全 文 ：第 3 2卷第1期
2 0 1 5 年 1 月
精 细 化 工
FINE CHEMICALS
Vol ． 32，No ． 1
Jan． 2 0 1 5
催化与分离提纯技术
收稿日期:2014 － 07 － 24;定用日期:2014 － 09 － 30;DOI:10． 13550 / j． jxhg． 2015． 01． 013
基金项目:“十二五”农村领域国家科技计划课题(2012BAD21B0404)
作者简介:王有琼(1973 －)，女，助理研究员，硕士，E － mail:wangkeyi666@ 126． com。联系人:段琼芬(1954 －) ，女，研究员，博士，E － mail:
qiongfend@ 163． com。
印楝叶多酚提取及体外抗氧化活性
王有琼，马李一，张重权，段琼芬*
(中国林业科学研究院 资源昆虫研究所，云南 昆明 650224)
摘要:采用福林-肖卡法，以没食子酸为对照品，在 750 nm波长测定印楝叶中多酚含量。用单因素和响应曲面法
设计实验，考察了提取温度、提取时间、乙醇体积分数 3 个响应变量以及变量之间交互作用对印楝叶多酚提取效
果的影响，对提取工艺进行优化。同时，体外实验评价印楝叶多酚的抗氧化能力。结果表明，印楝叶多酚提取的
最佳工艺条件为:提取温度 77 ℃，提取时间 80 min，乙醇体积分数 50%;响应变量影响顺序为:提取温度 ＞提取
时间 ＞乙醇体积分数;印楝叶中多酚提取得率平均为 3. 12%，与模型预测值相符。相同浓度下印楝叶多酚的抗
氧化能力强于 Vc，其清除 DPPH自由基的半数抑制质量浓度(IC50)约为 4. 6 mg /L，低于 Vc 的半数抑制质量浓
度(IC50)9. 8 mg /L。清除羟自由基(·OH)的半数抑制质量浓度(IC50)约为 23 mg /L，低于 Vc 的半数抑制质量
浓度(IC50)85 mg /L。
关键词:印楝叶;多酚;响应面法;抗氧化;分离提纯技术
中图分类号:TQ91;Ｒ284. 2 文献标识码:A 文章编号:1003 － 5214(2015)01 － 0064 － 05
Antioxidant Capacity and Extraction Technique of
Polyphenol from the Leaf of Azadirachta indica
WANG You-qiong，MA Li-yi，ZHANG Zhong-quan，DUAN Qiong-fen*
(Ｒesearch Institute of Ｒesources Insects，Chinese Academy of Forestry，Kunming 650224，Yunnan，China)
Abstract:Polyphenol content from neem leaf was measured at 750 nm wavelength with gallic acid as
standard by the using Folin-Ciocalteu method． The extraction conditions of total polyphenol from the
neem leaf were optimized by solvent refluxing method． The interactions between the variables，and three
response variables such as extract temperature，time and ethanol concentration affected on the extraction
of polyphenol from neem leaf were investigated by the single factor experiment and response surface
method． And the extraction process was optimized． Moreover，antioxidant activity of polyphenol in leaves
of neem was evaluated by in vitro． Experimental results show:(1)the optimum extraction conditions of
polyphenol from the neem leaf were temperature 77 ℃ extraction time 80 min and ethanol concentration
