全 文 ：生物技术在满江红研究中的应用
唐龙飞
(福建省农科院红萍研究中心 , 福建　福州　 350013)
摘　要: 满江红是起源于后白垩纪的水生蕨类与固氮蓝藻的共生体 , 已在中国与东南亚各国养殖
与利用达数百年之久。本世纪 70年代 “有机农业” 的兴起使人们更加重视满江红的研究与利用。
作者回顾了 80年代中期以来福建省农科院红萍研究中心利用单克隆抗体、扫描电镜、密度梯度离
心、显微操作与有性杂交育种等生物技术所进行的红萍体内鱼腥藻分类鉴定、萍藻重建共生体、红
萍体内鱼腥藻的体外培养和红萍有性杂交育种等方面的研究成果 , 并简述了国际同行的相关研究
工作。
关键词: 生物技术 ; 满江红 ; 满江红体内鱼腥藻 ; 研究 ; 应用
中图分类号: S 555. 1 文献标识码: A
Application of biotechniques to the investigation on Azolla
TAN G Long-fei
(National Azolla Research Center , Fu jian Academ y of Agricultural Sciences,
Fuzhou　 350013, China)
Abstract: Azolla is an a ssocia tion of aquatic fern and N2-fixing cyanobacteria , which o rigina ted in la te
Cha lk Period. For its high suitability in paddy ecosystem , the fa rmers in China and Southeast Asian
countries have cultured and used it for sev eral centries. The“ org anic ag riculture” which w as risen in
1970s brought to a widespread attention on the investiga tion and utilization of Azolla. The author
reviewed the applica tion o f biotech niques, such as monoclonal antibody, scanning electron-
micro scopy , density g radient centrifuga tion, micr o-manipula tion and sexua l hybridization to the
classification and identifica tion of Anabaena azollae, re-establish ment of Anabaena-fr ee Azolla w ith
Anabaena azollae , in vitro cultiv ation o f Anabaena azollae and sexual hybridization o f azolla, sta rted
from middle 1980s and the receiv ed achiev ements. The rela tiv e investig ations of the collegues in whole
w orld range w ere also briefly introduced.
Key words: Bio techniques; Azolla; Anabaena azollae ; Inv estig ation; Application
满江红 , 俗称红萍、 绿萍等。它是水生蕨类植物与固氮蓝藻结合形成的共生生物 [1, 2 ]。
起源于远古的后白垩纪 , 现存的种包括三膘红萍亚属 ( Euazolla ) 的蕨状满江红 ( A.
f il iculoides )、 小叶满江红 ( A. microphyl la)、 墨西哥满江红 ( A. mex icana) 和卡洲满江红
( A. caroliniana) 4个种与九膘红萍亚属 ( Rhizosperma) 的尼罗满江红 ( A. nilotica)和羽叶满
