全 文 ：　
２０１３，２９ （８）
中国人兽共患病学报
Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｚｏｏｎｏｓｅｓ
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｃｊｚ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－２６９４．２０１３．０８．００８
苦楝叶对钉螺细胞凋亡和一氧化氮合酶的影响
张　仪１，吴　缨１，顾文彪１，刘和香１，朱　丹１，吕　山１，夏尚光２，王龙杰１
摘　要：目的　检测经苦楝叶浸提液浸泡处理后，钉螺体内细胞凋亡和一氧化氮合酶（Ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＮＯＳ）的变
化，探讨苦楝灭螺的机制。方法　经苦楝叶浸提液处理的钉螺和对照钉螺去壳后连续冰冻切片，使用原位末端标记法（ＴｄＴ－
ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｄＵＴＰ－ｂｉｏｔｉｎ　ｎｉｃｋ　ｅｎｄ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ａｓｓａｙ，ＴＵＮＥＬ）和ＮＡＤＰＨ－ｄ组织化学染色方法分别检测其细胞凋亡和一氧化氮合
酶。结果　１．实验组钉螺细胞凋亡发生在消化腺、足部表皮和足部肌肉纤维间等部位，而对照组发生在消化腺和足部表皮部
位；２．实验组细胞与对照组凋亡值具统计学意义（Ｐ＜０．０５）；３．实验组神经中枢、足部神经节和心脏的 ＮＯＳ平均灰度值对照
组有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。结论　苦楝叶浸提液会影响钉螺ＮＯＳ的活性，并诱导其足部肌肉纤维间发生细胞凋亡。
关键词：钉螺；苦楝；细胞凋亡；一氧化氮合酶
　　中图分类号：Ｒ３８３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－２６９４（２０１３）０８－０７７１－０４
Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｌｅａｖｅｓ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　Ｍｅｌｉａ　ａｚｅｄａｒａｃｈ　ｏｎ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ
ａｎｄ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｏｆ　Ｏｎｃｏｍｅｌａｎｉａ　ｈｕｐｅｎｓｉｓ
ＺＨＡＮＧ　Ｙｉ　１，ＷＵ　Ｙｉｎｇ１，ＧＵ　Ｗｅｎ－ｂｉａｏ１，ＬＩＵ　Ｈｅ－ｘｉａｎｇ１，
ＺＨＵ　Ｄａｎ１，ＬＶ　Ｓｈａｎ１，ＸＩＡ　Ｓｈａｎｇ－ｇｕａｎｇ２，ＷＡＮＧ　Ｌｏｎｇ－ｊｉｅ１
（１．Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｐａｒａｓｉｔｉｃ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ
／Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｐａｒａｓｉｔｅ　ａｎｄ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ／ＷＨＯ　Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ
Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｍａｌａｒｉａ，Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｉａｓｉｓ　ａｎｄ　Ｆｉｌａｒｉａｓｉｓ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０００２５，Ｃｈｉｎａ；
２．Ａｎｈｕｉ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｈｅｆｅｉ　２３００３１，Ｃｈｉｎａ）
国家“十二五”国家科技计划项目（２０１１ＢＡＤ３８Ｂ０７０１０１）资助，国家
科技重大专项（Ｎｏ．２０１２ＺＸ１０００４２２０，２００８ＺＸ１０００４－０１１）资助
作者单位：１．中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、世界卫生
组织疟疾、血吸虫病和丝虫病合作中心，卫生部寄生虫
病重点实验室，上海　２０００２５；Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇ１９７２００３＠
ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
２．安徽省林业科学研究院，合肥　２３００３１
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｐｌａｎｔ－ｓｏｕｒｃｅ　ｍｏｌｕｓｃｉｃｉｄｅ　ｈａｓ　ｓｈｏｗｎ　ｇｏｏｄ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ　ａｎｄ　ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｒｅｃｅｎｔｌｙ，ｉｔ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｔｈａｔ　Ｍｅｌｉａ