50%;(2)the influence order of response variables was extraction temperature，extraction time，ethanol
concentration;(3)the average extract ratio of polyphenol in the neem leaf was 3. 12%; (4)under the
same concentration，the antioxidant activity of polyphenol extracted from neem leaf was stronger than
that of Vc，and the IC50 values of phenolics scavenging activity on DPPH was approximately 4. 6 mg /L．
It was less than that of Vc which was approximately 9. 8 mg /L．(5)the 23 mg /L of IC50 values of neem
leaf phenolics scavenging activity on·OH was less than that of Vc which was about 85 mg /L．
Key words:neem leaf;polyphenol;response surface methodology;antioxidant;separation and
purification technology
Foundation item:The National Science and Technology Project of the“12th Five-year-plan”for the
Ｒural Development in China(2012BAD21B0404)
印楝(Azadirachta indica A． Juss．)为楝科楝属
常绿乔木，其种子含有大量以印楝素为主的杀虫活
性物质。印楝叶中印楝素的含量相对较少，却含有
黄酮、多酚类等多种成分。从植物中提取的多酚具
有多种生物活性，特别是具有药用保健功能，如:诱
导肿瘤细胞凋亡［1 － 2］、抗辐射［3 － 4］、改善心血管疾
病［5 － 6］等。实验研究表明，印楝多酚具有较强的抗
动脉粥样硬化的作用［7］，在预防和治疗妇科癌症方
面存在应用价值［8］。印楝嫩叶和老叶均含有多酚
类物质，如没食子酸和阿魏酸［9］，其提取物具有较
强的抗氧化活性［10］。
目前，国内有关利用农林和工业生产中的植物
副产物提取多酚类物质的报道较多［11 － 13］。印楝通
常被利用的是含有印楝素的种子，诸多的研究侧重
于针对具有杀虫活性的萜类化合物，而对多酚等多
种次生代谢产物的研究相对较少，对印楝不同组织
部位进行生物活性成分的提取和活性测定等研究，
为印楝叶、花、果皮及其他部位的新用途开发奠定基
础，在印楝的综合利用方面具有重要的意义。
1 实验部分
1. 1 试剂与仪器
原料:印楝叶:2012 年 12 月采集于中国林业科
学研究院资源昆虫研究所云南元江热区试验站(中
国林业科学研究院资源昆虫研究所张燕平研究员鉴
定为印楝叶，产地为云南元江)，50 ℃干燥后粉碎过
20 目筛备用。
试剂:没食子酸(AＲ)，无水碳酸钠(AＲ)，福林酚
(Solarbio)，乙醇(AＲ)，2 2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH，
alfa，质量分数 95%)，水杨酸(AＲ)，FeSO4·7H2O
(AＲ)，H2O2(AＲ)，去离子水(实验室自制，18. 2 MΩ)。
分光光度仪(BECKMAN COULTEＲ DU 800，1
cm比色皿) ;纯水系统(CENTＲA Ｒ 200，ELGA)。
1. 2 方法
1. 2． 1 印楝叶总多酚的提取
准确称取50. 000 0 g 印楝叶粉末，加入 500 mL
一定体积分数的乙醇，于水浴中设置一定的提取温
度回流提取，一定时间后取出，常压过滤，滤液收集
于 500 mL容量瓶中，用去离子水定容。即为待测样
品溶液。
1. 2. 2 响应曲面法实验设计
在单因素实验的基础上，选择提取温度、提取时
间、乙醇体积分数 3 个因素作为响应变量，以印楝叶
中总多酚含量为响应值，利用 Design-Expert V8. 0. 6
