全 文 ： 中国现代应用药学 2015 年 11 月第 32 卷第 11 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2015 November, Vol.32 No.11 ·1319·
微波辅助提取印楝叶多酚及其体外抗氧化活性研究

王有琼，马李一，张重权，张燕平，段琼芬*(中国林业科学研究院资源昆虫研究所，昆明 650224)

摘要：目的 筛选微波辅助提取印楝叶总多酚的工艺条件，并测定印楝叶总多酚的体外抗氧化活性。方法 通过单因素
和响应曲面法设计实验，考察萃取温度、萃取时间、乙醇体积分数 3 个响应变量以及变量之间交互作用对印楝叶多酚提
取效果的影响，对提取工艺进行优化。以清除 2,2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH·)自由基、羟自由基(·OH)及还原力测定实验
评价印楝叶多酚的抗氧化能力。结果 微波辅助印楝叶多酚提取的最佳工艺条件为萃取温度 62 ℃，萃取时间 40 min，乙
醇体积分数 48%；响应变量影响顺序为萃取温度>乙醇体积分数>萃取时间；验证实验得到印楝叶中多酚提取得率平均为
2.96%，与理论值相对误差为 1.33%。印楝叶多酚清除 DPPH·自由基的半数抑制质量浓度(IC50)约为 2.6 mg·L1，·OH 自由
基的 IC50 约为 15 mg·L1，在较低浓度时印楝叶多酚具有较强还原能力。结论 印楝叶多酚在低浓度时表现出较维生素 C
更强的抗氧化活性。
关键词：印楝；多酚；微波萃取；抗氧化
中图分类号：TQ91；R284.2 文献标志码：B 文章编号：1007-7693(2015)11-1319-06
DOI: 10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2015.11.009

Microwave Extraction Technique of Polyphenols and in Vitro Antioxidation Activity from the Leaves of
Azadirachta Indica A.Juss.

WANG Youqiong, MA Liyi, ZHANG Zhongquan, ZHANG Yanping, DUAN Qiongfen*(Research Institute of
Resources Insects, Chinese Academy of Forestry, Kunming 650224, China)

ABSTRACT: OBJECTIVE To optimize the microwave extraction technique of polyphenol from Azadirachta indica A. Juss.
leaves by response surface methodology and to evaluate the in vitro antioxidant activity of polyphenol in leaves of Azadirachta
indica A.Juss.. METHODS The experiment was designed by single factor experiment and response surface method. The
influence and the interaction of three response variables such as extract temperature, extraction time, ethanol concentration were
investigated. The extraction technology was optimized. The antioxidant activities of polyphenol extracted from Azadirachta
indica A. Juss. leaves were evaluated through clearing the DPPH·, ·OH free radical and reducing power. RESULTS The
optimum microwave extraction conditions of polyphenol in the Azadirachta indica A. Juss. leaves were extraction temperature
62 ℃, extraction time 40 min, ethanol concentration 48%. The influence order of response variables was extraction temperature,
ethanol concentration, extraction time. The average extract ratio of Azadirachta indica A. Juss. leaves polyphenol was 2.96% and
the relative error was 1.33%. The IC50 values of Azadirachta indica A. Juss. leaves phenolics scavenging activity on DPPH was
about 2.6 mg·L1. The IC50 values of Azadirachta indica A. Juss. leaves phenolics scavenging activity on OH was about
15 mg·L1. The reduction ability of Azadirachta indica A. Juss. leaves polyphenols was strong at lower concentration.
CONCLUSION The antioxidant activities of polyphenol extracted from Azadirachta indica A. Juss. leaves were stronger than
that of Vc at low concentration.
KEY WORDS: azadirachta indica; polyphenol; microwave extraction; antioxidant


