全 文 ：林业科技开发 2015 年第 29 卷第 1 期 101
食料等因素有关［13］。不同抗性程度的木麻黄无性系
受害后，其小枝内化学物质的变化，会对木毒蛾生长
发育产生何种影响，以及木毒蛾幼虫取食不同抗性水
平的木麻黄无性系后体内纤维素酶有何变化等有待
进一步研究。
参考文献
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(责任编辑 吴祝华
櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒
)
doi: 中图分类号:S763
榉树枯萎病菌毒素的提取及生物活性的测定
刘侃诚1，许伟1，郁世军2，李英2，韩正敏1*
(1．南京林业大学林学院，南京 210037;2．江苏农景生态建设有限公司)
摘 要:为了明确榉树枯萎病菌毒素的致病能力，对榉树枯萎病菌毒素进行了提取及生物活性的测定。结果表
明:病原菌毒素滤液的生物活性主要体现在对于榉树胚根生长的抑制作用以及对于榉树幼苗的致萎性。通过对培
养液种类、培养温度、培养时间、培养方式、培养环境酸碱度以及光照与否 6 项指标进行筛选，最终确定使用改良
Czapek培养液，在 25 ℃下，持续光照，连续振荡，pH为 7 的条件下可以获得较多的毒素。毒素对榉树的胚根生长
存在明显的抑制作用，毒素的浓度越高，抑制作用就越明显。不同浓度的毒素滤液处理对榉树幼苗的致萎作用不
同，浓度越高致萎性也越强。
关键词:榉树枯萎病;尖孢镰刀菌;毒素;生物活性
收稿日期:2014－10－15 修回日期:2014－11－20
基金项目:江苏省农业科技支撑计划项目“榉树用材林优良家系选
育”(BE2013409)。
作者简介:刘侃诚(1987 －) ，男，博士生，研究方向为森林微生物。通
信作者:韩正敏，男，教授。E-mail:zmhan@ njfu． edu． cn
The extraction and biological test on toxin in the blight disease of Zelkova∥LIU Kancheng，XU Wei，YU Shi-
jun，LI Ying，HAN Zhengmin
Abstract:The blight disease of Zelkova is a new disease which occurred in Maoshan area of Jurong City in Jiangsu Province
in recent years． The outbreak of this disease has led to a huge loss on propagation of Zelkova for several years． Extraction
and biological test of toxin in the blight disease of Zelkova had been carried out． The toxin of the pathogen depressed the
plant’s radicle growth and led to seedling shrivel up． By the screening on culture liquids，temperature，time，model，pH
of liquids and sunlite or not，it was found that the optimal culture medium for toxin production was new Czapek liquid，and
the optimum culture condition was 25 ℃，light，continuous shock，pH 7． Higher concentration of toxic substance presented
higher possibility to depress the plant’s radicle growth and cause blight of seedling．
Key words:the blight disease of Zelkova;Fusarium oxysporum;toxin;biological
First author’s address:College of Forestry，Nanjing
