全 文 ：ＤＯＩ：１０．１３３５０／ｊ．ｃｊｐｂ．１４０１０４ ·论著·
苦楝叶对钉螺酶组织化学的影响＊
顾文彪１，张仪１＊＊，夏尚光２，吕山１，朱丹１，吴缨１，刘和香１，王龙杰１
（１．中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，世界卫生组织疟疾、血吸虫病和丝虫病合作中心，
卫生部寄生虫病重点实验室，上海２０００２５；２．安徽省林业科学研究院，安徽合肥２３００３１）
【摘要】　目的　钉螺经苦楝叶浸提液浸泡后，检测其体内三磷酸腺苷酶、琥珀酸脱氢酶、乳酸脱氢酶和一氧化氮合酶的
活性，探讨苦楝叶杀螺机制。　方法　经苦楝叶浸提液处理４８ｈ的钉螺，冰冻切片，使用酶组织化学染色检测４种酶活
性的变化，实验设未经药物处理对照组。　结果　实验组钉螺头足部和消化腺的Ｃａ２＋ －ＡＴＰａｓｅ灰度值分别为０．１９７±
０．０５９和０．２３３±０．０３７，与对照组０．２９８±０．０４１和０．４１３±０．０５７比较差异有统计学意义（ｔ＝９．０３６和８．５９４，Ｐ＜
０．０５）；实验组钉螺头足部肌纤维的ＳＤＨ灰度值为０．１５２±０．０３８，与对照组０．２２８±０．０４１比较差异有统计学意义（ｔ＝
７．１６７，Ｐ＜０．０５）；实验组钉螺神经中枢、足部和心脏的 ＮＯＳ灰度值分别为０．６１６±０．０６４、０．４３１±０．０４３和０．７１６±
０．０５８，与对照组分别为０．５１４±０．０４９、０．３０２±０．０４２和０．５０３±０．０４５比较差异均有统计学意义（ｔ分别为３．８３３、６．１２５
和８．６０８，Ｐ＜０．０５）。　结论　经苦楝叶浸提液处理的钉螺 ＮＯＳ水平升高Ｃａ２＋ －ＡＴＰａｓｅ和ＳＤＨ水平下降。因此推测
钉螺苦楝叶杀螺机制可能是ＮＯＳ升高增加了钉螺头足部ＮＯ的含量，从而抑制头足部有氧呼吸，降低钙泵的活性，引起
钙超载，诱导细胞凋亡，最终导致钉螺死亡。
【关键词】　苦楝；钉螺；酶组织化学；三磷酸腺苷酶；琥珀酸脱氢酶；乳酸脱氢酶；一氧化氮合酶
【中图分类号】　Ｒ１８４．３８　　　【文献标识码】　Ａ　　　【文章编号】　１６７３－５２３４（２０１４）０１－００１６－０４
［Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｇｅｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１４Ｊａｎ；９（１）：１６－１９．］
Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｍｅｌｉａ　ａｚｅｄａｒａｃｈ　ｏｎ　ｅｎｚｙｍｅ　ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｉｎ　Ｏｎｃｏｍｅｌａｎｉａ　ｈｕｐｅｎｓｉｓ
ＧＵ　Ｗｅｎ－ｂｉａｏ１，ＺＨＡＮＧ　Ｙｉ　１，ＸＩＡ　Ｓｈａｎｇ－ｇｕａｎｇ２，ＬＶ　Ｓｈａｎ１，ＺＨＵ　Ｄａｎ１，ＷＵ　Ｙｉｎｇ１，ＬＩＵ　Ｈｅ－
ｘｉａｎｇ１，ＷＡＮＧ　Ｌｏｎｇ－ｊｉｅ１　（１．Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｐａｒａｓｉｔｉｃ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ
Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ／Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｐａｒａｓｉｔｅ　ａｎｄ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ／ＷＨＯ　Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ
Ｍａｌａｒｉａ，Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｉａｓｉｓ　ａｎｄ　Ｆｉｌａｒｉａｓｉｓ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０００２５，Ｃｈｉｎａ；２．Ａｎｈｕｉ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ）
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｍｏｌｕｓｃｉｃｉｄａｌ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　Ｍｅｌｉａ　ａｚｅｄａｒａｃｈ，ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ２＋ －ＡＴＰａｓｅ，ｓｕｃｃｉ－
ｎａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＳＤＨ），ｌａｃｔａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＬＤＨ），ａｎｄ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＮＯＳ）ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｉｎ　Ｏｎｃｏｍｅｌａ－