基金项目：“十二五”农村领域国家科技计划(2012BAD21B04)
作者简介：王有琼，女，硕士，助理研究员 Tel: (0871)63862714 E-mail: wangkeyi666@126.com *通信作者：段琼芬，女，博士，
研究员 Tel: (0871)63862714 E-mail: qiongfend@163.com
印楝(Azadirachta indica A.Juss.)为楝科楝属常
绿乔木，它的种子含有大量以印楝素为主的杀虫
活性物质，用于生产生物农药。印楝叶中印楝素
含量相对较少，很难用于制备生物杀虫剂，而多
酚类等成分的含量却很丰富，可用于提取天然抗
氧化剂。从植物中提取的多酚对自由基引起的多
种慢性疾病具有预防和治疗作用，例如：诱导肿
瘤细胞凋亡[1-2]、抗肥胖和糖尿病[3]、抗神经退行
性疾病的神经保护作用[4]、改善心血管疾病[5]等。
实验研究表明，印楝多酚具有较强的抗动脉粥样
硬化的作用[6]；在预防和治疗妇科肿瘤方面具有潜
力，是一种有效的促进宫颈癌细胞凋亡的诱导剂
[7]；印楝叶的 80%乙醇提取物对人早幼粒白血病细
胞(HL-60 细胞)有较强活性，当 HL-60 细胞生长浓
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度为 0~500 µg·mL1 能够在 24 h 治愈[8]。印楝嫩叶
和老叶均含有多酚类物质，如没食子酸和阿魏酸
[9]，其提取物具有较强的抗氧化活性[10-11]。目前，
利用农林副产物提取多酚类物质的研究较多，如：
蓝莓叶及果渣多酚的提取[12]，榛树不同组织酚类
物质的研究[13]，具有神经保护作用的月桂树叶多
酚的提取和研究[14]等。在印楝的科研和加工领域，
有关印楝种子中印楝素类杀虫活性物质研究较
多，而对印楝叶、树皮等其他组织部位的研究相
对较少。有报道[15]用热回流法提取印楝叶中的多
酚类物质，并进行了清除自由基的活性实验研究，
结果发现印楝叶多酚具有较强的抗氧化活性。但
热回流法是一种传统的提取方法，耗时长，温度
高，对一些热敏性的物质具有破坏性，微波萃取
法做为一种新兴的萃取方法，具有能耗低，高效
快速等优点，对生物活性物质具有保护作用，目
前应用越来越广。用微波法萃取印楝叶多酚是对
传统萃取技术的改进，对于推动技术革新具有重
要意义。
1 材料
1.1 原料
2014 年 9 月采集于中国林业科学研究院资源
昆虫研究所云南元江热区试验站，由中国林业科
学研究院资源昆虫研究所张燕平研究员鉴定为印
楝(Azadirachta indica A.Juss.)的叶，风干后粉碎过
40 目筛备用。
1.2 试剂
没食子酸对照品(分析纯，国药集团化学试剂
有限公司 )；自由基：2，2-联苯基 -1-苦基肼基
(DPPH，Alfa 公司，95%)；2,4,6-三(2-吡啶基)-1,3,5-
三嗪(TPTZ，TCI)；去离子水(自制，18.2 MΩ)；
福 林 酚 (Solarbio 公 司 ) ； 无 水 碳 酸 钠 、
CH3COONa·3H2O、冰醋酸、水杨酸、H2O2 均为
分析纯，由天津市风船化学试剂有限公司生产；
乙醇、FeSO4·7H2O 均为分析纯，由广东光华科技
股份有限公司生产；FeCl3·6H2O(分析纯，天津市
大茂化学试剂厂)；HCl(分析纯，重庆川东化工有
限公司)。
1.3 仪器
AB204-S 型分析天平(瑞士 Mettler Toledo)；
MAS-I 型微波合成/萃取反应仪(上海新仪微波化
学科技有限公司)；DU 800 型分光光度仪(美国
BECKMAN COULTER，1 cm 比色皿)；CENTRA R
200 型纯水系统(英国 ELGA)。
2 方法
2.1 印楝叶总多酚的微波萃取及单因素实验
准确称取 2.0 g 印楝叶粉末，加入 60 mL 一定
体积分数的乙醇-水溶液，设置一定萃取温度、一
定萃取时间，于微波萃取器中萃取，考察萃取温
度、萃取时间和乙醇体积分数对实验的影响。萃
取完成后常压过滤，滤液收集于 100 mL 量瓶中，
用去离子水定容，即为印楝叶总酚提取液。吸取
10 mL 该提取液稀释 10 倍，用于测定样品总多酚
含量。
2.2 多酚的测定方法
多 酚 的 测 定 采 用 福 林 - 肖 卡 法 (Folin-
Ciocalteu，GB/T 8313-2008)。没食子酸工作曲线
绘制方法以及印楝叶样品多酚的检测方法参考文
献[15]，得到没食子酸浓度(C，mg·L1)与吸光度(A)
的线性关系为 A=0.101 6C+0.007 1，r=0.999 0，在
1~50 mg·L1 内吸光度与浓度线性关系良好。印楝
叶样品中总多酚含量计算公式：
%100
100