Forestry University，Nanjing 210037，China
榉树枯萎病是近年来在镇江一带普遍流行的一
种新病害，已经严重阻碍了榉树产业的发展。许
欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗 森林经营与保护
10.13360/j.issn.1000-8101.2015.01.029
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伟［1］对榉树枯萎病的病原进行了分离和接种，经鉴
定该病害病原为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。
目前主要有两种学说解释镰刀菌引起植物枯萎的原
因。第一种学说是导管堵塞学说:在植物导管内，
病原菌大量繁殖并产生果胶酶水解植物细胞中胶
层或原果胶物质，阻断了水分输送，最终导致植物
整株枯萎。第二种学说是毒素学说:植物细胞膜透
性受到来自病原菌产生的一种镰刀菌毒素的损伤，
细胞无法正常运作，生理代谢失调，最终导致植物整
株枯萎［2］。近年来，越来越多的研究结果支持毒素
学说。本研究对榉树枯萎病菌毒素进行初步提取，测
定影响菌株产毒的各项条件，为进一步研究其致病机
理提供基础。
1 材料与方法
1． 1 供试菌株
经分离鉴定的病原尖孢镰刀菌菌株，由南京林业
大学森林病理实验室保存。
1． 2 培养液
(1)Ｒichard培养液:蔗糖 50 g，硝酸钾 10 g，磷酸
二氢钾 5 g，硫酸镁 0． 5 g，氧化铁 10 mg，蒸馏水 1 L;
(2)改良 Czapek培养液:蔗糖 30 g，硝酸钠 2 g，
磷酸二氢钾 1 g，氯化钾 0． 5 g，硫酸亚铁 10 mg，硫酸
镁 10 mg，蒸馏 1 L;
(3)PSC培养液:蔗糖 30 g，蛋白胨 10 g，磷酸二
氢钾 1 g，硫酸镁 0． 5 g，氯化钾 0． 5 g，硫酸亚铁 10
mg，蒸馏水 1 L;
(4)PD培养液:马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，蒸馏
水 1 L;
(5)Fries 培养液:蔗糖 20 g，酒石酸铵 5 g，硝酸
铵 1 g，磷酸二氢钾 1 g，酵母浸膏 1 g，硫酸镁 0． 5 g，
氯化钙 0． 13 g，氯化钠 0． 1 g，蒸馏水 1 L［1］。
1． 3 毒素滤液的制备
菌株于 PDA平板培养基上培养 7 d(25 ℃) ，沿
菌落边缘打菌片(直径 5 mm) ，取菌片 4 枚接种于
100 mL PD培养液中震荡培养(25 ℃，15 d)。将培养
液过滤，滤液离心(3 000 r /min，4 ℃，30 min)，上清
液 4℃保存。
1． 4 培养滤液毒性测定
抑制胚根生长测定参照陆仕华方法［3］:无菌水
清洗榉树种子，氯石灰溶液(1∶ 20)表面消毒 5 min，
无菌水反复冲洗，浸泡 4 h(25 ℃) ，保湿催芽(25
℃)。芽长 2 ～ 3 mm 时，将榉树种子置于培养皿内
(皿内铺灭菌滤纸一张，胚芽向下)，加 5 mL 毒素滤
液，空白为对照。黑暗培养(25 ℃，48 h) ，测定胚根
生长抑制率。每个处理 30 粒种子，3 次重复。
1． 5 产毒条件筛选
1． 5． 1 不同培养液对病菌产毒的影响
将接种供试菌株的以上 5 种不同液体培养基黑
暗振荡培养(25 ℃，15 d)，测定榉树种子胚根生长抑
制率。
1． 5． 2 培养温度对病菌产毒的影响
将接种供试菌株的改良 Czapek 培养液分别于 7
个温度梯度(5，10，15，20，25，30，35 ℃)振荡培养 15
d。每个温度处理设 3 次重复。测定榉树胚根生长抑
制率。
1． 5． 3 培养时间对病菌产毒的影响
将接种供试菌株的改良 Czapek 培养液于 25 ℃
振荡培养，每隔 5 d 取 3 瓶，测定榉树胚根生长抑
制率。
1． 5． 4 培养方式对病菌产毒的影响
将接种供试菌株的改良 Czapek培养液于 25 ℃，
分别在 3 种不同的培养方式(全天振荡培养;每天振
荡 12 h，静止 12 h;全天静止放置)下培养 15 d，每个
处理 3 次重复，测定榉树胚根生长抑制率。
1． 5． 5 pH对病菌产毒的影响
将接种供试菌株的不同 pH 值梯度(HCl 溶液和