江红 ( A. pinnata) 两个种 [3 ]。由于满江红在水田生态环境中具有生长迅速、 生物量大、 固氮
效率高、 耐养分贫瘠等优点 , 它已被中国与东南亚各国农民用作稻田绿肥与畜禽鱼饲饵料达
数百年之久 [ 4]。本世纪 70年代在全球兴起的 “有机农业” , 以及 80年代以来提出并实施的
福建农业学报 14(增刊 ): 201～ 206, 1999
Fujian Journal of Agricultural Sciences
文章编号: 1008- 0384( 1999) S0- 0201- 06
“生态农业” , 促使人们对满江红这一水生环境中的蕨—藻共生生物进行了更深入细致的研究
与探索。生物技术的不断发展与提高 , 为红萍基础研究提供了广阔的空间与获得成功的可能
性。本文报道我们在红萍基础研究中应用单克隆抗体、扫描电镜观察、连续密度梯度离心、显
微操作以及有性杂交育种等生物技术的具体实例 ,并简单介绍 90年代以来国内外有关单位红
萍研究中生物技术的应用情况。
1　满江红体内鱼腥藻单克隆抗体的制备与应用
由英国科学家 Milstein和 Ko¨ hler ( 1976)创立的单克隆抗体技术具有特异性强 ,可在体外
连续、大量地制备与生产等优点 [5 ] ,已经迅速应用于医疗诊断、医药生产、轻工产品制备等重
要领域。从 1986年开始 , 我们将它应用于满江红及其体内鱼腥藻 ( Anabaena azollae) 的分类
与鉴定研究上 [6 ] , 该研究主要包括:
1. 1　红萍体内鱼腥藻分离提纯与免疫 BALB /C小白鼠　采用 1. 2～ 2. 5 mol连续蔗糖密度离
心法 , 在 15 000 r· min- 1下离心 60 min, 可将红萍体内鱼腥藻压榨粗提液中的红萍体内鱼腥
藻与红萍叶绿体、碎屑等分开 [7 ]。用 0. 2 ml含 1× 107个细胞的鱼腥藻与其催化剂的抗原每隔
2周免疫 BALB /C小白鼠 3次 , 即可获得含红萍体内鱼腥藻抗体的免疫鼠。
1. 2　免疫鼠 B淋巴细胞与同系鼠骨髓瘤细胞融合及阳性单克隆杂交瘤细胞系的建立　免疫
鼠 B淋巴细胞从其脾脏中游离出来后 , 以 2∶ 1比率与同系 BALB /C鼠的骨髓瘤细胞在含
35%聚乙二醇 ( PEG)、 5%二甲基亚枫的 HAT培养基中作用 1 min, 即可产生融合细胞。经
扩繁后有限稀释培养于 24孔或 96孔平板 , 分别检测各平板单孔中的培养液与红萍体内鱼腥
藻的间接萤光反应 ( IFA)。筛选出对红萍体内鱼腥藻具阳性反应的杂交瘤细胞株 , 经再次扩
繁、 有限稀释及 IFA测定后 , 即可获得既可在体外连续继代培养又能分泌针对某一红萍体内
鱼腥藻抗原决定簇产生阳性反应的阳性杂交瘤细胞系。
1. 3　红萍体内鱼腥藻单克隆抗体在红萍分类与体内鱼腥藻鉴定上的应用　用我们建立起来
的 40个红萍鱼腥藻单克隆抗体细胞系对来自 6个种、 140个品系的红萍体内的鱼腥藻进行一
年四季的跟踪测定 , 证明红萍体内鱼腥藻细胞表面抗原在一年四季中的稳定性 , 并可将各种
萍的体内鱼腥藻分为 4个抗原类型 , 即蕨状满江红——洋州满江红 ( A· f变种 ) —— 卡州满
江红 , 小叶满江红—— 墨西哥满江红 , 羽叶满江红——覆瓦状满江红 ( A· p变种 )和尼罗满
江红。这个结果与红萍亲缘性的 DNA分析几乎是一致的 [8 ]。 应用红萍体内单克隆抗体 C16
(对来自蕨状满江红的体内鱼腥藻呈阳性反应 ,来自小叶满江红体内鱼腥藻呈阴性反应 )可确
切地鉴别人工重建的红萍—鱼腥藻共生体的体内鱼腥藻来源 , 对萍—藻重组的成功提供了有
力的证据 [9 ]。它还应用于杂交红萍的鱼腥藻鉴定 ,证实杂交萍的体内鱼腥藻全部来源于母本植
株 [6 ]。
2　无藻满江红和满江红鱼腥藻重建共生体
满江红是蕨—藻的共生生物 ,它必须证实共生物的 Koch假说 ,即满江红体内鱼腥藻确实
是来源于红萍体内 , 它能在体外单独培养并可重新感染蕨体形成共生关系 , 而被接进去的藻
确实是原先分离出来的红萍体内鱼腥藻。 用人工方法进行无藻满江红与满江红鱼腥藻
( Anabaena-f ree Azol la)共生体重建 , 或不同种间满江红及其共生藻的交换 , 是许多研究者多
202 福建农业学报 第 14卷
年来的宿愿 [10 ]。它包括无藻萍的获得 , 满江红鱼腥藻的分离与培养 , 无藻萍与满江红鱼腥藻
