全 文 ：首都师范大学学报(自然科学版)第 19卷　第 1期
1998 年 3 月
Journal of Capital Normal University
(Natural Science Edition)
Vol.19 , No.1
Mar.　1998
收稿日期:1997-03-13
＊国家自然科学资金资助项目
＊＊本文联系人
满江红鱼腥藻 glnA启动子/GUS 嵌合质粒
在烟草中的表达＊
吴燕川＊＊
(首都医科大学宣武医院多肽室)　
刘祥林　印莉萍　吴晓强　邱泽生　赵微平
(首都师范大学生物系)
摘 要
　　将满江红鱼腥藻 glnA启动区与 GUS 报告基因连接 , 构成表达载体并导入烟草 , 在茎 、叶中得
到表达.这一结果为研究原核蓝藻与高等植物间转录因子识别 、基因表达调控提供了有价值的信
息 ,同时为构建实用载体开拓了新路.
关键词:满江红鱼腥藻 , 启动子 ,烟草 , 基因表达.
中图分类号:Q949.22.
满江红鱼腥藻 Anabaena azollae 是与蕨类植物Azolla 存在一种长期共生关系的固氮丝状
体蓝藻 ,是具植物型放氧光合作用的原核生物.近十年来 ,对蓝藻的植物型放氧作用等特性研
究较多 ,根据蓝藻与叶绿体的 rRNA 、tRNA序列的同源性 、转录 、翻译机制等都支持叶绿体的
内共生起源学说[ 1] .
本文介绍满江红鱼腥藻(Anabaena azollae Aac)谷氨酰胺合成酶基因(glnA)启动子驱动
的GUS基因表达载体的构建 ,将此表达载体导入烟草中 ,经 GUS组织化学检测在转基因烟草
的叶 、茎中均得到阳性结果 ,初步证明满江红鱼腥藻 glnA启动子在烟草中能启动 GUS基因表
达 ,为基因表达调控和转录因子识别的研究以及实用载体的构建打下基础.
1　材料和方法
1.1　植物材料
烟草(Nictina tabacum W38)无菌苗继代培养于 MS0培养基中 ,其叶片作为转化受体.
1.2　藻种和培养
Anabaena azol lae Aac 由中科院植物所施定基教授惠赠.培养方法参考文献[ 2] .
1.3　菌株
E .coli DH5α:双元表达载体的受体菌.
LBA4404:含 Ti质粒 pRAL4404 ,用于植物的转化.由北京大学林忠平教授惠赠.
1.4　质粒及其提取和纯化
pBL 4:为满江红鱼腥藻 glnA 启动子插入 pBluescript ⅡKS+质粒的多克隆位点得到的重组
子.本室保存.
pBII01:含土壤农杆菌 Ti质粒 T-DNA的左右边界区 ,具无启动子的GUS报告基因.由北
京大学林忠平教授惠赠.
质粒的提取及纯化参考文献[ 3] .
1.5　表达载体的构建
构建中所涉及的方法按文献[ 3]进行.
1.6　烟草的转化
基因枪法参考文献[ 4] ,叶盘法参考文献[ 5] .
1.7　GUS组织化学检测
方法参考文献[ 6] .
图 1　表达载体的构建过程
2　结　果
表达载体的构建过程见图 1 ,用 BamHI
和 EcoRV 双酶切下质粒 pBL4 中约 0.4 kb的
g lnA 启动子后 ,经 LMP 回收 ,用 T4DNAligase
定向连接到用 BamHI 和 SmaI 双酶切开的
pBI101载体的GUS基因上游 ,得到的表达载
体命名为 pI L.经卡那霉素抗性筛选 、酶切鉴
定及 Southern 杂交证明 pIL 为含有满江红鱼
腥藻 glnA启动子片段的重组质粒(图 2).利
用冻融法将 pIL 质粒导入 土壤农杆菌
LBA4404 ,再用叶盘法 ,以 LBA4404/pIL 侵染
烟草叶片 ,侵染后的烟草叶片在 MS0 固体培
养基上预培养两天 ,取出置于分化培养基(含
Km 50μg/ml ,Carb 500μg/ml)上 ,三周后分化
出芽 , 再于生根培养基上生长 , 两周后长出
根.得到的转基因烟草 ,从形态上与未转化的
正常烟草相比 ,有明显的差异 ,前者的叶片薄 、颜色浅 ,生长早期叶子细长 、丛生 ,似乎失去了顶
端优势生长 ,晚期叶子长宽 、平展 ,根细长 ,侧根多.这些形态上的变化 ,可能与外源基因随机插
入到烟草染色体 DNA上而影响形态建成的基因正常表达有关(图 3)对转基因烟草植株 ,分别
取其根 、茎 、叶置于显色底物 X-gluc 液中处理 ,经 GUS组织化学检测 ,在光学显微镜下 ,观察
到在茎 、叶中有兰色沉淀物出现 ,表明 GUS 基因表达(图 4),而在根中未发现.同期利用基因
枪将 pIL 质粒分别导入烟草叶和根 ,进行瞬时表达检测 ,同样只在叶中观察到GUS 表达活性 ,
根部没有检测到 ,与叶盘法转化烟草结果一致 ,而用 CaM 35S 启动子/GUS 质粒转化的烟草 ,
在叶和根部均有活性表达(待发表),说明满江红鱼腥藻 glnA 启动子具有组织专一性 ,只在绿
色组织(叶 、茎)中表达 ,这一结果恰恰支持了叶绿体起源的内共生学说.