ｎｉａ　ｈｕｐｅｎｓｉｓ　ｔｈａｔ　ｈａｄ　ｂｅｅｎ　ｉｍｍｅｒｓｅｄ　ｉｎ　ａ　ｌｅａｆ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ｍｅｌｉａ　ａｚｅｄａｒａｃｈ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｓｎａｉｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ
ｗｅｒｅ　ｉｍｍｅｒｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌｅａｆ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ｍ．ａｚｅｄａｒａｃｈｆｏｒ　４８ｈｏｕｒｓ　ａｎｄ　ｓｏｆｔ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｆｏｒ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｒｏｚｅｎ
ｓｅｃｔｉｏｎｓ（６－μｍ　ｓｌｉｃｅｓ）．Ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　Ｃａ
２＋ －ＡＴＰａｓｅ，ＳＤＨ，ＬＤＨ，ａｎｄ　ＮＯＳ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ａｎ　ｅｎｚｙｍｅ－ｈｉｓｔｏ－
ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ　ｓｎａｉｌｓ　ｓｅｒｖｅｄ　ａｓ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｃａ２＋ －ＡＴＰａｓｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ｍｅａｎ　ｇｒａｙ　ｄｅｎｓｉｔｙ
ｖａｌｕｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｈｅａｄ－ｆｏｏｔ　ａｎｄ　ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ　ｇｌａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０５）ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ（０．１９７±
０．０５９，０．２３３±０．０３７）ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（０．２９８±０．０４１，０．４１３±０．０５７）．ＳＤＨ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｍｅａｎ　ｇｒａｙ
ｄｅｎｓｉｔｙ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｍｕｓｃｌｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０５）ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ（０．１５２±０．０３８）ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ
ｇｒｏｕｐ（０．２２８±０．０４１）．ＮＯＳ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｍｅａｎ　ｇｒａｙ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｖａｌｕｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｇａｎｇｌｉｏｎ，ｆｏｏｔ，ａｎｄ　ｈｅａｒｔ　ｄｉｆ－
ｆｅｒｅｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０５）ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ（０．６１６±０．０６４，０．４３１±０．０４３，ａｎｄ　０．７１６±０．０５８）ａｎｄ
ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（０．５１４±０．０４９，０．３０２±０．０４２，ａｎｄ　０．５０３±０．０４５）．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｂｏｔｈ　Ｃａ２＋－
ＡＴＰａｓｅ　ａｎｄ　ＳＤＨ　ｄｅｃｌｉｎｅｄ，ａｎｄ　ＮＯＳ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｒｏｓｅ　ｉｎ　ｓｎａｉｌｓ　ａｆｔｅｒ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ａ　ｌｅａｆ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ｍ．ａｚｅｄａｒａｃｈ．Ｔｈｅ　ｍｏｌ－