软件按照 Box-Behnken 实验设计原理，设计三因素
三水平实验，通过响应曲面分析进行印楝叶总多酚
提取条件的优化。实验因素水平编码设计见表 1。
表 1 响应面分析因素与水平取值表
Table 1 Factors and their coded levels used in response surface
analysis
因素
编码水平
－ 1 0 1
A提取温度 /℃ 70 80 90
B提取时间 /min 60 90 120
C乙醇体积分数 /% 40 50 60
1. 2. 3 多酚的测定方法
多酚的测定:参考 GB /T8313—2008 标准，采用
福林-肖卡法(Folin-Ciocalteu)。
没食子酸工作曲线绘制:准确称取0. 100 0 g 没
食子酸，用水溶解，定容于 100 mL 容量瓶。分别移
取 1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0 mL 没食子酸标准贮备液
于 100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，质量浓度分
别为 10、20、30、40、50 mg /L，备用。分别移取上述
工作液 1. 0 mL 于 10 mL 容量瓶中，各加入 5. 0 mL
体积分数 10%的福林酚试剂，摇匀后约 3 ～ 8 min
内，加入 4. 0 mL质量分数 7. 5%的 Na2CO3 溶液，摇
匀静置 60 min，于 750 nm 波长下检测吸光度值，同
时以 1. 0 mL水代替没食子酸标准溶液做空白对照。
以所得吸光度值为纵坐标，样品质量浓度为横坐标
绘制标准曲线，得到没食子酸质量浓度 ρ(mg /L)与
吸光度 A的线性关系为:
A = 0. 1137ρ + 0. 0207(r = 0. 9994)
在 1 ～50 mg /L内，吸光度与质量浓度线性关系良好。
印楝叶样品多酚的检测:取待测样品溶液 1. 0
mL于 10 mL容量瓶中，按制作标准曲线的方法测定
其在 750 nm波长下的吸光度值。根据测得的吸光度
值按标准溶液回归方程计算样品溶液中总多酚的质
量浓度，并根据下式计算印楝叶样品中总多酚含量:
M/% = ρ /(200m)× 100
式中:M—印楝叶样品中总多酚所占干样品的质量
分数，%;ρ—样品溶液中总多酚质量浓度，由标准曲
线线性方程计算得到;m—印楝叶样品质量，g。
1. 2. 4 印楝叶总多酚清除 DPPH能力的测定
参考周晔等［14］方法的基础上略微改动，测定印
楝叶总多酚对 DPPH自由基的清除率。分别取已知
质量浓度的印楝叶总多酚提取液 10、30、80、110、
130、163、200 μL于 10 mL具塞试管中，加去离子水
补至 2 mL，作为不同质量浓度的待测溶液，DPPH乙
醇溶液浓度为 0. 1 mmol /L，其余实验条件以及
DPPH自由基清除率计算公式参考文献［14］的方
法。
·56·第 1 期 王有琼，等:印楝叶多酚提取及体外抗氧化活性
1. 2. 5 印楝叶总多酚清除羟自由基(·OH)能力的
测定
采用水杨酸法测定，分别取已知质量浓度的印楝
叶总多酚提取液 50、100、200、300、400、500、600、700
μL于 10 mL具塞试管中，加去离子水补至 1 mL，作
为不同浓度的待测溶液，参考颜军等［15］的方法测定
印楝叶总多酚对羟自由基(·OH)的清除率。
2 结果与讨论
2. 1 单因素实验结果
按照 1. 2. 1节的方法提取印楝叶中的总多酚，并
按照 1. 2. 3节的方法测定样品中的总多酚含量。在
单因素实验设定的提取条件下，提取温度越高，多酚
提取率越高，选取 70、80、90 ℃作为响应面实验设计
的提取温度条件;随着提取时间的延长，印楝叶多酚
提取率提高，选取 60、90、120 min 作为响应面实验设
计的提取时间条件;随着乙醇体积分数的升高，多酚
提取率先升高后降低，并且在乙醇低浓度区域提取率
高，而在高浓度区域提取率较低，选取乙醇体积分数
40%、50%、60%作为响应面实验考察的条件。
2. 2 响应曲面分析
2. 2. 1 响应面设计与实验结果
在单因素实验的基础上，运用 Design － Expert
V8. 0. 6 数据统计分析软件设计实验，得到实验方案
与结果，如表 2 所示，共 15 个实验点，其中 12 个为
析因实验点，3 个为零点，零点实验进行 3 次，用于
估计实验误差。
表 2 Box-Behnken实验设计及结果