75第 1 期 吴燕川等:满江红鱼腥藻 g lnA 启动子/GUS 嵌合质粒在烟草中的表达
图 2　质粒 pIL 、pBI101 、pBL4 酶切图谱比较
1.pBI101/ BamH I+EcoRI.2-3.pIL/ BamHI+EcoRI.4.lambda DNA/HindIII.
5.pI L/ EcoRI 6.pBI101/ EcoRI.7.pBL4/ EcoRI 8.pBL4/ BamH I+EcoRI
图 3　含满江红鱼腥藻 glnA 启动子/G US的转基因烟草与未转化烟草的形态比较
图中:A 未转化正常烟草;B 转基因烟草
3　讨　论
高等植物的谷氨酰胺合成酶(GS)是同化氨途径中的关键酶.多数研究者认为 GS 是由一
个小的基因家族编码 ,在不同器官 、组织和亚细胞内以某些不同的同功酶形式存在 ,如:GSn
(根和种子);GS1(细胞质);GS2(叶绿体).GS 基因的表达既有组织专一性 ,又受环境和发育因
子的影响 ,是分子生物学研究基因专一性表达和时空表达的好模式[ 7] ,满江红鱼腥藻 glnA启
动区在烟草的绿色组织中被识别表现活性目前尚未见报道 ,这一结果不但为研究原核蓝藻和
高等植物的基因表达调控提供了有价值的信息 ,还提供了结构简单 、易于操作的研究材料.序
列分析表明 ,满江红鱼腥藻 glnA启动区带有 E .coli-l ike 和 ni f-l ike 两个启动子 ,而在转基因
烟草中对蓝藻 glnA启动子识别的反式作用因子及其识别位点是令人感兴趣的问题 ,对其进行
深入的探讨 ,有希望得到更大意义的结果.
启动子的研究一直是基因工程研究中的热点.近几年来 ,关于启动子的通用性逐渐引起人
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图 4　满江红鱼腥藻 glnA启动子/GUS在转基因烟草中的组织化学定位(100X)
图中:A叶;B茎;C 对照(未转化烟草叶)
们的注意.秦松等[ 8]用基因枪将 pBI121 质粒导入海带和裙带菜获得瞬时表达结果 ,证明了
CaM35S 启动子在褐藻中的通用性;Cheney 等[ 9] 、王素娟等[ 9]证实了 CaM35S启动子在红藻
中的通用;另外 ,Cheney 等[ 9]还发现了 nos启动子的通用 ,可见病毒 、细菌及真核生物间启动
子的通用性是存在的.满江红鱼腥藻 glnA启动区在烟草中的活性表达 ,说明蓝藻启动子的通
用性.这就为我们构建更广泛的实用载体开拓了一条新路.
参 考 文 献
1　王业勤 ,徐旭东 , 黎尚豪.蓝藻分子遗传学十年研究进展.水生生物学报 , 1991 , 15(4):356 ～ 367
2　C Peter Wolk , Avigad Vonshak , Patricia Kehoe e t al.Construction of shuttle vector capable of conjugative
transfer from E .coli to nitrog en-fixing filamentuous cyanobacteria.Proc Natl Acad Sci USA , 1984 , 81:
1561～ 1565
3　J Sambrook , E F Fritsch , T Maniatis.Molecular Cloning:A laboratory Manual , 2nd ed , Cold Spring
Harbo r Labora tory Press.New York , 1989
4　John C Sanford , Theodo re M K lein , Edward D Wolf et al.Deliv ery of Substances into cells and Tissue
Using a Particle Bombardment Process.Par ticulate Sci Technol , 1987 , 5:27～ 37
5　Horsh R B , Fry J B , Hoffmann N L et al.A Simple and general method for transferring genes into
plants.Science , 1985 , 227:1229 ～ 1231
6　Jefferson R A , Kavanagh T A , Bevan MW.GUS fusion:β-g lucoronidase as a sensitive and versatile gene
fusion marker in higher plants.EMBO J , 1987 , 6:3901 ～ 3907
7　印莉萍 , 刘祥林 ,林忠平.植物谷氨酰胺合成酶基因以及基因表达 ,生物工程进展 , 1995 , 15(2):36 ～
41
8　秦松 , 张健 ,李文斌等.用基因枪将 GUS 基因导入褐藻细胞中表达.海洋与湖沼 , 1994 , 25(4):353 ～
356
9　秦松 ,严小军 , 曾呈奎.藻类分子生物技术两年评———基因工程及其上游———分子遗传学 , 海洋与湖
沼 , 1996 , 27(1):103 ～ 111
77第 1 期 吴燕川等:满江红鱼腥藻 g lnA 启动子/GUS 嵌合质粒在烟草中的表达
The Expression of Anabaena azollae glnA Promoter/GUS
Chimeric Gene in Transgenic Tobacco
Wu Yanchuan
(Polypept ide lab of Xuanwu Hospital , Capi tal University of M edicine Sciences)
Liu Xiang lin　Yin Liping　Wu Xiaoqiang　Qiu Zesheng　Zhao Weiping
(Department of Biology , Captial Normal University)
Abstract
A binary vector w as constructed by inserting Anabaena azollae glnA promoter upst ream of
GUS reporter gene in an orientation.This expression vector w as t ransfo rmed into tobacco genom-
ic DNA via Agrobacterium tumefaciens LBA4404-mediated procedure.The transgenic tobaccos
w ere obtained and the GUS activities in tobacco leaves and stems were examined histochemically .
The result provided valuable information fo r the recognition of t ranscriptional factors 、 the regula-
tion of genes expression betw een prokaryo tic cynobacteria and higher plant.This opens a new
w ay for the const ruct ion of practical vectors.
Key words:Anabaena azol lae , promoter , tobacco , gene expression.
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