m
cM
式中：M—印楝叶样品中总多酚所占干样品的
质量分数(%)；c—样品溶液中总多酚浓度；m—印
楝叶样品质量(g)。
2.3 响应曲面法实验设计
在单因素试验的基础上，利用 Design-Expert
V8.0.6 软件按 Box-Behnken 试验设计原理，以印
楝叶中总多酚含量为响应值，通过响应曲面法进
行印楝叶总多酚微波辅助提取条件的优化，得到
最优提取条件。实验因素水平编码设计见表 1。
表 1 响应面分析因素与水平取值表
Tab. 1 Factors and their coded levels used in response
surface analysis
因素
编码水平
1 0 1
A 萃取温度/℃ 50 60 70
B 萃取时间/min 20 40 60
C 乙醇体积分数/% 40 50 60
2.4 印楝叶总多酚清除 DPPH能力的测定
分别取“2.2”项下测定的印楝叶总酚提取液
5，10，20，30，60，80，100，120 µL 于 10 mL
具塞试管中，测定印楝叶多酚清除 DPPH的能力，
测定方法参考文献[15]。
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2.5 印楝叶总多酚清除羟自由基(OH)能力的测定
参考文献[15]的方法，采用水杨酸法测定印楝
叶总多酚清除OH 的能力，以相同浓度维生素 C
作对照。
2.6 亚铁还原能力法(ferric reducing antioxidant
power，FRAP)测定印楝叶总多酚的还原力
样品还原能力的测定采用 FRAP 法[16]，参考
文献[17]配制 TPTZ 工作液。
2.6.1 FeSO4 标准曲线的制作 称取 0.278 1 g
FeSO47H2O，用水溶解后定容于 100 mL 量瓶，作
为标准贮备液，分别取出标准贮备液 0.2，0.4，0.6，
0.8，1.0，1.5，2.0 mL 稀释至 100 mL，浓度分别
为 0.02，0.04，0.06，0.08，0.1，0.15，0.2 mmoL·L1，
分别取不同浓度 FeSO4 溶液 2 mL，参考文献[16]
的方法处理后测定吸光度，制作还原力标准曲线。
2.6.2 样品还原力的测定 取不同体积印楝叶总
酚提取液，用去离子水补至 2 mL，配制成系列不
同浓度的检测液，FeSO4 标准溶液用相同方法处理
并测定吸光度，根据吸光度值和标准曲线方程计
算 FeSO4 的当量浓度，并和相同浓度维生素 C 的
还原力作对比。
3 结果与分析
3.1 单因素实验结果
3.1.1 萃取温度对多酚含量的影响 固定萃取时
间为 20 min，乙醇体积分数为 70%，在萃取温度
分别为 30，40，50，60，70 ℃下萃取，印楝叶多
酚含量呈先上升后下降趋势，在 60 ℃时达到最高，
之后稍有下降。选取 50，60，70 ℃作为响应面实
验设计的萃取温度条件。
3.1.2 萃取时间对多酚含量的影响 固定萃取温
度为 60 ℃，乙醇体积分数 70%，分别萃取 20，40，
60，90，120 min，实验结果表明，萃取时间太长
不利于得到高含量的提取液，多酚含量在 40 min
时最高，之后持续下降，因此，选取 20，40，60 min
作为响应面实验设计的萃取时间条件。
3.1.3 乙醇体积分数对多酚含量的影响 固定萃
取温度 60 ℃，萃取时间 20 min，在乙醇体积分数
分别为 30%，40%，50%，60%，70%，80%，100%
条件下萃取，多酚含量随乙醇体积分数的增加呈
先上升后下降趋势，当乙醇体积分数为 50%时多
酚含量最高。选取乙醇体积分数 40%，50%，60%
作为响应面实验考察的条件。
3.2 响应曲面分析