共生关系的建立。经过前期的研究实践与资料分析 ,我们确定了采用满江红有性繁殖器官——
孢子果进行重组的途径。其主要依据是: 在孢子果成熟期 , 其体内红萍鱼腥藻是以休眠孢子
形式集中于囊群盖顶端或漏斗状膜内 [11 ]。鱼腥藻孢子与红萍大孢子同步萌发并转移于红萍孢
子苗茎尖部位 , 进一步分化成丝状体后进入红萍叶腔 , 形成共生关系 [12 ] , 该研究主要包括:
2. 1　无藻满江红的获得　采用切除满江红大孢子果顶端的漏斗状膜和囊群盖方法可彻底清
除红萍体内鱼腥藻 [13 ]。经扫描电镜追踪观察 , 这种方法处理的孢子果在萌发期间 , 其孢子果
萌发孔、 浮膘、 茎尖、 子叶等部位均未观察到红萍鱼腥藻孢子。 该种红萍孢子苗形成植株后
需补充氮源才能正常生长 ,并且无固氮能力。但可正常形成有性繁殖器官——红萍孢子果。该
孢子果也可正常发芽形成植株 , 其体内仍不存在能固氮的鱼腥藻 [14 ]。
2. 2　无藻满江红与满江红体内鱼腥藻重建共生体的关键技术　由于在重建共生关系的初始
阶段 , 无藻满江红与满江红鱼腥藻不是统一的整体 , 它们之间的发育没有同步。 因此 , 如何
调整共生体蕨藻之间的同步发育就成为萍藻重组的关键技术。其具体方法是 , 同种或异种的
红萍孢子果在同一植物生长箱中以 4 000 lx、 18℃ /24℃ (夜 /日 )、 90%湿度培养 7～ 8 d, 待
孢子果浮膘张开 , 出现绿点时 , 将受体萍的孢子果囊群盖及漏斗状膜切除 (形成无藻萍 ) , 将
给体萍孢子果囊群盖取下 (其囊群盖顶端红萍鱼腥藻孢子已开始萌动 ) 移植于受体萍的孢子
果顶端 , 并充分接触。 处理后的孢子果在上述植物生长箱中继续培养形成红萍孢子苗 , 继而
长成具有红萍体内鱼腥藻的植株。用扫描电镜追踪萍藻重组处理孢子果发育的整个过程 , 只
有在两者同步发育时才能形成正常植株。 该种植株用乙炔还原法测定具有固氮酶活性 , 红萍
体内鱼腥藻单克隆抗体检测证实其体内鱼腥藻来源于给体红萍植株。无藻满江红与红萍体内
鱼腥藻重建共生体获得成功 , 其成功率为 10% [ 10]。
3　红萍体内鱼腥藻的离体培养
自 1873年 Strasburg er发现满江红体内存在鱼腥藻以来 ,人们对其在红萍体内的作用 ,以
及萍藻之间的共生关系一直抱有极大的兴趣 , 并试图将其分离出来进行纯培养 [15 ]。本世纪 30
年代以来 , 人们对红萍体内鱼腥藻的分离与培养进行了不懈的努力。其主要方法有辗压提取
法、 微管抽吸法、 酶消化法和梯度离心法 [16 ]。 分离培养成功的报道有: Vouk和 Welisch
( 1931) , Huneke ( 1933) , Tuzimura ( 1957) , Shen ( 1960) , Venkadaraman ( 1962) , 白克智
( 1979)和郑伟文 ( 1982)等 ; 不成功报道有: Singh ( 1977) , Peters ( 1976) , Hill ( 1975) , Lang
( 1965) , Bortels ( 1940) 和 Des ( 1913) 等。随着生物技术日新月异的发展 , 研究者发现上述
方法分离的红萍体内鱼腥藻后代在细胞表面抗原、 DNA序列等方面与刚从红萍叶腔中分离的
红萍体内鱼腥藻有明显差异而与自生鱼腥藻等相同。这种现象被解释为共生型蓝藻在向自生
型蓝藻过渡中发生了质的变化。 我们注意到在所有上述红萍体内鱼腥藻的分离方法中都无法
确切排除体外自生蓝藻的污染 , 而且分离的鱼腥藻是否与红萍叶腔中的鱼腥藻同源也无从监
测。在我们的研究中采用了显微操作技术直接从叶腔内获取培养物并用红萍体内鱼腥藻单克
隆抗体 C16追踪红萍鱼腥藻在体外培养的全过程 , 以保证其纯度的可靠性 ,它主要包括以下内
容:
3. 1　红萍叶腔内的鱼腥藻分离　新鲜萍体材料用 0. 525%次氯酸钠与 0. 05%吐温 80表面消
203增 刊 唐龙飞: 生物技术在满江红研究中的应用
毒 1 min, 10%双氧水漂洗 3 min后用无菌水洗去药物 , 在立体解剖镜下取茎尖往下第 4～ 10
张叶片 , 用尖嘴镊从叶腔基部顶开叶腔 (注意不让器具接触裸露的体内鱼腥藻 ) , 用消毒过的