ｌｕｓｃｉｃｉｄａｌ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　Ｍ．ａｚｅｄａｒａｃｈｉｓ　ｐｒｅｓｕｍａｂｌｙ　ｂｙ　ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ＮＯ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｈｅａｄ－ｆｏｏｔ，ｔｈｕｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ａｅｒ－
ｏｂｉｃ　ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｒｅｄｕｃｉｎｇ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｐｕｍｐ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｔｈｉｓ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎ　ａ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｏｖｅｒｌｏａｄ　ｔｈａｔ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｅｖｅｎｔｕａｌ－
ｌｙ　ｌｅａｄｓ　ｔｏ　ｄｅａｔｈ．
【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】　Ｍｅｌｉａ　ａｚｅｄａｒａｃｈ，Ｏｎｃｏｍｅｌａｎｉａ　ｈｕｐｅｎｓｉｓ，ｅｎｚｙｍｅ－ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｃａ２＋ －ＡＴＰａｓｅ，ｓｕｃｃｉｎａｔｅ　ｄｅｈｙ－
ｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＳＤＨ），ｌａｃｔａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＬＤＨ），ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＮＯＳ）
＊＊＊近年来，大量研究证明苦楝叶有杀灭钉螺作
用［１～３］。本研究采用酶组织化学技术检测经苦楝叶处
理后钉螺体内 Ｃａ２＋ 介导三磷酸腺苷酶（Ｃａ２＋－ＡＴ－
Ｐａｓｅ）、琥 珀 酸 脱 氢 酶 （ｓｕｃｃｉｎａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，
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中 国 病 原 生 物 学 杂 志
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｇｅｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　
２０１４年１月　第９卷第１期
Ｊａｎｕａｒｙ　２０１４，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．１
＊
＊＊
【基 金 项 目】　 国 家 “十 二 五”国 家 科 技 计 划 项 目 （Ｎｏ．
２０１１ＢＡＤ３８Ｂ０７０１０１）； 国 家 科 技 重 大 专 项 （Ｎｏ．
２０１２ＺＸ１０００４２２０，２００８ＺＸ１０００４－０１１）。
【通讯作者】　张　仪，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇ１９７２００３＠１６３．ｃｏｍ
【作者简介】　顾文彪（１９８６－），男，上海人，硕士，研究实习员，
主要研究方向为病媒生物学。Ｅ－ｍａｉｌ：４５１９２２５５＠ｑｑ．ｃｏｍ
ＳＤＨ）、乳酸脱氢酶（ｌａｃｔａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＬＤＨ）、一
氧化氮合酶（ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＮＯＳ）等酶活性的
变化，为探讨苦楝叶的杀螺机制提供依据。
材料与方法
１　材料
钉螺成螺６０只，由本实验室提供。苦楝叶浸提液
由安徽省林业科学院惠赠。氯化钙（ＣａＣｌ２）、氯化钴
（ＣａＣｌ２）、硫化铵［（ＮＨ４）２Ｓ］、硝基四氮唑蓝（ＮＢＴ）、
三磷酸腺苷二钠（ＡＴＰ－Ｎａ２）、琥珀酸钠（ｓｏｄｉｕｍ　ｓｕｃｃｉ－
ｎａｔｅ）、乳酸钠（ｄｌ－ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｏｄｉｕｍ）还原型辅酶Ⅰ
（ＮＡＤＨ·Ｎａ）、还原型尼可酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸
硫辛酰胺脱氢酶（ＮＡＤＰＨ－ｄ）购自国药集团化学试剂
有限公司。
２　方法
２．１　动物试验　６０只钉螺随机分为２组，每组３０
只。实验组于２５℃环境用苦楝叶浸提液浸泡４８ｈ，取
出，用氯水洗净后放入清水中，根据钉螺活动状况判断
死活。取活螺，压碎，剔除螺壳，留取软体，冰冻切片
（厚度６μｍ），切片贴于经多聚赖氨酸处理的载玻片
上，用于酶组织化学检测。
２．２　酶化学检测　ＡＴＰａｓｅ、ＳＤＨ、ＬＤＨ检测方法参
考文献［４］，ＮＯＳ检测参考文献［５］方法。试验均设阳
性对照，并使用ＰＢＳ代替反应底物作为空白对照。