3.2.1 响应面设计与试验结果 在单因素试验的
基础上，运用 Design-Expert V8.0.6 数据统计分析
软件设计三因素三水平试验，得到试验方案与结
果见表 2，共 15 个试验点。
表 2 Box-Behnken 试验设计及结果
Tab. 2 Experimental design and corresponding results of
Box-Behnken for response surface analysis
试验号 A 萃取温度 B 萃取时间 C 乙醇体积分数 多酚含量/%
1 1 0 1 2.80
2 0 0 0 2.97
3 0 1 1 2.56
4 0 0 0 2.96
5 0 1 1 2.69
6 1 0 1 2.57
7 1 1 0 2.73
8 0 0 0 3.01
9 0 1 1 2.69
10 1 1 0 2.50
11 1 0 1 2.52
12 1 0 1 2.67
13 0 1 1 2.65
14 1 1 0 2.61
15 1 1 0 2.59
3.2.2 建立模型方程与显著性检验 应用
Design-Expert 软件对表 2 中的数据进行多元回归
拟合，得到微波辅助提取印楝叶多酚含量对萃取
温度(A)、萃取时间(B)、乙醇体积分数(C)的二次多
项回归方程：印楝叶多酚含量(%)=2.98+0.078 8A
0.015B0.043 8C0.007 5AB0.02AC+0.022 5BC
0.19A20.182 5B20.15C2。结果见表 3。
表 3 回归模型方差分析
Tab. 3 Estimated values of the partial regression
coefficients of the regression model
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性
模型 0.365 4 9 0.040 6 13.739 4 0.005 0 极显著
A 0.049 6 1 0.049 6 16.789 3 0.009 4 极显著
B 0.001 8 1 0.001 8 0.609 1 0.470 4
C 0.015 3 1 0.015 3 5.181 9 0.071 9
AB 0.000 2 1 0.000 2 0.076 1 0.793 6
AC 0.001 6 1 0.001 6 0.541 5 0.494 9
BC 0.002 0 1 0.002 0 0.685 3 0.445 5
A2 0.133 3 1 0.133 3 45.107 4 0.001 1 极显著
B2 0.123 0 1 0.123 0 41.616 6 0.001 3 极显著
C2 0.083 1 1 0.083 1 28.114 0 0.003 2 极显著
残差 0.014 8 5 0.003 0
失拟项 0.013 4 3 0.004 5 6.369 0 0.138 7
纯误差 0.001 4 2 0.000 7
总和 0.380 2 14
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从表 3 可知，回归模型极显著，表明所得二
次多项回归方程极显著，而失拟项不显著，表明
方程失拟不显著，所以模型能够较好地描述各响
应变量与响应值之间的关系，能够用该模型预测
实验结果。A、A2、B2、C2 对印楝叶多酚的提取率
影响极显著，其他项影响不显著。3 个考察因素对
印楝叶多酚提取率的影响大小为萃取温度>乙醇
体积分数>萃取时间。
3.2.3 响应曲面图分析与优化 根据表 2 实验结
果及表 3 回归模型绘出微波辐射萃取印楝叶总多
酚 3 个影响因素交互作用的响应曲面图和等值线
图，结果见图 1~3。

