全 文 ：第 29卷 第 2期
2010 年　4 月
华　中　农　业　大　学　学　报
Journal of Huazhong Ag ricultural Univ ersity
Vo l.29　No.2
Apr.2010 , 169～ 174
收稿日期:2009-03-02;修回日期:2009-11-12
＊国家“ 973”计划课题(2010CB126502)和华中农业大学人才启动基金(2005XRC026)资助
＊＊通讯作者.E-mai l:liy ou guo2001@yahoo.com.cn
吴　梅 ,女 , 1984 年生 ,硕士研究生.研究方向:根瘤菌共生固氮体系分子机理.E-mail:w umei.nono@y ahoo.com.cn
参与紫云英共生固氮的 个上调表达结瘤素
基因 的分离与鉴定
吴　梅　丑敏霞　李一星　陈大松　李友国＊＊
华中农业大学农业微生物学国家重点实验室 ,武汉 430070
摘要　基于接种华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)7653R的紫云英(Astragalus sinicus L.)感染
根与未接种对照根在转录水平上的差异 ,利用抑制差减杂交技术(suppre ssion subtractive hybridiza tion , SS H),
建立了紫云英结瘤固氮过程中的差异表达 cDNA 文库 , 共获得 527 个有效克隆 , 其中增强或特异性表达的上调
文库中包含 341 个克隆 ,抑制表达的下调文库包含 186 个克隆。对其中的 1 个上调表达 cDNA 克隆 AsB6 利用
RACE(rapid amplification of cDNA ends)方法获得了其基因全长序列 ,利用 BLAST 在线软件和 GenBank , Gen-
Bank EST 和 T ig r Por cine EST 等数据库进行同源序列比较 , 表明 AsB6 与苜蓿的 β-酮酯酰合成酶及依赖于
S AM (S-adeno sglme thiomine , S-腺苷蛋氨酸)的羧甲基转移酶具有 66%的同源性 ,同时利用实时荧光定量 PCR
研究了该基因的时空表达特征。结果显示 ,接种根瘤菌 7653R后 , 在紫云英感染根和根瘤中该基因的表达量显
著增强 ,且在接种后根瘤形成早期和固氮中晚期表达量相对较高。推测其可能与根瘤菌前期感染和根瘤形成 、
根瘤代谢功能有关。
关键词　抑制差减杂交;紫云英;上调基因;β-酮酯酰合成酶;共生固氮
中图分类号　S 154.38+1　　文献标识码　A　　文章编号　1000-2421(2010)02-0169-06
　　紫云英(Astragalus sinicus)是生长于中国 、韩
国和日本的一种豆科绿肥 ,多种植于稻田中 ,用于提
高土壤肥力。华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium
huakuii)可以和紫云英共生固氮 ,互作形成不定型
根瘤 。它和紫云英的共生体系是中国特有的优势共
生固氮资源。华癸中慢生根瘤菌具有很强的宿主
专一性 ,决定了它和紫云英的共生体系是研究根
瘤菌与宿主植物共生固氮机理的好材料 ,尤其是
在研究根瘤菌和宿主植物之间共生固氮信号的传
导和相互作用方面 , 该体系具有重大的研究价
值[ 1-4] 。
但是目前对于紫云英参与共生固氮的功能基因
研究报道较少。共生固氮包括早期和晚期 2 个过
程 ,大量的根瘤菌和植物双方基因参与其中。早期
共生基因调控根瘤菌侵染 、侵入线形成以及根瘤形
成等过程 ,晚期共生基因调控着类菌体的分化 、根瘤
固氮及衰老 ,从而调控共生固氮的全局过程。然而
目前大部分研究都集中在共生早期双方的分子对话
方面[ 5-6] ,晚期的研究相对较少 ,人们对于共生固氮
晚期分子机理的认识还远远不够。
本研究利用 SSH 技术比较了紫云英感染根和
未接种对照根的基因转录情况 ,建立了其感染根及
未接种对照根的差异表达 cDNA 文库 ,以期对紫云
英参与共生结瘤固氮过程中的功能基因进行系统的
鉴定 ,从而分离获得新的结瘤固氮相关宿主功能基
因和更多有用的分子探针 。在前期研究中 ,作者所