结果判断：１）ＡＴＰａｓｅ染色：呈棕黑色为强阳性，
棕色为阳性，不着色为阴性；２）ＳＤＨ、ＬＤＨ 染色：蓝紫
色为强阳性，蓝色为阳性，不着色为阴性；３）ＮＯＳ染
色：紫黑色为强阳性，蓝紫色为阳性。染色定量以平均
灰度值（Ａ）表示（选取样品阳性部位，在相同倍数的视
野、相同亮度以及相同曝光时间下照相，所得相片用
ＩＰＰ６．０软件计算相片中阳性部位的平均灰度值）。
２．３　统计学分析　使用ＳＰＳＳ１３．０对数据进行分析。
Ａ值使用ｘ±ｓ表示，两组间的比较采用独立样本的ｔ
检验，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
结　果
１　Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ定性及定量分析
酶组织化学法检测Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ在钉螺体内各
组织均有分布，其中对照组钉螺中头足部和消化腺的
表达呈强阳性（图１Ａ），实验组钉螺均无强阳性部位。
经定量分析，对照组钉螺消化腺 Ａ 值为０．４１３±
０．０５７，头足部Ａ值为０．２９８±０．０４１（图１Ｂ～Ｅ），实验
组Ａ值分别为０．２３３±０．０３７和０．１９７±０．０５９，差异
有统计学意义（ｔ分别为值９．０３６和８．５９４，Ｐ＜０．０５）。
　　
　　Ａ　钉螺Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ反应（４０×）　Ｂ　对照组钉螺头足部Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ强阳性反应（１００×）　Ｃ　实验组钉螺头足部Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ阳
性反应（１００×）　Ｄ　对照组钉螺消化腺Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ强阳性反应（４００×）　Ｅ　实验组钉螺消化腺Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ阳性反应（２００×）　Ｆ　对照
组钉螺神经节ＳＤＨ强阳性反应（２００×）　Ｇ　实验组钉螺神经节ＳＤＨ强阳性反应（２００×）　Ｈ　对照组钉螺肌纤维ＳＤＨ强阳性反应（２００×）　Ｉ　
实验组钉螺肌纤维ＳＤＨ阳性反应（２００×）
图１　钉螺Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ反应（一）
　　Ａ　Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｎａｉｌｓ（４０×）　Ｂ　Ｓｔｒｏｎｇ　Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｎａｉｌｓ＇ｈｅａｄ－ｆｏｏｔ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（１００×）　Ｃ　Ｃａ２＋－ＡＴ－
Ｐａｓｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｎａｉｌｓ＇ｈｅａｄ－ｆｏｏｔ　ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ（１００×）　Ｄ　Ｓｔｒｏｎｇ　Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｎａｉｌｓ＇ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ　ｇｌａｎｄ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（４００
×）　Ｅ　Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｎａｉｌｓ＇ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ　ｇｌａｎｄ　ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ（２００×）　Ｆ　Ｓｔｒｏｎｇ　ＳＤＨ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｎａｉｌｓ＇ｇａｎｇｌｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ
（２００×）　Ｇ　Ｓｔｒｏｎｇ　ＳＤＨ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｎａｉｌｓ＇ｇａｎｇｌｉｏｎ　ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ（２００×）　Ｈ　Ｓｔｒｏｎｇ　ＳＤＨ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｎａｉｌｓ＇ｍｕｓｃｌｅ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（２００
×）　Ｉ　ＳＤＨ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｎａｉｌｓ＇ｍｕｓｃｌｅ　ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ（２００×）