图 1 萃取温度和萃取时间对多酚含量的响应面和等值线图
Fig. 1 The response surface and contour of extraction
temperature and time

图 2 萃取温度和乙醇体积分数对多酚含量的响应面和等
值线图
Fig. 2 The response surface and contour of extraction
temperature and ethanol concentration
分析图 1~3 可知，萃取温度曲线较陡，乙醇
体积分数次之，萃取时间曲线最平滑，表明萃取
温度对多酚含量的影响最明显，乙醇体积分数次
之，萃取时间的影响较弱，这与表 3 的结果一致。
响应曲面图中多酚含量随 3 个因素的变化规律均
为随 3 个因素的单独增加呈现先增后减的趋势，
其中随萃取温度增加较多并且减少较缓，故而萃

图 3 萃取时间和乙醇体积分数对多酚含量的响应面和等
值线图
Fig. 3 The response surface and contour of extraction time
and ethanol concentration
取温度曲线较陡。等值线的形状反映了因素之间
交互效应的强弱，等值线越圆两因素交互作用则
越弱。图 1 中等值线形状最接近圆形，图 2 次之，
图 3 中等值线呈椭圆形，表明 3 个考察因素之间
交互作用对实验结果的影响强弱顺序为萃取时间
和乙醇体积分数之间>萃取温度和乙醇体积分数
之间>萃取温度和萃取时间之间的交互效应，与表
3 中 BC、AC、AB 之间拟合的系数的绝对值大小
顺序的方差分析结果一致。
通过回归模型预测的微波辅助印楝叶多酚提
取的最佳工艺条件：萃取温度 62 ℃、萃取时间
40 min、乙醇体积分数 48%，印楝叶中多酚含量的
最高理论值为 3.0%。在此工艺条件下做验证试验
3 次，得到的印楝叶多酚含量平均值为 2.96%，实
验值与理论预测值相对误差为 1.33%，证明利用响
应面法分析优化得到的微波辅助提取印楝叶多酚
工艺条件准确可靠。同时，用优化的热水浴法[15]
对同批次印楝叶原料进行提取，测得多酚含量为
2.29%，表明微波萃取法多酚提取率高于热水浴回
流法，是一种高效低耗的萃取方法。
3.3 印楝叶多酚抗氧化实验结果
3.3.1 DPPH自由基清除能力 微波法提取印楝叶
多酚提取液清除 DPPH·自由基的测定结果见图 4。
由图 4 可知，印楝叶多酚提取液对 DPPH·自
由基具有较强的清除能力，并随多酚浓度的增加
而增强，半数抑制质量浓度(IC50)约为 2.6 mg·L1。
印楝叶多酚在低浓度时清除 DPPH·自由基的能力
略强于维生素 C，随着浓度的增加，维生素 C 的
清除能力逐渐强于印楝叶多酚，维生素 C 的 IC50
约为 2.5 mg·L1。
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图 4 印楝叶提取物对 DPPH·自由基的清除作用(n=3)
Fig. 4 Scavenging ability of neem leaf extractin and Vc on
1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(n=3)
3.3.2 OH 清除能力 印楝叶多酚提取液和天然
抗氧化剂维生素 C 对OH 的清除活性实验结果见
图 5。印楝叶多酚提取液在较低的浓度下即表现出
较强的清除OH 的能力，其 IC50 约为 15 mg·L1，
较文献[15]报道的 IC50 值 23 mg·L1 略低，其原因可
能是样品采集的季节不同以及多酚提取条件不同
所致，微波提取工艺由于萃取温度低、时间短从
而有利于保持多酚类物质的稳定性和活性。当印
楝叶多酚提取液的质量浓度为 42 mg·L1 时，对
OH 的清除能力基本达到最大，之后无明显变化。
维生素 C 在较低浓度时对OH 的清除能力较弱，
其 IC50 约为 84 mg·L1，但高浓度的维生素 C 几乎
能够全部清除OH。

图 5 印楝叶提取物对OH 的清除作用(n=3)
Fig. 5 Scavenging ability of neem leaf extractin and Vc on
hydroxyl radicals(n=3)
3.3.3 FRAP 法测定印楝叶总多酚还原力 由
FeSO4 标准曲线可知，当 FeSO4 浓度在 1.216~
12.16 mg·L1 内，浓度与吸光度值呈良好的线性关
系。标准曲线方程为 y=0.135 3x0.013 9，x 为
FeSO4 浓度(mg·L1)，y 为 593 nm 处的吸光度值，
相关系数 R2=0.999 8。
印楝叶多酚提取液的还原力测定结果可知，
随着印楝叶多酚浓度的增加，还原能力也不断增
强，表现在 FeSO4 当量浓度随印楝叶多酚浓度的
增加而增加，两者呈正相关。在低浓度时，印楝
叶多酚的还原力强于维生素 C，随着浓度的增加，
维生素 C 的还原力增加速度稍强于印楝叶多酚，
故在高浓度时，维生素 C 还原力强于印楝叶多酚，
结果见图 6。