ａｚｅｄａｒａｃｈｌｅａｖｅｓ　ｃｏｕｌｄ　ｋｉｌ　Ｏｎｃｏｍｅｌａｎｉａ　ｈｕｐｅｎｓｉｓ．Ｔｈｉｓ　ｐｒｏｊｅｃｔ　ｗａｓ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｌｅａｖｅｓ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　Ｍｅｌｉａ　ａ－
ｚｅｄａｒａｃｈ　ｏｎ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＮＯＳ）ｏｆ　Ｏｎｃｏｍｅｌａｎｉａ　ｈｕｐｅｎｓｉｓ　ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｉｔｓ　ｍｏｌｕｓｃｉｃｉｄａｌ　ｍｅｃｈａ－
ｎｉｓｍ．Ｔｈｅ　ｓｎａｉｌｓ　ｗｅｒｅ　ｉｍｍｅｒｓｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｌｅａｆ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　Ｍｅｌｉａ　ａｚｅｄａｒａｃ　ｆｏｒ　２４ｈｏｕｒｓ，ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｂｏｔｈ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ
ｓｎａｉｌｓ’ｓｏｆｔ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｆｏｒ　ｆｒｏｚｅｎ　ｓｅｃｔｉｏｎ（６μｍ）．Ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｓｎａｉｌｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｂｙ　ＴＵＮＥＬ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙ－
ｍａｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ＮＯＳ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＮＡＤＰＨ－Ｄ　ｅｒｔｚｙｍｅ－ｈｉｓｔｏｅｈｅｍｉｅａｌ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｎａｉｌ　ｔｉｓｓｕｅｓ
ａｓ　ｗｅｌ　ａｓ　ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｇｒａｙ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｗｉｔｈ　ｉｍａｇｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　ｂｉｏｍｉｅｒｏｓｃｏｐｙ．Ｔｈｅ　ＴＵＮＥＬ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅｒｅ
ｗａｓ　ａ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ｏｆ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｓｉｇｎａｌ　ｉｎ　ｂｏｔｈ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐｓ．Ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｃｅｌｓ　ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｓｎａｉｌｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ
ｉｎ　ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ　ｇｌａｎｄ，ｆｏｏｔ　ｓｋｉｎ　ａｎｄ　ｆｏｏｔ　ｍｕｓｃｌｅ，ａｎｄ　ｉｔ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ　ｇｌａｎｄ，ｆｏｏｔ　ｓｋｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ　ａｐｏｐ－
ｔｏｓｉｓ　ｉｎｄｅｘ　ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐ＜０．０５）；ｔｈｅ　ＮＯＳ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ
ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｇｒａｙ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｏｆ　ｇａｎｇｌｉｏｎ，ｆｏｏｔ　ａｎｄ　ｈｅａｒｔ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ｈａｄ　ａ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜
０．０５）．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　Ｍｅｌｉａ　ａｚｅｄａｒａｃｈｌｅａｖｅｓ　ｃｏｕｌｄ　ｉｍｐａｃｔ　ｔｈｅ　ＮＯＳ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｉｎｄｕｃｅ　ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏ－
ｓｉｓ　ｉｎ　ｆｏｏｔ　ｏｆ　ｓｎａｉｌｓ．
　　ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ：Ｏｎｃｏｍｅｌａｎｉａ　ｈｕｐｅｎｓｉｓ；Ｍｅｌｉａ　ａｚｅｄａｒａｃｈ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ＮＯＳ
Ｆｕｎｄｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｐｌａｎｎｉｎｇ　Ｓｕｂｊｅｃｔ　ｏｆ‘ｔｈｅ　Ｔｗｅｌｆｔｈ　Ｆｉｖｅ－ｙｅａｒ－ｐｌａｎ’ｉｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｒｕｒａｌ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ｉｎ　Ｃｈｉｎａ（Ｎｏ．２０１１ＢＡＤ３８Ｂ０７０１０１），ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓ＆Ｔ
Ｍａｊｏｒ　Ｐｒｏｇｒａｍ （Ｎｏｓ．２０１２ＺＸ１０００４２２０　＆ ２００８ＺＸ１０００４－
０１１）
Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇ１９７２００３＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
　　近年来，研究发现苦楝（Ｍｅｌｉａ　ａｚｅｄａｒａｃｈ）叶浸
１７７
中 国 人 兽 共 患 病 学 报 ２０１３，２９（８）
提液对钉螺有杀灭的作用［１－２］，但是其杀螺机理不明
了。特用苦楝叶浸提液处理钉螺，通过组织化学技
术检测其软体中一氧化氮合酶（Ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎ－
ｔｈａｓｅ，ＮＯＳ）［３－４］，对照正常钉螺，研究经药物处理后
钉螺软体内 ＮＯＳ的表达部位及活性的变化，同时
结合原位末端标记法（Ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｄＵＴＰ－ｂｉｏｔｉｎ　ｎｉｃｋ　ｅｎｄ　ｌａｂｅ－
ｌｉｎｇ　ａｓｓａｙ，ＴＵＮＥＬ）检测细胞凋亡，观察药物处理
后钉螺发生凋亡的组织部位和凋亡细胞数量。从钉
螺细胞凋亡和代谢变化的角度，阐述苦楝叶浸提液
杀灭钉螺的作用机制。
１　材料与方法
１．１　材料　本实验室饲养阴性钉螺３０只，分为实
验组２０只和对照组１０只。苦楝叶浸提液由安徽省
林科院提供。ＴＵＮＥＬ试剂盒购自武汉博士德生物
工程公司。还原型尼可酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸硫
辛酰胺脱氢酶（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ　ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ，ＮＡＤＰＨ－ｄ）购自碧云天生物
工程公司。
１．２　方法
１．２．１　材料处理　实验组用苦楝叶浸提液浸泡处
理，对照组用去氯水浸泡。２５℃浸泡２４ｈ，取出钉
螺，去氯水洗净后放入清水中，根据钉螺活动状况判
断死活。取出活螺后压碎，剔除螺壳，取软体，用于
细胞凋亡和 ＮＯＳ检测。软体不经固定，直接置于
冰冻切片机上，连续切片，厚度６μｍ。切片贴于经
多聚赖氨酸处理的载玻片上。
１．２．２　染色　ＴＵＮＥＬ染色参考试剂盒说明书，其
中内源性过氧化酶阻断剂处理时间缩短为１ｍｉｎ；
ＮＡＤＰＨ－ｄ（ＮＯＳ）组织化学染色方法参考梁幼生
等［５］染色过程，其中孵化时间为３７℃３０ｍｉｎ。两种
染色法分别设置阳性对照，并用ＰＢＳ代替反应底
物，作为阴性对照。染色后梯度酒精脱水，二甲苯透
明，中性树胶封片观察。
１．２．３　分析判断　细胞凋亡阳性信号位于细胞核
内，以细胞核内出现褐色、棕色细微颗粒为凋亡细
胞。细胞凋亡定量以凋亡指数（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎｄｅｘ．
ＡＩ）表示。ＡＩ值是指在随机选择１０个高倍镜（×
４００）下视野，平均每个计数１００个细胞，计算平均凋
亡细胞百分率。
　　ＮＯＳ染色强阳性部位染色为紫黑色，阳性部位
为蓝紫色。ＮＯＳ定量以平均灰度值表示（ＯＤ）。计
算平均灰度值是选取样品阳性部位，在相同倍数的
视野、相同亮度以及相同曝光时间下照相，所得相片
用ＩＰＰ６．０软件计算相片中阳性部位的平均灰度
值。
１．２．４　统计学处理　采用ＳＰＳＳ１３．０软件对数据
进行统计分析。ＡＩ值和ＯＤ值均用ｘ±ｓ表示。两
组数据比较使用独立样本ｔ检验，Ｐ＜０．０５具有统
计学意义。
２　结　果
２．１　细胞凋亡染色　阳性对照物中凋亡细胞中着
色褐棕色颗粒，阴性对照物中均被染成蓝色，结果可
靠。凋亡细胞在两组钉螺组织中均有不同程度表
达，多为散在分布，部分呈局灶性，凋亡细胞核中着
色棕褐色颗粒，表明其ＤＮＡ已经发生了降解，ＤＮＡ
末端被标记。对照组消化腺和足部表皮观察到凋亡
细胞（见图１），实验组消化腺、足部表皮和足部肌肉
纤维间观察到凋亡细胞（见图２、３）。两组间 ＡＩ值
有统计学意义（Ｐ＜０．０５）（见表１）。
表１　两组钉螺细胞凋亡指数比较
