业学
报，２００７，２０ （１）：９５－９８．
（责任编辑：柯文辉）
２３５ 福建农业学报 第２７卷