在实验室报道了紫云英 13 个根瘤特异性或增强表
达的基因[ 7-8] 。这些基因所编码的多肽主要包括
Usp 家族(univ ersal st ress pro tein family , Usp)类
似物 、半胱氨酸蛋白家族(cysteine cluster pro teins ,
CCP)同源物和脂类转运蛋白家族(lipid t ransfer
pro tein , LTP)类似物。
本文则报道另外1 个在紫云英共生固氮过程
中的上调表达基因 AsB 6 的克隆鉴定及其表达特
征 ,并结合序列查询及结构域分析讨论了它的功
能 。
　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第 29 卷　
　材料与方法
　材　料
将紫云英种子浸入 95%的乙醇 5 min , 再以
5%N aClO 表面消毒 5 m in ,无菌水洗涤 6 ～ 8 次 ,黑
暗中于室温下发芽 2 d。将发芽的种子无菌条件下
浅播于灭菌砂钵中 ,浇灌 Fahraeus 无氮营养液[ 9] ,
按照 16 h 光照/8 h 暗期于 18 ～ 22 ℃培养 6 d 后 ,
接种华癸中慢生根瘤菌(M.huakui i)7653R。
　总 提取
用 Trizo l 试剂(Invit rog en , CA , USA)提取 ,具
体操作按说明书进行 。分别提取紫云英接种根瘤菌
7653R后 21 ～ 26 d 的感染根 、根瘤及相应苗龄未接
种对照根的 RNA ,进行 SSH 分析。提取紫云英接
种后 6 、9 、12 、15 、18 、21 、25 、30 d 的感染根 ,紫云英
接种后 26 d 的去瘤根 、根瘤 、叶子 、茎 ,相应苗龄未
接种根的 RNA ,进行实时荧光定量 PCR分析。
　 合成
利用 ClonTech SMART PCR cDNA Synthesis
ki t(ClonTech ,CA , USA)进行 cDNA 的合成与扩
增 ,操作按试剂盒说明书进行 ,略作如下改动:取
1μg纯化后的总 RNA ,加入 cDNA 合成(CDS)引物
及 SMART Ⅱ寡聚核苷酸 , 42 ℃温育 1 h ,合成第 1
链 cDNA 。随后 ,向 10 μL 第 1 链反应体系中加入
40μL Tricine-EDTA 缓冲液 ,72 ℃温育 7 m in。取
1μL 上述稀释后的单链 cDNA 为模板进行长距离
(LD)PCR。反应体系为 100 μL。反应程序为:
95 ℃15 s , 65 ℃ 30 s ,68 ℃6 min ,共 17 个循环 。
于 PTC-100TM Peltier The rmal Cycle r (MJ Re-
searchTM Inc ,Massachuset ts , USA)上进行扩增。
　 和差减 文库构建
利用 ClonTech PCR-Select cDNA Subtraction
ki t 进行文库的构建。简言之 ,获取总 RNA 之后 ,
以链霉素亲和磁珠法分离 poly(A)RNA (PolyA T-
t ract? mRNA Iso lation Sy stema Ⅲ , Promega ,
USA),分别以 2 μg 紫云英接种后 21 ～ 26 d 的根及
相应苗龄未接种根中的 po ly(A)RNA 为模板合成
cDNA ,随后用限制性内切酶 R saⅠ 酶切消化 。酶
切后的 cDNA 片段作为 Tester 和 Driver 进行正向
和反向杂交。正向杂交中 ,以来自接种根的 cDNA
片段为 Tester 进行目的基因的筛选 ,反向杂交中 ,
则以来自未接种根的 cDNA 片段为 Tester ,去除那
些非特异性表达的基因 。Tester cDNA 两端分别
连接 2 个不同的接头 ,该接头含有与 PCR 引物配对
的序列及克隆位点 , Driver cDNA 不加接头。将
Tester cDNA 分为 2 份 ,变性 , 分别与变性后的
Driver cDNA 差减杂交。紧接着进行第 2 次杂交 ,
亦即差减后的 2 份 Tester cDNA 之间的杂交 。最
后 ,扩增 Tester cDNA 中特异表达的 cDNA 片段 ,