Table 2 Experimental design and corresponding results of Box-
Behnken for response surface analysis
实验号
A提取温度 /
℃
B提取时间
/min
C乙醇体积分数
/%
多酚含量
/%
1 － 1 0 － 1 2． 97
2 0 0 0 3． 11
3 － 1 0 1 3． 09
4 0 0 0 3． 16
5 0 1 － 1 2． 86
6 1 0 － 1 2． 76
7 1 － 1 0 2． 71
8 0 0 0 3． 11
9 0 － 1 － 1 3． 01
10 1 0 1 2． 67
11 － 1 － 1 0 2． 91
12 0 － 1 1 2． 93
13 1 1 0 2． 51
14 － 1 1 0 2． 69
15 0 1 1 2． 68
2. 2． 2 建立模型方程与显著性检验
应用 Design-Expert软件对表 2 中数据进行多元
回归拟合，得到印楝叶多酚含量对提取温度(A)、提
取时间(B)、乙醇体积分数(C)的二次多项回归方程:
印楝叶多酚含量(%)=3. 13 －0. 13A －0. 10B －
0. 03C +0. 01AB －0. 05AC －0. 03BC －0. 21A2 －
0. 21B2 －0. 04C2
表 3 回归模型方差分析
Table 3 Estimated values of the partial regression coefficients
of the regression model
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性
模型 0． 537 9 0． 060 14． 897 0． 004 ＊＊
A 0． 128 1 0． 128 31． 812 0． 002 ＊＊
B 0． 084 1 0． 084 20． 969 0． 006 ＊＊
C 0． 007 1 0． 007 1． 650 0． 255
AB 0． 0001 1 0． 0001 0． 025 0． 881
AC 0． 011 1 0． 011 2． 751 0． 158
BC 0． 003 1 0． 003 0． 624 0． 466
A2 0． 162 1 0． 162 40． 462 0． 001 ＊＊
B2 0． 166 1 0． 166 41． 433 0． 001 ＊＊
C2 0． 007 1 0． 007 1． 831 0． 234
残差 0． 020 5 0． 004
失拟项 0． 018 3 0． 006 7． 35 0． 122 不显著
纯误差 0． 002 2 0． 001
总和 0． 557 14
注:* 表示影响显著(P ＜ 0. 05) ;＊＊表示影响极显著(P ＜
0. 01)。
由表 3 可知，回归模型极显著，表明所得二次多
项回归方程极显著，而失拟项不显著，模型能够较好
地描述各响应变量与响应值之间的关系，能够用此
模型预测实验结果。A、B、A2、B2 对印楝叶多酚的提
取率影响极显著，其他项影响不显著。3 个考察因
素对印楝叶多酚提取率的影响大小为:提取温度 ＞
提取时间 ＞乙醇体积分数。
2. 2. 3 响应曲面图分析与优化
根据回归模型绘出了印楝叶总多酚提取 3 个因
素交互作用的响应曲面图和等值线图，见图 1 ～ 3。
-1.00 -1.00 A:
提
取
温
度
3.2
3
2.8
2.6
2.4多
酚
含
量
/%
1.00
0.00
-0.50
0.50B:提取时间
-0.50
0.50
0.00
1.00
图 1 提取温度和提取时间对多酚含量的响应面和等值线图
Fig． 1 The response surface and contour of extraction
temperature and time
·66· 精 细 化 工 FINE CHEMICALS 第 32 卷
-1.00 -1.00
C:乙
醇
体
积
分
数
3.2
3
2.8
2.6
2.4
1.00
0.00
-0.50
0.50
B:提取时
间-0.50
0.50
0.00
1.00
多
酚
含
量
/%
图 2 提取温度和乙醇体积分数对多酚含量的响应面和等
值线图
Fig． 2 The response surface and contour of extraction
temperature and ethanol concentration
-1.00 -1.00
C:乙
醇