Ｔａｂ．１　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎｄｅｘ
组别
Ｇｒｏｕｐ
凋亡指数
Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎｄｅｘ
ｔ　ｖａｌｕｅ，Ｐ
实验组
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
（１０．６±５．７４）％
４．３４３，Ｐ＜０．０５
对照组
Ｃｏｎｔｒｏｌ
（２．４±１．８４）％
２．２　ＮＯＳ染色　阳性对照物中 ＮＯＳ强阳性呈现
紫黑色，阳性为蓝紫色，阴性对照物未染色。检测发
现钉螺ＮＯＳ主要分布于足部、神经中枢、口囊、鳃
叶、心脏、咽管和生殖细胞等处。其中神经中枢、心
脏、咽管和生殖细胞等着色浓密，表现出强阳性（图
４－７），足部、口囊、鳃叶等（图８－１０）表现阳性。实验
组和对照组之间染色程度无明显区别，但是在组织
形态发生变化，实验组足部肌肉纤维断裂、神经节结
构松散。
　　通过灰度计算分析，实验组神经中枢、足部神经
节和心脏的平均 ＯＤ值与对照组有统计学意义（Ｐ
＜０．０５），其他部位差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）
（见表２）。
３　讨　论
　　钉螺是日本血吸虫唯一的中间宿主，杀灭钉螺
是控制血吸虫病传播的重要途径之一。相对于化学
灭螺药物，植物药物对生态环境的破坏小、毒性低，
国内外迄今已经有１　０００多种植物被用于灭螺药物
的研究开发［６］。其中苦楝树以其分布广泛、取材容
易、无环境污染等特点，近年来受到了较多关注。
２７７
８期 张　仪等：苦楝叶对钉螺细胞凋亡和一氧化氮合酶的影响
图１　对照组足部细胞凋亡（×４００）
图２　实验组足部细胞凋亡（×４００）
图３　实验组消化腺细胞凋亡（×４００）
图４　实验组中枢神经节ＮＯＳ强阳性（×４００）
图５　实验组心脏ＮＯＳ强阳性（×４００）
图６　实验组咽管ＮＯＳ强阳性（×２００）
图７　实验组生殖细胞ＮＯＳ强阳性（×２００）
图８　实验组足部ＮＯＳ阳性（×１００）
图９　实验组口囊ＮＯＳ阳性（×１００）
图１０　实验组鳃叶ＮＯＳ阳性（×１００）
Ｆｉｇ．１　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｏｏｔ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（×４００）
Ｆｉｇ．２　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｏｏｔ　ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ（×４００）
Ｆｉｇ．３　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ　ｇｌａｎｄ　ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ（×４００）
Ｆｉｇ．４　ＮＯＳ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇａｎｇｌｉｏｎ（×４００）
Ｆｉｇ．５　ＮＯＳ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｈｅａｒｔ（×４００）
Ｆｉｇ．６　ＮＯＳ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ　ｃａｖｉｔｙ（×２００）
Ｆｉｇ．７　ＮＯＳ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｅｓｔｉｓ（×２００）
Ｆｉｇ．８　ＮＯＳ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｏｏｔ（×１００）
Ｆｉｇ．９　ＮＯＳ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｏｕｔｈ（×１００）
Ｆｉｇ．１０　ＮＯＳ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｔｅｎｉｄｉｕｍ（×１００）
表２　不同组织中ＮＯＳ平均ＯＤ值比较
Ｔａｂ．２　Ｔｈｅ　ｍｅａｎ　ＯＤ　ｏｆ　ＮＯＳ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｉｓｓｕｅ
组别
Ｇｒｏｕｐ
组织
Ｔｉｓｓｕｅｓ
足部
Ｆｏｏｔ
鳃叶
Ｃｔｅｎｉｄｉｕｍ
口囊
Ｍｏｕｔｈ
神经中枢
Ｇａｎｇｌｉａ
心脏
Ｈｅａｒｔ
咽管
Ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ
ｃａｖｉｔｙ
生殖细胞
Ｔｅｓｔｉｓ
Ｅｘｐｅｒｉ　ｍｅｎｔａｌ　０．４３１±０．０４３　０．３１３±０．０７５　０．４４３±０．０６７　０．６１６±０．０６４　０．７１６±０．０５８　０．７３２±０．０９１　０．７５８±０．０９６
Ｃｏｎｔｒｏｌ　 ０．３０２±０．０４２　０．２６９±０．１０７　０．４３１±０．０３４　０．５１４±０．０４９　０．５０３±０．０４５　０．７０６±０．１２９　０．７２５±０．０８７
ｔ　ｖａｌｕｅ，Ｐ
６．１２５
Ｐ＜０．０５
１．０２９
Ｐ＞０．０５
０．４４７
Ｐ＞０．０５
３．８３３
Ｐ＜０．０５
８．６０８
Ｐ＜０．０５
０．５１６
Ｐ＞０．０５
０．４５９
Ｐ＞０．０５
３７７
中 国 人 兽 共 患 病 学 报 ２０１３，２９（８）
Ｍａｒｌｅｎｅ等［７］发现苦楝提取物对肝片吸虫中间宿主