并克隆到 pGEM ? -T 载体(Promega)上。
　目标基因测序及 获取基因全长
将上调表达 cDNA 克隆 AsB 6 插入片段送交
Invit rog en 公司测序。将测序结果利用 BLAS T 在
线软件与 GenBank ,GenBank EST 和 Tigr Po rcine
ES T 等数据库进行同源序列比较。利用 3′-Full
RACE Co re Se t Ve r.2.0 、 5′-Full RACE Kit
(T aKaRa)和基因特异性引物(GSP)扩增目的基因
的 5′及 3′-cDNA 末端;全长 cDNA 的克隆通过 5′
及 3′-RACE 产物重叠部分的拼接获得 。全长 cD-
NA 随后与 pGEM-T 载体(Promega)相连。5′-cD-
NA 末端扩增引物为 GSP 1:5′-CAA TACCATCA-
CACCACCCTCCACAAG T-3′和 GSP 2:5′-TC-
CCTTGT TTAG TGG TTCTGCTTCT-3′;3′-cDNA
末端扩增引物为 GSP 1:5′-GGT TGCTCT TCAG-
GACCAAATGCT-3′ 和 GSP 2:5′-CAAG T-
TACTCCCTGA TT TCCACC-3′。
　序列分析和统计分析
目的基因的氨基酸序列推测利用 BioEdi t 软件
进行[ 1 0] 。同源搜索利用 Blast 程序(ht tp://www .
ncbi.nlm.nih.gov/)进行 ,理论上的等电点(pI)和
分子质量通过 Compute pI/MW 软件预测(ht tp://
ca.expasy.org/ tools/)。通 过 对 InterPro-Scan
(ht tp://www.ebi.ac.uk/)、Pfam (ht tp://www .
sanger.ac.uk/Sof tw are/)和 PROSITE (ht tp://
www .predictpro tein.org/)数据库的查询 ,证实氨
基酸保守结构域 。SignalP 3.0 Server 软件预测信
号肽的存在及其可能的切割位点(ht tp://www .
cbs.dtu.dk/ se rvices/)。 二 级 结 构 分 析 通 过
PSIPREDView 程序[ 11] 进行 。
　实时荧光定量 分析
利用 SYBR? Green Realtime PCR Master M ix
(TO YOBO)进行实时荧光定量 PCR。利用 olig o-
dT 为引物反转录得到 cDNA , 18S rRNA 基因
(GenBank AF3595597)作为内参 ,在 Bio-Rad M ini
Opt icon 荧光定量 PCR 仪上进行荧光定量 PCR反
应。每个反应重复 3 次。具体操作程序为:95 ℃预
170
　第 2 期 吴　梅 等:参与紫云英共生固氮的 1 个上调表达结瘤素基因 AsB6 的分离与鉴定 　
变性 30 s ,接着做 40个循环 ,95 ℃变性 5 s ,60 ℃退
火20 s , 72 ℃延伸 20 s。 PCR 反应引物为:5′-
GAAAAGTCAATACCATCACACCACC -3′和5′-AG-
GACCAAATGCTCTTATGCCTATC -3′。
　结果与分析
　 的制备和质量检测
制备高质量的 mRNA 是保证获得 cDNA 高产
量的前提。从接种了根瘤菌 7653R 的紫云英感染
根和未接种对照根中分别提取了 mRNA ,紫外分光
检测结果显示 ,其质量浓度分别为 0.287 和0.350
μg/μL;纯度 D260 nm/D 280 nm分别为 1.98 和 1.92。在
2%琼脂糖凝胶电泳中还可看出 ,28S rRNA 条带的
亮度约为 18S rRNA 条带的 1.5 ～ 2 倍(图 1)。以
上数据和结果表明本研究的有关制备程序可保障获
得高质量的 mRNA 样品 ,其质量完全可满足进行
差减杂交的技术要求 。
图 1　紫云英感染根组织总 RNA 电泳检测
Fig.1　Total RNA isolated from infected
roots of Astragalus sinicus L.