尖嘴镊直接夹出叶腔内的鱼腥藻菌落 , 并悬浮于 pH 7. 4的磷酸缓冲液 , 从 15张叶片叶腔中
夹取的鱼腥藻菌落接种于一个血清瓶或试管的培养基中。
3. 2　红萍体内鱼腥藻离体培养条件的探讨　研究发现 , 分离藻在黑暗条件下培养 4～ 6 d可
有效防止光漂白作用。其后在 30℃、 10 000 lx光照培养箱中 ,红萍分离藻在添加 10 m mol果
糖 , 0. 05%酪蛋白水解物 , 30 mg· kg- 1NaNO3的 Allen-Arnon培养基上 ,在 1% O2、 99% N2
环境中能保持最长的存活期 ( 183 d)。在这种培养条件下 , 经显微镜定点监测蓝藻的藻丝体 ,
10 d增长 6. 25% , 用显微摄影技术拍摄到离体鱼腥藻末端新长出藻丝体的证据。在离体培养
后期藻丝体出现鱼腥藻的厚垣孢子。用红萍体内鱼腥藻单克隆抗体 C16定期检测培养不同天数
的离体红萍体内鱼腥藻 , 尽管离体藻的生长状况不同 , 均证实其纯度的可靠性。 说明在漫长
的体外培养期间 , 离体藻的细胞表面抗原并没有发生任何改变。 在离体鱼腥藻与自生的柱孢
鱼腥藻和项圈藻对碳、氮营养需求的比较实验中 ,两种自生藻可在无氮 BG-11和 Allen-Arnon
培养基上连续传代培养 , 而在培养基中添加有机碳、 氮源后却迅速死亡 , 保绿期下降至 3～ 6
d。与此相反 ,在无氮 BG-11和 Allen-Arnon培养基上离体红萍体内鱼腥藻仅能存活 21～ 22 d,
而在添加有机碳、 氮源后却提高到 83 d。说明在长期的离体培养情况下 , 红萍体内鱼腥藻的
生理营养代谢仍保持共生藻的特性 [ 17]。该研究表明寻求更适合的培养条件 (趋同于红萍叶腔
环境 ) 是获得红萍体内鱼腥藻在离体情况下连续培养的必要条件。
4　有性杂交技术在红萍育种上的应用
有性杂交育种是人工创造作物新品系的重要途径 , 该方法已被应用于作物育种达数十年
之久。至本世纪 70年代末 , 有性杂交方法才被用于满江红的育种上。但由于缺乏行之有效的
鉴定技术 , 红萍杂交种的真伪无法确定 [18 ]。 红萍有性杂交育种真正成功的报道始见于 1986
年 [19 ] , 主要的技术包括雌孢子果的去雄、 单苗培植与杂种鉴定技术。 1990年 , 我们采取回交
育种的方法获得红萍回交 3号优良品种 , 具有繁殖快、 抗热性强、 生物量大、 品质好等特点 ,
至今仍是我省红萍的当家品种 [ 20]。
4. 1　红萍雌孢子果的去雄与杂交育苗　选择成熟、未受育的雌孢子果作母本材料 ,在立体解
剖镜下剥离附于孢囊上的同系雄孢子果泡胶块 , 称为去雄。 去雄后的雌孢子果在湿润的滤纸
上与父本材料的泡胶块混合并转移于植物光照培养箱中培育 ,在 28℃、 1 000 lx条件下培养 10
～ 14 d,即可长出绿苗 , 将单株幼苗转移于含 40 mg· kg- 1微量氮源的培养液中继续光照培养
并控制霉菌的感染 , 25～ 30 d后即能获得红萍成苗。
4. 2　红萍有性杂交苗的鉴定　采用酶学鉴定结合红萍后代繁殖器官 (泡胶块钩毛横隔数 , 大
孢子果外周壁 )、 营养器官 (叶表皮毛、 叶色分布 ) 形态学观察 , 及繁殖器官的有性分析 (小
孢子果的可育性 , 大孢子果的发生率 ) 可有效判别红萍杂交苗的真伪。 满江红植株的同工酶
谱带分析表明 , 杂交萍后代应同时具有父母本萍的同工酶主带。 其生物学特征 (包括营养器
官与繁殖器官 ) 一般介于父母本萍之间 , 如雄孢子果泡胶块钩毛横隔数 , 墨西哥满江红常见
频率为 7～ 9, 小叶萍为 2～ 3, 不管哪一种萍为父本材料 , 其杂交后代的钩毛横隔数均介于它
们之间 [21 ]。叶表皮毛细胞形态 , 大孢子果 (如果有的话 )外周壁等形态分析均证明了这一点。
204 福建农业学报 第 14卷
至于生物量、 品质和抗逆性等综合性状由于杂交后代的杂种优势则有可能优于双亲 [22 ] , 如回
交萍 3号的周年生物量、 夏季产量、 粗蛋白含量、 抗热性等都明显超过双亲 , 显现了杂种优
势的特征。
5　 80年代以来国际同行的相关研究
在国际方面 , 由于满江红 -满江红体内鱼腥藻一直是生物固氮基础研究的一个重要方面 ,
许多先进技术都能较快地应用于该共生体系的研究之上。因此 ,在其萍藻共生关系 [ 2]、生物学
形态与分类地位方面 [3 ]做了大量工作。近十几年来生物技术 ,特别是分子生物学技术的快速发