椎实螺的心率有影响，施玉梁等［８］提取苦楝活性物
质苦楝素，发现其能够阻遏间接刺激引起的肌肉收
缩反应。由此可见，苦楝也许会影响钉螺头足部肌
肉和心肌的收缩。另一方面，梁幼生等［５］发现钉螺
体内一氧化氮合酶（ＮＯＳ）在足肌神经节和心脏存
在大量分布，方正明等［９］观察到钉螺离体细胞存在
凋亡现象，但并不能定位于组织。因此，本文利用
ＴＵＮＥＬ法和组织化学方法分别观察了药物处理后
钉螺体内细胞凋亡的情况和ＮＯＳ的活性变化。
　　通过研究发现，通过苦楝叶浸提液浸泡诱导，实
验组钉螺的细胞凋亡比率显著高于对照组，这说明
苦楝叶浸提液可以有效诱导钉螺细胞凋亡；实验组
钉螺消化腺、足部表皮和足部肌肉观察到凋亡细胞，
对照组凋亡则只发生在消化腺和足部表皮，说明苦
楝叶浸提液诱导了钉螺足部的细胞发生凋亡。
　　另一方面，ＮＯＳ在生物体中是合成ＮＯ的限速
酶，后者是一类气体自由基，过量ＮＯ会与氧自由基
结合生成具有神经毒性作用的过氧化硝基离子
（ＯＮＯＯ－）［１０］。本文利用ＮＡＤＰＨ－ｄ组织化学染色
方法，主要观察ｎＮＯＳ的表达部位和含量，ｎＮＯＳ是
合成ＮＯ的主要限速酶之一，其过度激活会产生过
量的ＮＯ。Ｍｉｃｈｉｏ等研究发现，ＮＯ主要从线粒体
途径参与诱导多种组织的细胞凋亡过程［１１］。本文
发现，钉螺ＮＯＳ主要分布于足部、神经中枢、口囊、
鳃叶、心脏、咽管和生殖细胞等处，这和之前的研究
结果是一样的［５］。实验组钉螺的足部、神经中枢和
心脏的ＮＯＳ表达量与对照组有统计学意义，说明
苦楝叶浸提液会造成钉螺体内神经系统 ＮＯＳ的过
量表达。这种过量表达会使该部位合成过多 ＮＯ，
ＮＯ本身作为自由基，同时也是ＯＮＯＯ－的前体，这
些都会损伤ＤＮＡ。另外，在产生ＮＯ的过程中也会
使细胞内的Ｃａ２＋浓度增加，破坏呼吸链，消耗大量
ＡＴＰ并损伤 ＤＮＡ，导致细胞凋亡［１２］。因此，这可
以解释为何我们在足部肌肉纤维间检测到细胞凋
亡。神经中枢和心脏中 ＮＯＳ的高表达提示了苦楝
叶浸提液的杀灭钉螺机制也许是通过影响其神经系
统和循环系统来实现的。刘金涛等研究发现苦楝处
理后钉螺体内糖原和蛋白含量会降低［１３］，本文的研
究丰富了苦楝灭螺的理论基础。
　　综上所述，苦楝叶浸提液会影响钉螺 ＮＯＳ的
活性，并诱导其足部肌肉纤维间发生细胞凋亡。
参考文献：
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ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　ｂｅａｄ　ｔｒｅｅ［Ｊ］．Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｓｃｈｉｓｔｏ　Ｃｔｒｌ，２０１０，２２（３）：２６３－
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国血吸虫病防治杂志，２０１０，２２（３）：２６３－２６７．
［２］Ｘｉａ　ＳＧ，Ｚｈａｎｇ　Ｙ，Ｌｉｕ　ＨＸ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｘｐｅｌｉｎｇ　ａｎｄ　ｋｉｌｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ
ｌｅａｆ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　６ｗｏｏｄｙ　ｐｌａｎｔ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｏｎ　Ｏｎｃｏｍｅｌａｎｉａ　ｈｕｐｅｎｓｉｓ
ａｎｄ　ｔｈｅ　ｉｍｐａｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ａｎａｔｏｍｉｃａｌ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ｉｔｓ
ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ｏｒｇａｎｓ［Ｊ］．Ａｎｈｕｉ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｓｃｉ　Ｔｅｃｈ，２０１２，３８（２）：
２６－２９．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）
夏尚光，张仪，刘和香，等．６种木本植物叶浸液对钉螺驱杀作
用及其生殖器官解剖结构的影响［Ｊ］．安徽林业科技，２０１２，３８
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［３］Ｚｈａｎｇ　Ｙ，Ｚｈｕ　Ｄ，Ｌｉ　ＨＪ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｐｌａｎｔ
ｍｏｌｕｓｃｉｄｅ　ＨＬ　ｏｎ　Ｏｎｃｏｍｅｌａｎｉａ　ｈｕｐｅｎｓｉｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｚｏｏｎｏｓｅｓ，
２００７，２３（１０）：９７８－９８１．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）
张仪，朱丹，李洪军，等．新型植物灭螺剂 ＨＬ对钉螺作用机制
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收稿日期：２０１３－０２－２８；修回日期：２０１３－０３－１９
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