　差减文库的构建和 序列分析
利用抑制差减杂交技术 ,建立了紫云英结瘤固
氮过程中的差异表达 cDNA 文库 ,共获得 527 个有
效克隆 ,其中增强或特异性表达的上调文库中包含
341 个克隆 ,抑制表达的下调文库中包含 186 个克
隆。利用斑点杂交技术 , 对于上调表达文库中的
341 阳性克隆进行了再次确证筛选。与未接种根相
比 ,选择那些在接种根中的表达强度明显提高(至少
3倍)的克隆进行测序与生物信息分析 ,结果得到了
57 个不同的 cDNA 克隆(另文发表)。57 个 cDNA
克隆的测序结果表明 ,17 个片段与豆血红蛋白基因
(Lb)有着很高的同源性;3 个片段分别编码紫云英
天冬酰胺合成酶基因 AsAS1 、AsAS 2;7 个片段分别
与早期结瘤素基因 ENOD2 、晚期结瘤素基因 nodu-
lin-26 以及来自田菁(Sesbania rostrata)的磷酸烯
醇式丙酮酸羧化酶基因 、羽扇豆(Lup inus luteus)的
二磷酸核苷酸磷酸酶 1 基因 、推测的辣椒(Capsi-
cum annuum)半胱氨酸蛋白酶基因 、拟南芥(Arabi-
dopsis thaliana)的 RNA 螺旋酶以及苜蓿(Medica-
go truncatula)的一个 BAC 克隆 mth2-10i23 表现出
或多或少的相似性;另外 ,有 30 个片段没有找到同
源基因。
　 差减文库消减效率的检测
用看家基因泛素(ubiquitin)半定量 PCR 做消减
效率 的 分 析。 引 物 序 列 为:上 游 5′-ATG-
CAGATCTTTTGTGAAGAC-3′, 下 游 5′-ACCAC-
CACGGAAGACGGAG-3′;反应程序:94 ℃ 4 min ,
94 ℃30 s , 56 ℃30 s ,72 ℃30 s ,循环数为 18 ～ 33
个。吸取 5μL PCR 产物进行电泳鉴定。与未消减
组 PCR 产物相比 ,消减组 PCR 产物中泛素基因产
物大大减少 ,扩增滞后于消减前约 5 ～ 10 个循环 ,
说明所构建的消减文库具有很高的消减效率(结果
未显示)。
　目的基因的克隆和序列分析
针对增强或特异性表达的上调文库中的 341 个
克隆 ,通过半定量 RT-PCR 方法 ,证实获得了 1 个
在感染根(瘤)中显著增强表达的 cDNA 克隆 。利
用 5′-及 3′-RACE方法 , 获得了其基因全长 cDNA
序列 , 命名为 AsB6 。其 GenBank ID 登录号为
FJ784756。AsB6 基因克隆原始插入片段大小为
644 bp , 通过 RACE 获得其 cDNA 全长为 1 250
bp 。依据其开放阅读框推定的基因转录翻译产物
(图 2)可以看出 ,基因 AsB 6 编码的蛋白含有 266
个氨基酸。进一步的预测显示其分子质量为 30
ku ,等电点(pI)为 5.11。BlastP 同源搜索表明 ,
AsB 6与苜蓿的 β-酮酯酰合成酶及依赖于 SAM 的
羧甲基转移酶具有同源性 ,相似度 66%, E 值为 4e-
112。 InterPro-Scan 分析表明 AsB6 确实具有 β 酮
合成酶及依赖于 SAM 的羧甲基转移酶 2 个功能结
构域 。
　基因 的时空表达特征分析
为了定量分析目标基因的表达水平和特征 ,从
一套与 SSH 同样生长条件下栽培紫云英的接种根
瘤菌感染根和未接种对照根中分别提取总 RNA ,在
完成基因组 DNA 的去除与纯度检测后 ,进行荧光
定量 PCR分析。 AsB 6 在植物不同生长时期 、不同
器官中 mRNA 的相对积累动态如图 3 所示。由图
3-a 可见 , AsB6 在接种根瘤菌后 6 d 表达有 1 个高
峰 ,随后几乎不表达 ,到接种根瘤菌后 21 d 又开始
表达 。由图 3-b 可见 ,在接种根瘤菌的紫云英叶片
171
　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第 29 卷　
及茎中 AsB6 不表达 ,在根瘤中的表达量大约为未
接种对照根中的 2 倍 ,而在去瘤根中的表达量则非
常高 , 为未接种对照根中的 55 倍 , 但都比 18S
rRNA 基因表达量低。可以看出 ,在紫云英的共生
固氮中晚期 , AsB6 表达量逐步增强 ,推测其在共生
固氮过程中具有重要的维持作用。
图 2　AsB6 开放阅读框的转录翻译产物
Fig.2　Deduced translation product of opening read frame for AsB6