展与完善 , 使红萍研究更趋向定量与精细。例如 , 80年代在红萍分类方面多采用扫描电镜观
察红萍有性繁殖器官 [23, 24 ]及同工酶谱代分析法 [ 25] , 其限制因素为某些品种不产生有性繁殖器
官以及各品种同工酶谱在一年四季中的波动性。而 90年代后所采用的染色体分析 [ 26]、 DNA
杂交技术 [27 ]以及 PCR扩增技术 [8 ]对红萍各品种间的分类学地位能给出更确切的测量与定位。
在红萍育种方面 , 80年代中期主要采取的有性杂交育种技术 [28 ] , 虽也创造一些新的品种 , 但
这个工作在国外仅停留在理论研究之上 , 并没有出现用于农业生产的杂交萍品种。从红萍原
生质体形成再生植株的途径也曾探索过 [ 29 ] , 但最终并未形成有效的愈伤组织。因此 , 要使红
萍研究能更深入进行 ,并取得在理论研究与生产实践上的成效 ,诸如基因分析、 DNA重组、原
生质体再生植株等生物技术的潜力还有待于进一步开发。
6　小　结
本文所列举的实例表明了生物技术在红萍研究中所发挥的作用与具有的巨大潜力。随着
分子生物学的进一步发展 , DN A重组及鉴定技术也必然会渗透到红萍研究的领域之中 ,它必
定会使满江红这个古老而具有广阔应用前景的生物发出更灿烂的光彩。
[参考文献 ]
[1 ] 吕术缨 , 陈克增 , 沈志豪 , 等 . 稻田绿肥—— 满江红生物学特性研究 [ J ]. 中国农业科学 , 1963 ( 11): 35- 40.
[2 ] Peters G A and Mayne B C. Th e Azolla , Anabaena azollae relationshipⅡ . Locali zation of ni trogenase activity as assayed by
acctylene reduction [ J] . Plan t Ph ysiol, 1974b ( 53): 820- 824.
[3 ] Tan B C, Payaw al P, Watanabe I, et al . Modern taxonomy of Azol la: a review [ J] . Philippine Ag ricul turist. 1986
( 69): 491- 512.
[4 ] Liu C C. Use of Azol la in rice production in China [C ]. In: Nit rogen and Rice. Edi ted by IRRI. Phi llippines, 1979, 376
- 394.
[5 ] 程由铨 ,林天龙 , 李怡英 , 等 . 应用单克隆抗体快速诊断鸡新城疫 [C ] . 中国畜禽传染病—— 全国畜牧兽医生物技术
讨论会论文专辑 , 1988, 79- 81.
[6 ] 刘中柱 ,程由铨 , 唐龙飞 , 等 . 满江红鱼腥藻单克隆抗体的制备和应用研究 [ J]. 中国科学 ( B辑 ) , 1989 ( 1) : 44-
52.
[ 7 ]杨苏 , 唐龙飞 , 宋铁英 , 等 . 蔗糖密度梯度离心提取满江红体内鱼腥藻方法的研究 [ J ]. 南平师专学报 , 1998, 17
( 4): 19- 22.
[8 ] Benoit V C, Watanabe I, Van Hove C, et al . Genetic diversi ty and phylogeny analysis of Azolla based on DNA amalif ication
by arbi trary primers [ J ]. Genome, 1993 ( 36): 686- 693.
[ 9 ]唐龙飞 , 程由铨 , 郑德英 , 等 . 单克隆抗体荧光标记物 C16- FITC对萍藻重组体的鉴定 [ J ]. 福建农业科技 , 1988
205增 刊 唐龙飞: 生物技术在满江红研究中的应用
( 2): 27- 28.
[ 10 ] 林沧 , 刘中柱 , 郑德英 , 等 . 无藻满江红 ( Anabaena-free Azol la ) 和满江红鱼腥藻 ( Anabaena azollae) 重建共生体
[ J]. 中国科学 ( B辑 ) , 1988 ( 7): 700- 708.