NaOH溶液调节 pH值分别为 3，4，5，6，7，8 共 6 个处
理)的改良 Czapek培养液于 25 ℃下震荡培养 15 d，
每个处理 3 次重复，测定榉树胚根生长抑制率。
1． 5． 6 光照对病菌产毒的影响
将接种供试菌株的改良 Czapek培养液(pH值为
7)分别于连续光照(100 lx)，连续黑暗和 12 h明暗交
替处理下 25 ℃震荡培养 15 d，每个处理 3 次重复，测
定榉树胚根生长抑制率。
1． 6 毒素的提取
将接种供试菌株的 PD培养液于 25 ℃下震荡培
养 15 d，过滤取滤液，加入 5%活性炭，5 ～ 6 ℃保存
12 h，过滤取活性炭，浸泡于 10 倍体积热甲醇中，过
滤取滤液，浓缩至褐色，溶于热甲醇(50 mL)中，过滤
取滤液，加入 3 倍体积氯仿，过滤取滤液，蒸干，得粗
毒素。
1． 7 毒素的生物活性测定
1． 7． 1 毒素对榉树胚根的影响
在 1 L 无菌水中加入 1 L 病原物培养滤液所制
得的粗毒素提取物，制成粗毒素原液(100%)。再将
粗毒素原液依次配制成不同质量分数稀释液
森林经营与保护 欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗
林业科技开发 2015 年第 29 卷第 1 期 103
(100%，50%，25%，10%) ，无菌水为对照，对种子胚
根进行处理。2 d 后测定胚根生长抑制率。每个处
理 30 粒种子，3 次重复。
1． 7． 2 毒素对榉树幼苗的致萎性
选取两叶榉树幼苗，清水冲洗干净。切去一小段
根，地下部分保留 1 cm。浸入装有 5 mL 毒素溶液的
试管中(添加 150 μg链霉素，避免细菌污染)，观察统
计榉树苗萎蔫情况。植株反应级别定义见表 1。
表 1 植株反应级别定义
反应级别 症状描述
无反应(－) 植株正常，叶片无萎蔫
轻度反应(+) 叶片轻微下垂或卷曲
中度反应(+ +) 叶片出现卷曲
重度反应(+ + +) 整个叶片卷曲至枯死
2 结果与分析
2． 1 产毒条件的筛选
2． 1． 1 培养液对病原菌产毒的影响
病菌在不同培养液中培养，改良 Czapek 培养液
对榉树种子胚根生长抑制最强，胚根生长抑制率为
65． 2%，其后依次是 Fries 培养液、Ｒichard培养液、PD
培养液和 PSC培养液(表 2)。
表 2 不同培养液对于尖孢镰刀菌产毒的影响 /%
培养基 胚根生长抑制率
改良 Czapek培养液 65． 2 ± 10． 8 A
Fries培养液 44． 3 ± 6． 3 B
Ｒichard培养液 41． 2 ± 7． 1 B
PD培养液 38． 5 ± 3． 5 B
PSC培养液 36． 4 ± 5． 3 B
注:不同大写字母表示 0． 01 水平差异显著。下同。
2． 1． 2 培养温度对病原菌产毒的影响
病菌在不同的培养温度下，改良 Czapek 培养液
对榉树种子的抑制率见图 1。可见该病原菌产毒的
最佳培养温度为 25 ℃。
图 1 培养温度对尖孢镰刀菌产毒的影响
2． 1． 3 培养时间对病菌产毒的影响
病菌在不同的培养时间下，培养液对榉树胚根生
长抑制率的影响见图 2。产毒最适培养时间为 15 d，
对应的胚根抑制率为 68． 3%。
图 2 培养时间对尖孢镰刀菌产毒的影响
2． 1． 4 培养方式对病菌产毒的影响
病菌在 3 种培养方式(全天振荡、振荡 12 h 和静
止培养)下，全天振荡处理培养液对榉树种子抑制率
最高，达 55． 3%。静止培养、振荡 12 h培养处理抑制
率依次降低(表 3)。
表 3 不同培养方式对于尖孢镰刀菌产毒的影响 /%
培养方式 胚根生长抑制率
全天振荡 55． 3 ± 5． 1 aA
静止培养 49． 7 ± 9． 4 bA
振荡 12 h 46． 2 ± 10． 5 bA
注:不同小写字母表示 0． 05 水平差异显著。下同。
2． 1． 5 pH对病菌产毒的影响
病菌分别在 pH 值 3 ～ 8 的条件下培养，滤液对
榉树胚根抑制情况变化不大(图 3) ，说明 pH 值对病
菌的产毒量影响不大。
图 3 pH对尖孢镰刀菌产毒的影响
2． 1． 6 光照对病菌产毒的影响
病菌分别在连续光照、连续黑暗、交替光照下培
养，培养滤液对榉树种子的抑制差异比较明显。连续
光照最有利于产毒，胚根生长抑制率为 69． 8%，3 种
处理多重比较结果见表 4。
表 4 光照对尖孢镰刀菌产毒的影响 /%