a:AsB 6 在紫云英结瘤不同时期的表达 Gene expression pattern in a tim e-course during nodulation;
b:AsB6 在不同组织器官中的表达 AsB 6 gene ex pres sion pat tern in spat ial t is sues o r organs;
　用于荧光定量 PCR 的总 RNA 来自接种根瘤菌后 6 、9 、12 、15 、18 、21 、25 、30 d 的感染根 The total RNA w as isolated respect ively
f rom infected root s at 6 , 9 , 12 , 15 , 18 , 21 , 25 d and 30 d;N:接种后 26 d 的根瘤 Nodu les at 26 d;R:32 d 的未接种对照根 32-day-old
u ninfected root s;Q:接种后 26 d 去掉根瘤的根 Infected root s at 2 6 d w ith n odu les removed;L:接种后 26d 的叶 Infected leaves at 2 6
d;S:接种后 26 d 的茎 Infected stems at 2 6 d;18S rRNA 为内参(P<0.05)T he 18S rRNA w as used as a cons titut ive cont rol(P<
0.05).
图 3　AsB6 基因在紫云英结瘤不同时期(a)及不同组织器官中的时空表达测定(b)
Fig.3　Quantitative fluorescence real-time RT-PCR analysis of mRNA accumulation for AsB6
172
　第 2 期 吴　梅 等:参与紫云英共生固氮的 1 个上调表达结瘤素基因 AsB6 的分离与鉴定 　
　讨　论
SSH 是抑制 PCR 与差减杂交技术相结合的更
为简单而快速分离差异基因的方法。本研究采用
SSH 方法成功构建了 2 个感染根和未接种根差异
表达 cDNA 基因文库 ,获得紫云英共生固氮过程中
在感染根(瘤)中增强或特异性表达的 341 个有效
cDNA 克隆 ,抑制表达的 186 个有效 cDN A 克隆 。
对其中的 1 个 AsB6 克隆进行深入研究 , RACE 获
得其基因全长 1 250 bp , BlastP 同源搜索表明 ,
AsB 6 与苜蓿 β酮酯酰合成酶及依赖于 SAM 的羧
甲基转移酶具有同源性 ,相似度 66%。对于根瘤特
异性和增强表达的宿主植物共生固氮基因研究 ,目
前主要集中在 2 种模式植物苜蓿(M.t runcatula)和
百脉根(Lotus japonicus)中[ 12-14] 。目前还没有检索
到关于该基因的研究报道 ,本研究发现了在紫云英
共生固氮过程中该基因的增强表达 。
该基因在接种早期和固氮晚期大量表达 ,接种
根瘤菌与未接种对照组的表达差异更是显著 ,同时
发现该基因在去瘤根 Q 中的表达量最高 ,而在根瘤
N 中的表达量并不高 ,这种表达特征不同于一般报
道的根瘤特异或增强表达的结瘤素基因 ,可以认为
是一种“结瘤调控”(nodulat ion-regulated)型的宿主
植物基因 ,并且其具有一定的组织特异性 ,因为该基
因在植物其它组织器官(如叶 ,茎)中并不表达 。该
基因在根瘤形成后开始固氮的中晚期其表达水平逐
步上升 ,推测其可能与维持根瘤的正常结构和发育 、
信号传导和代谢有关 。文献报道 β-酮酯酰合成酶可
以调节脂肪酸的链长[ 15] ,脂肪酸参与信号转导 ,同
时脂肪酸类物质也是细胞膜的重要组成部分 。在紫
云英与根瘤菌建立共生固氮体系的过程中 ,紫云英
根部细胞的细胞膜成分会发生改变[ 16-17] ,这或许是
AsB 6 在早期表达水平上调的一个原因 , AsB 6 早期
表达水平较高 ,表明其参与根瘤菌的前期感染和根
瘤形成 ,此阶段是共生双方信号分子识别和对话的
关键时期;另据文献报道 ,水杨酸的过量累积会影响
蚕豆的正常生长[ 18] ,由于水杨酸的这种毒性 ,植物
会将水杨酸转化为各种衍生物 ,如葡萄糖苷水杨酸 ,
水杨酸甲酯[ 19-20] 等 ,以降低水杨酸的含量。其中水
杨酸羧甲基转移酶就是该转化过程中重要的某一中
间步骤的催化酶[ 21] 。推测 AsB 6 在接种根瘤菌的