图 6 印楝叶提取物还原力测定(n=3)
Fig. 6 Reduction ability of neem leaf extractin and Vc(n=3)
4 结论
应用响应面法优化微波辅助提取印楝叶多酚
工艺试验结果表明，回归模型极显著，所得二次
多项回归方程极显著；萃取温度、萃取时间、乙
醇体积分数这 3 个考察因素对印楝叶多酚提取率
的影响大小为萃取温度(A)>乙醇体积分数(B)>萃
取时间(C)，其中萃取温度的影响为极显著；二次
项的 A2、B2、C2 对多酚提取影响程度极显著；交
互作用项对提取影响不显著。综合分析回归模型，
确定最佳工艺条件为萃取温度 62 ℃、萃取时间
40 min、乙醇体积分数 48%，验证实验得到印楝叶
多酚含量平均为 2.96%，与理论值相对误差 1.33%，
试验值与理论值相符。与热水浴回流方法相比，
微波萃取法提取温度低、时间短，提取率高，节
能降耗，对于成本控制非常有利。
经体外抗氧化实验评价，印楝叶多酚提取液
表现出较强的抗氧化活性，在较低浓度时，就具
有较强的清除 DPPH和OH 的能力，并且，印楝
叶多酚在低浓度时其抗氧化活性强于维生素 C，随
着浓度的增加，维生素 C 的抗氧化活性才逐渐强
于印楝叶多酚，这在印楝叶多酚清除 DPPH和OH
以及还原力测定上均表现出来。值得注意的是，
印楝叶多酚清除OH 的 IC50 约为 15 mg·L1，远远
低于维生素 C 的 IC50 84 mg·L1，并且当印楝叶多
酚的浓度为 42 mg·L1 时，就能清除 89%的OH，
这在防治由OH 引起的疾病方面具有极大的潜力。
REFERENCES
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收稿日期：2015-04-21



蟾酥缓释微丸的质量标准

李雅雅，刘伯宇，黄绳武*(浙江中医药大学药学院，杭州 310053)

摘要：目的 研究并制定蟾酥缓释微丸的质量标准。方法 采用 TLC 鉴别制剂中各成分；采用 HPLC 分别测定华蟾酥毒
基及酯蟾毒配基的含量；采用紫外分光光度计测定制剂中吲哚生物碱类成分。结果 3 批制剂均出现与对照品相对应的
斑点，阴性制剂无干扰；华蟾酥毒基在 0.018 4~0.570 4 μg 内呈良好线性关系(r=0.999 8，n=6)，平均加样回收率为 100.46%，
RSD 为 3.08%(n=9)；酯蟾毒配基在 0.007 8~0.241 8 μg 内呈良好线性关系(r=0.999 8，n=6)，平均加样回收率为 98.28%，
RSD 为 2.22%(n=9)。初步确定 3 批样品中华蟾素毒基与酯蟾毒配基的总量不得<0.006 g·g1，吲哚生物碱类含量不得
<0.007 g·g1。结论 本法专属性强、简便可行，可作为蟾酥缓释微丸的质量标准。
关键词：蟾酥缓释微丸；薄层色谱法；高效液相色谱法；紫外分光光度计；质量标准
中图分类号：R917 文献标志码：B 文章编号：1007-7693(2015)11-1324-06
DOI: 10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2015.11.010

Quality Standard of Venenum Bufonis Sustained-release Pellets

LI Yaya, LIU Boyu, HUANG Shengwu*(Pharmaceutical College, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou
310053, China)

作者简介：李雅雅，女，硕士生 Tel: 15869134120 E-mail: liyaya133@163.com *通信作者：黄绳武，男，教授 Tel: 18606505050
E-mail: hsw55@163.com