光照条件 胚根生长抑制率
连续光照 69． 8 ± 8． 1 aA
连续黑暗 58． 9 ± 4． 7 bB
12 h明暗交替 46． 3 ± 7． 6 cC
欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗 森林经营与保护
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2． 2 毒素的生物活性测定
2． 2． 1 毒素对榉树胚根生长的影响
采用碳吸附法提取病菌培养液粗毒素，制成毒素
粗提液，测定不同浓度稀释液对榉树种子的抑制率。
结果显示，尖孢镰刀菌毒素粗提液对榉树胚根生长抑
制作用显著，浓度越高，作用越强(表 5)。
表 5 毒素粗提液对榉树胚根生长的影响 /%
处理 胚根生长抑制率
100%毒素液 82． 6 ± 5． 6 aA
50%毒素液 70． 5 ± 6． 3 bB
25%毒素液 50． 1 ± 6． 7 cC
10%毒素液 21． 4 ± 8． 2 dD
无菌水 0
2． 2． 2 毒素对榉树幼苗的致萎性
毒素粗提液对榉树幼苗的致萎性结果见表 6。
由表可见 10%毒素液处理榉树幼苗在 8 d内无反应，
而 100%，50%毒素液处理在 4 d时均出现轻度反应，
随后随着时间延长，反应逐渐加重，且 100%毒素液
处理反应要强于 50%毒素液处理;无菌水对照组榉
树幼苗正常。
表 6 毒素粗提液对榉树幼苗的致萎性
处理
处理时间 /d
4 6 8
100%毒素液 + + + + + +
50%毒素液 + + + +
10%毒素液 － － －
无菌水 － － －
3 结论与讨论
毒素是镰刀菌属真菌危害植株的主要途径，但
不同的镰刀菌菌种或菌株产生的毒素种类均不相
同。镰刀菌毒素中已报道的种类有很多，包括:单
端孢霉烯族化合物(Trichothecenes) ，玉米烯酮
(Zearalenone) ，丁烯酸内酯(Butenolide) ，串珠镰刀
菌素(Moniliformin) ，脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxyni-
valenol) ，伏马菌素(Fumonisins)等［4］。本研究只进
行了尖孢镰刀菌毒素的粗提取和生物活性的测定，毒
素的种类和结构还有待于进一步的详细研究。
获得大量的毒素和选择准确、灵敏、可行的毒素
生物活性测定方法是致萎毒素的研究中最重要的两
点。要提取一个特定的菌株的毒素，必须要进行产毒
条件的筛选，而培养基的选择则是研究真菌产毒的首
要工作。不同的培养基直接导致产度量的差异。例
如 Czapek培养液更适宜棉花黄萎病菌生成毒素［5］，
改良 Ｒichard 培养基更适宜水稻纹枯病菌生成毒
素［6］，在 MYＲOTT 和 MOSS 液体培养基中禾谷镰刀
菌可生成脱氧雪腐镰刀菌烯醇，而在 PD 培养基中则
不生成［7］。菌株产毒受到其他环境条件的影响也很
大。大豆根腐病的研究得出，大豆根腐病病原茄病镰
刀菌 25℃振荡培养 15 d 产毒量最大，培养基和光照
对其影响不大［8］。Pathre 等［9］研究认为禾谷镰刀菌
在 12 ～ 15 ℃适宜产毒，陆仕华等［10］则表示 25 ～ 28
℃最适宜禾谷镰刀菌产毒。Miller［7］研究表明禾谷镰
刀菌产生毒素的最佳 pH 值为 7 ～ 8，陆仕华等［10］的
研究认为 pH 5 ～ 8 时产毒量达到最大。徐雍皋等［11］
研究显示禾谷镰刀菌在培养前期，静止培养产毒能力
弱于振荡培养，到培养后期，静止培养产毒能力强于
振荡培养。本研究通过对培养液、培养温度、培养时
间、培养模式、培养环境酸碱度以及光照与否 6 项指
标进行筛选，最终选择使用改良 Czapek培养液，在 25
℃下，持续光照，连续振荡，pH =7 的培养环境下培养
病菌，可以收获到较多的毒素。
本研究中采用榉树种子胚根生长抑制测定法对
榉树枯萎病病原物尖孢镰刀菌毒素进行了生物活性
测定。结果表明:该毒素对榉树胚根有明显的抑制作
用，并且毒素对榉树幼苗有致萎作用。毒素的浓度越
高对榉树幼苗的致萎性也越强。
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(责任编辑 田亚玲)
森林经营与保护 欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