紫云英根部大量表达与抵抗水杨酸的毒害作用也有
很大关系 。AsB6 在紫云英共生固氮过程中的生理
作用和分子机制还有待进一步研究 ,如可以采用基
因沉默 、超表达 、转化技术和原位杂交等途径 。
参 考 文 献
[ 1] 　程国军 ,陈大松 ,李友国 ,等.华癸中生根瘤菌共生基因 exo56
的克隆和功能初步分析[ J] .华中农业大学学报 , 2008 , 27(4):
483-486.
[ 2] 　胡国元 ,周俊初.华癸中生根瘤菌研究进展[ J] .华中农业大学
学报 , 2006 , 25(6):213-218.
[ 3] 　缪礼鸿 ,周俊初.根瘤菌质粒的研究进展[ J] .华中农业大学学
报 , 2007 , 26(3):428-434.
[ 4] 　张学贤 ,李阜棣 ,曹燕珍.紫云英根瘤菌分子遗传学研究进展
[ J] .华中农业大学学报 , 2003 , 22(1):77-86.
[ 5] 　ST RACKE S , KIST NER C , YOSHIDA S , et al.A plant recep-
t or-like kinase requi red for both b acterial and fun gal symbiosis
[ J] .Natu re , 2002 , 417:959-962.
[ 6] 　GHERBI H , MARKMANN K , SVISTOONOFF S , et al.SymRK
def ines a common genet ic basis for plant root endosymbioses wi th
arbuscular mycorrhiza fungi , rhiz obia , and F rankia bacteria [ J] .
PNAS , 2008 , 105:4928-4932.
[ 7] 　CHOU M X ,WEI X Y ,CHEN D S , et al.Thirteen nodule-spe-
ci fic or nodule-enh anced genes encoding products h omologous
to cysteine cluster proteins or plant lipid t ransfer proteins are i-
denti fied in Astrag alus sinicus L.by su ppressive subt ractive
hybridization[ J] .J Exp Bot , 2006 , 57:2673-2685.
[ 8] 　CHOU M X , WEI X Y , CHEN D S , et al.A novel nodule-en-
hanced gene encoding a putative universal st ress protein f rom
Astrag alus sinicus[ J] .J Plan t Physiol , 2007 , 164:764-772.
[ 9] 　FAHRAEUS G.The infect ion of w hi te clover root hairs by
nodu le bacteria s tudied by a simple slide technique[ J] .Gen Mi-
crobiol , 1957 , 16:374-381.
[ 10] HA LL T A.BioEdit:A u ser-f rien dly biological sequence align-
ment editor an d an aly si s p rog ram for Window s 95/ 98/NT [ J] .
Nucleic Acids Res Sym Ser , 1999 , 41:95-98.
[ 11] MCGUFFIN L J , BRYSON K , JONES D T.The PSIPRED
protein st ructure prediction server[ J] .Bioinformatics , 2000 ,
16:404-405.
[ 12] BENEDITO V A , TORRES-JEREZ I , MURRAY J D , et al.A
gene expression atlas of the model legume Medicago truncatu-
la[ J] .Plant J , 2008 , 55:504-513.