[11 ] 何国藩 ,柯玉诗 , 林月婵 . 对红萍成熟大孢子果的电镜扫描与研讨 [ J]. 中国农业科学 , 1984 ( 1): 28- 30.
[ 12]叶锈珍 . 鱼腥藻与满江红大孢子果长成幼孢子体的共生关系的形态学观察 [ J] . 植物学报 , 1983, 25 ( 2): 192- 194.
[13 ]郑德英 ,林沧 , 唐龙飞 , 等 . 萍藻重组研究 I.无藻萍的获得及其验证技术 [ J ]. 福建省农科院学报 , 1987, 2 ( 2): 42
- 47.
[14 ] Lin Chang and Watanabe I. A new method for obtaining Anabaena-free Azolla [ J ]. New Ph ytologis t, 1988 ( 108): 341
- 344.
[15 ] 唐龙飞 ,刘中柱 , 渡边岩 . 红萍共生藻的体外培养 [ J] . 福建省农科院学报 , 1991, 6 ( 2): 25- 32.
[16 ] 刘中柱 ,郑伟文 . 满江红鱼腥藻的分离 [M ]. 中国满江红 . 北京: 农业出版社 , 1989, 175- 176.
[17 ] Tang L F, Watanabe I and Liu C C. Limi ted multiplication of Symbiotic Cyanobacteria of Azol la spp. on arti ficial media
[ J] Appl. Envi ron Microbiol. 1990 ( 56): 3623- 3626.
[18 ] 郑德英 ,唐龙飞 , 章宁 , 等 . 满江红有性杂交研究及其鉴定 [ J] . 作物学报 , 1994, 20 ( 6): 701- 709.
[19 ] 魏文雄 ,金桂英 , 章宁 , 等 . 红萍有性杂交研究初报 [ J] . 福建省农科院学报 , 1986, 1 ( 1): 73- 79.
[ 20] 郑德英 ,唐龙飞 , 章宁 , 等 . 回交满江红 3号 ( M H3- 1) 若干抗逆特性研究 [ J ]. 福建省农科院学报 , 1994, 9 ( 2):
21- 27.
[21 ] 唐龙飞 ,陈坚 , 章宁 , 等 . 小叶满江红与墨西哥满江红杂交后代有性器官 (孢子果 ) 形态分析 [ J]. 福建省农科院学
报 , 1996, 11 ( 3): 54- 59.
[22 ] 唐龙飞 ,郑德英 . 我国红萍育种概况及其展望 [ J ]. 福建省农科院学报 , 1993, 8 ( 1): 40- 44.
[23 ] Dunham D G and Fow lex K. Taxonomy and species recogni tion in Azolla Lam [C ]. In: Azolla Uti li zation. Proceedings
of th e Workshop on Azolla Use, China. IRRI, Los Banos. 1985, 7- 16.
[ 24 ] Calv ert H E, Perkins S K and Peters G A. Sporocarp st ructure in th e h eterosporous w ater fern Azolla Mesican Presl [ J] .
Scanning Elect ron Microscopy, 1983 ( 3): 1433- 1510.
[ 25 ] Zimmerman W J, Lumpkin T A and Watanabe I. Isozyme di fferentiation of Azolla Lam [ J]. Euphytica, 1989a ( 42): 163
- 170.
[26 ] Stergianou K K and Fow ler K. Chromosome numbers and taxonomic im plications in the fern genus Azol la ( Azollaceae)
[ J]. P. L. Syst. Evol, 1990 ( 173): 223- 239.
[ 27] Plazinski J, Zheng Q, Taylor R, et al. DNA probes sh ow genetic variation in cyano-bacterial symbion ts of the Azol la f ern
and a closer relationship to f ree-living Nostoc st rains than to f ree-living Anabaena s trains [ J ]. Appl. Envi ron. Microbiol, 1990b
( 56): 1263- 1270.
[28 ] Do V C, Watanabe I, Zimmerman W J, et al . Sexual h yb ridization among Azolla species [ J] . Canad. J. Bot, 1989
( 67): 3482- 3485.
[29 ] Redford K, Berliner M D, Gates J E, et al . Protoplast induction f rom sporophyte tissues of the heterosporous fern Azolla
[ J]. Plant cell, Ti ssue and Organ cul ture, 1987 ( 10): 187- 196.
206 福建农业学报 第 14卷