Ｆｉｇ．１　Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｎａｉｌｓ
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中 国 病 原 生 物 学 杂 志
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｇｅｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　
２０１４年１月　第９卷第１期
Ｊａｎｕａｒｙ　２０１４，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．１
２　ＳＤＨ定性及定量分析
对照钉螺中头足部口囊上皮、头足部肌纤维和神
经节ＳＤＨ呈强阳性，其余部位现阳性（图１Ｆ），实验组
钉螺头足部上皮和神经节呈强阳性（图１Ｇ），两组钉螺
头足部肌纤维均阳性，并可见头足部肌纤维断裂（图
１Ｈ，１Ｉ）。经过定量分析，实验组钉螺头足部肌纤维的
Ａ值０．１５２±０．０３８，对照组为０．２２８±０．０４１，差异有
统计学意义（ｔ＝７．１６７，Ｐ＜０．０５）。
３　ＬＤＨ定性及定量分析
对照钉螺及实验钉螺的头足部口囊和神经节处
ＬＤＨ均呈强阳性（图２Ａ，２Ｂ），头足部肌纤维和消化
腺等均呈阳性，实验组可见肌纤维断裂（图２Ｃ，２Ｄ）。
经定量分析，实验组和对照组各部位的灰度值差异均
无统计学意义。
４　ＮＯＳ定性及定量分析
实验组和对照组钉螺的神经中枢、心脏、咽管和生
殖细胞ＮＯＳ均呈强阳性，足部、口囊、鳃叶等（图２Ｅ，
２Ｆ）阳性。实验组足部肌肉纤维断裂、神经节结构松
散。经定量分析，实验组神经中枢、足部和心脏的 Ａ
值分别为０．６１６±０．０６４、０．４３１±０．０４３、０．７１６±
０．０５８，对照组为０．５１４±０．０４９、０．３０２±０．０４２、０．５０３
±０．０４５，差异有统计学意义（ｔ值分别为３．８３３、
６．１２５、８．６０８，Ｐ＜０．０５）（图２Ｇ～２Ｉ）。
讨　论
苦楝叶浸提液具有较好的杀灭钉螺作用，其灭螺
机理尚不清楚。李晨光等［１］研究发现苦楝叶提取物能
影响钉螺软体组织中糖原和蛋白质的含量，但不能解
释苦楝杀螺的作用机制。近年来，多采用酶组织化学
的方法来探索灭螺药物的作用机理［６，７］。本研究采用
酶组织化学技术检测与钉螺氧化磷酸化、能量代谢以
及神经递质等相关的生物酶活性并探讨苦楝灭螺的机
制。
本实验选择的４种酶作用各异。其中ＮＯＳ在生
物体中是合成ＮＯ（神经递质）的限速酶，主要有３种
亚型。Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ能催化细胞膜内侧的 ＡＴＰ水
解，释放能量，驱动细胞内的钙离子泵出细胞，以维持
细胞内外钙离子浓度差。当Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ活性降低
时，会引起细胞内钙离子含量增加，造成细胞不可逆的
损伤。ＳＤＨ是生物体内三羧酸循环的重要限速酶和
线粒体的标志酶，ＳＤＨ活性的高低不仅反映钉螺体内
三羧酸循环状况，还能反映其线粒体的状态。ＬＤＨ主
要分布于细胞质，是糖酵解途径的关键酶。
　　
　　Ａ　对照组钉螺口囊ＬＤＨ强阳性反应（２００×）　Ｂ　对照组钉螺神经节ＬＤＨ强阳性反应（２００×）　Ｃ　对照组钉螺肌纤维ＬＤＨ阳性反应（２００
×）　Ｄ　实验组钉螺肌纤维ＬＤＨ阳性反应（２００×）　Ｅ　钉螺体内 ＮＯＳ反应（４０×）　Ｆ　钉螺体内 ＮＯＳ反应（４０×）　Ｇ　实验组钉螺神经节
ＮＯＳ强阳性反应（２００×）　Ｈ　实验组钉螺足部ＮＯＳ阳性反应（２００×）　Ｉ　实验组钉螺心脏ＮＯＳ强阳性反应（２００×）
图２　钉螺Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ反应（二）
　　Ａ　Ｓｔｒｏｎｇ　ＬＤＨ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｎａｉｌｓ＇ｍｏｕｔｈ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（２００×）　Ｂ　Ｓｔｒｏｎｇ　ＬＤＨ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｎａｉｌｓ＇ｇａｎｇｌｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（２００×）　Ｃ　
ＬＤＨ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｎａｉｌｓ＇ｍｕｓｃｌｅ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（２００×）　Ｄ　ＬＤＨ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｎａｉｌｓ＇ｍｕｓｃｌｅ　ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ（２００×）　Ｅ　ＮＯＳ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｏｆ
ｓｎａｉｌｓ（４０×）　Ｆ　ＮＯＳ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｎａｉｌｓ（４０×）　Ｇ　Ｓｔｒｏｎｇ　ＮＯＳ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｎａｉｌｓ＇ｇａｎｇｌｉｏｎ　ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ（２００×）　Ｈ　ＮＯＳ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｎ
ｓｎａｉｌｓ＇ｆｏｏｔ　ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ（２００×）　Ｉ　Ｓｔｒｏｎｇ　ＮＯＳ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｎａｉｌｓ＇ｈｅａｒｔ　ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ（２００×）
Ｆｉｇ．２　Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｎａｉｌｓ
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中 国 病 原 生 物 学 杂 志
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｇｅｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　
２０１４年１月　第９卷第１期
Ｊａｎｕａｒｙ　２０１４，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．１
　　本研究结果显示，经苦楝叶浸提液处理的钉螺体
内各部位ＬＤＨ 的灰度值差异无统计学意义，表明钉
螺ＬＤＨ的活性不受苦楝叶活性物质的影响。苦楝叶
的杀螺作用与其无关。
检测发现 ＮＯＳ主要分布于钉螺头足部口囊、神
经节、咽管、鳃叶上皮、心脏和生殖细胞等处，与梁幼生
等［５］研究结果一致。实验组钉螺神经中枢、足部和心
脏等部位的ＮＯＳ活性显著增高，引起钉螺该部位ＮＯ
的合成加剧。机体在合成 ＮＯ过程中，造成细胞内钙
离子浓度增加，形成钙超载，进而破坏呼吸链，大量消
耗ＡＴＰ并损伤ＤＮＡ［８］；细胞内钙离子超载还会激活
促细胞凋亡的关键酶［９］。提示若钉螺体内ＮＯ生成过
多会使其细胞内钙离子含量增高，最终使得细胞发生
程序性死亡。
细胞内钙离子含量是由钙泵，暨Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ调
节控制的。因此，观察钉螺这些部位Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ的
活性就能推测其是否会出现钙超载。检测结果显示实
验组钉螺消化腺和头足部Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ灰度值与对
照组比较差异有统计学意义，说明该部位钙离子含量
显著提高，造成钙超载。这两个部位钙超载将会引起
其中细胞呼吸和氧化磷酸化的降低，使 ＡＴＰ生成减
少，引起钉螺细胞供能不足，导致钉螺生理功能受损。
ＮＯ影响细胞内钙离子含量，是从破坏细胞有氧
呼吸开始的。研究表明，机体内过多的 ＮＯ可以抑制
ＳＤＨ的活性和含量，降低了线粒体的能量代谢［１０］。
本研究发现钉螺体内ＳＤＨ 广泛分布，与覃苹等［１１］的
研究结果一致。而经苦楝叶浸提液处理的钉螺头足部
肌纤维ＳＤＨ 活性显著降低，说明该部位氧化磷酸化
受抑制，其线粒体活性降低，这是足部 ＮＯＳ活性增高
导致的结果。
因此推测，苦楝叶浸提液处理钉螺后，造成其头足
部ＮＯＳ活性增加，产生过量 ＮＯ，继而破坏钉螺肌细
胞线粒体内的氧化磷酸化，减少能量的生成。ＡＴＰ浓
度的降低减弱Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ的活性，使得钉螺肌细胞
内钙离子浓度上升，钙超载后引起肌细胞不可逆损伤，
最终杀死钉螺。
【参考文献】
［１］　李晨光，陈钧，韩邦兴，等．苦楝叶杀螺效果及机制初步研究
［Ｊ］．中国媒介生物学及控制杂志，２０１１，２２（４）：３４１－３．
［２］　李修金，严志春，胡建国．苦楝树叶杀灭钉螺效果观察［Ｊ］．中国
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２０１３－１１－０６
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【收稿日期】　２０１３－０８－１４　【修回日期】　２０１３－１１－０６
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中 国 病 原 生 物 学 杂 志
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｇｅｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　
２０１４年１月　第９卷第１期
Ｊａｎｕａｒｙ　２０１４，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．１