[ 13] RADUTOIU S , MADSEN L H , MADSEN E B , et al.LysM
domains mediate lipochitin oligosaccharide recognit ion and N f r
genes exten d the symbiotic host range[ J] .T he EMBO J , 2007 ,
26:3923-3935.
[ 14] 朱浩 ,朱辉 ,杨绮 , 等.百脉根 AD-cDNA 文库的构建及与结瘤
因子受体 NFR1 相互作用蛋白的鉴定[ J] .华中农业大学学报 ,
2007 , 26(6):794-799.
[ 15] LEONARD J M , KNAPP S J , SLABAUGH M B.A Cuphea
b eta-ketoacy l-ACP synthase shif t s the synthesis of fat ty acids
173
　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第 29 卷　
tow ards sh orter chains in Arabidop sis seed s exp ressing Cu-
phea FatB thioesterases[ J] .Th e Plant Jou rnal , 1998 , 13(5):
621-628.
[ 16] BREWIN N J.Development of th e legum e root nodule[ J] .An-
nu al Review of Cell Biology , 1991 , 7:191-226.
[ 17] HIRSCH A M.Developmen tal biology of legume nodulat ion
[ J] .New Ph ytologi st ,1992 , 122:211-237.
[ 18] MANT HE B, SCHU LZ M , SCHNABL H.Ef fect s of salicy lic
acid on g row th an d stomatal movements of Vicia f aba L.:evi-
dence for salicylic acid metaboliz at ion[ J] .J Chem Ecol , 1992 ,
18:1525-1539.
[ 19] PRIDHAM J B.Low molecular w eight phenols in higher plants
[ J] .Annu Rev Plant Phy siol , 1965 , 6:13-36.
[ 20] PIERPOIN T W S.S alicylic acid and i ts derivatives in plants:
m edicines , m etabolit es and mess enger molecules [ J] .Adv Bot
Res , 1994 , 20:163-235.
[ 21] FUKAMI H , ASAK URA T , HIRANO H , et al.Salicy lic acid
carb oxyl methylt ransferase induced in hairy root cul tu res of
Atrop a bel la donna af ter t reatment wi th exogeneou sly added
salicylic acid [ J] .Plan t Cell Ph ysiol , 2002 , 43(9):1054-1058.
Isolation and Identification of an Up-Regulated Nodulin Gene AsB6
Involved in Symbiotic Nitrogen Fixation of Astragalus sinicus L.
WU Mei　CHOU M in-xia　LI Yi-xing　CHEN Da-song　LI You-guo
S tate Key Laboratory of A gricul tural Microbiology , Huazhong
Agricultural Univ ersity ,Wuhan 430070 , China
Abstract　A cDNA library of Astragalus sinicus L.genes speci fically expressed in infected ro ots by
Mesorhizobium huakuii 7653R was generated by using a PCR-based suppressive subtractive hybridization
(SSH)technique w ith tw o mRNA populat ions of infected and uninfected ro ots.A total number of ap-
proximately 527 SSH cDNA clones w ere obtained , including 341 up-regulated gene clones and 186 down-
regulated gene clones.T he full-leng th cDNA sequence o f up-regulated AsB6 gene w as obtained by RACE
and analy zed through Blasting ,GenBank ,GenBank ES T and Tige r Po rcine EST .AsB 6 gene show ed 66%
similarity w i th a-etoacy l-ketoacyl synthase and SAM dependent carboxyl methy lt ransferase in Medicago
truncatula.T he temporal and spatial expression pat tern of AsB6 w as estimated using quant itat ive fluo-
re scence real-time RT-PCR analy sis.It w as found that i t s expression level , induced by M.huakui i
7653R , in infected roo ts and nodule w as significantly enhanced , and i t reached the peak level during the
early period of nodulation.The results suggested the symbio tic function o f AsB6 gene might invo lved in
the rhizobium infection ,nodulat ion and maintenance of nodule metabolism .
Key words　suppression subtractive hybridization;Astragalus sinicus;up-regulated gene;beta-ke-
to acyl synthase;symbiot ic nit rogen f ixa tion
(责任编辑:张志钰)
174