体
积
分
数
3.2
3
2.8
2.6
2.4
1.00
0.00
-0.50
0.50
B:提取
时间-0.50
0.50
0.00
1.00
多
酚
含
量
/%
图 3 提取时间和乙醇体积分数对多酚含量的响应面和等
值线图
Fig． 3 The response surface and contour of extraction time and
ethanol concentration
分析图 1 ～ 3 可知，提取温度曲线较陡，提取时
间次之，乙醇体积分数曲线较平滑，表明提取温度对
多酚含量的影响最明显，提取时间次之，乙醇体积分
数的影响较弱，这与表 3 的结果一致。响应面图中
多酚含量随 3 个因素的变化规律均为随 3 个因素的
单独增加呈现先增后减的趋势。等值线的形状反映
了因素之间交互效应的强弱，等值线越圆两因素交
互作用则越弱。图 2 和图 3 中等值线的形状呈明显
的椭圆形，表明提取温度和乙醇体积分数之间、提取
时间和乙醇体积分数之间的交互效应较显著;图 1
中等值线的形状相对较圆，表明提取温度和提取时
间的交互效应对印楝叶多酚的提取影响不明显，与
表 3 中 AC、BC之间拟合的系数的绝对值大于 AB项
的方差分析结果一致。
通过回归模型预测的印楝叶多酚提取的最佳工
艺条件为:提取温度 77. 1 ℃，提取时间 83. 0 min、乙
醇体积分数 49. 1%，印楝叶中多酚含量的理论值最
高为 3. 16%。考虑到实际操作的可能性与方便性，
将上述优化的提取工艺条件修正为:提取温度 77
℃、提取时间 80 min、乙醇体积分数 50%，在此工艺
条件下做验证实验 3 次，得到的印楝叶多酚含量平
均值为 3. 12%，实验值与理论预测值相对误差为
1. 27%，证明利用响应面法分析优化得到的印楝叶
多酚提取工艺条件准确可靠，具有实际指导意义。
2. 3 印楝叶多酚抗氧化实验结果
2. 3. 1 DPPH自由基清除能力
印楝叶多酚提取液清除 DPPH自由基的测定结
果见图 4。由图 4 可知，印楝叶乙醇-水提取液对
DPPH自由基具有较强的清除能力，并随多酚质量
浓度的增加而增强，其清除自由基的活性大于维生
素 C，半数抑制质量浓度(IC50)约为 4. 6 mg /L，维生
素 C的半数抑制质量浓度(IC50)约为 9. 8 mg /L。
图 4 印楝叶提取物对 DPPH自由基的清除作用
Fig． 4 Scavenging ability of neem leaf extractin and Vc on 1-
diphenyl-2-picrylhydrazyl
2. 3. 2 羟自由基(·OH)清除能力
印楝叶多酚提取液和天然抗氧化剂 Vc 对羟自
由基(·OH)的清除活性实验结果见图 5。
图 5 印楝叶提取物对 OH自由基的清除作用
Fig． 5 Scavenging ability of neem leaf extractin on hydroxyl
在所选质量浓度范围内，印楝叶多酚和 Vc 对
·OH 自由基的清除率随着质量浓度的升高均呈上
·76·第 1 期 王有琼，等:印楝叶多酚提取及体外抗氧化活性
升趋势，两者不同之处在于印楝叶多酚提取液在较
低的质量浓度下即表现出较强的清除·OH 自由基
的能力，其半数抑制质量浓度(IC50)约为 23 mg /L。
而 Vc 在较低质量浓度时对·OH 自由基的清除能
力较弱，其半数抑制质量浓度(IC50)约为 85 mg /L。
3 结论
(1)应用响应面法优化印楝叶多酚提取工艺实
验结果表明，提取温度和提取时间对印楝叶多酚的
提取影响极显著，乙醇体积分数的影响较弱，其对提
取率的影响大小为:提取温度 ＞提取时间 ＞乙醇体
积分数。二次项的 A2、B2 对多酚提取影响程度极显
著。交互作用项、二次项的 C2 对提取影响不显著。
综合分析回归模型，确定最佳工艺条件为:提取温度
77 ℃、提取时间 80 min、乙醇体积分数 50%，验证实
验得到印楝叶多酚含量平均为 3. 12%，与理论值相
对误差 1. 27%，实验值与理论值相符。
(2)经体外抗氧化实验评价，印楝叶多酚提取
液表现出比 Vc 更强的清除 DPPH 自由基和·OH
自由基的活性，能够在较低质量浓度发挥抗氧化能
力，特别是清除·OH 自由基的半数抑制质量浓度
(IC50)约为 23 mg /L，远远低于 Vc 的半数抑制质量
浓度(IC50)85 mg /L。
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