全 文 ：· 1427 ·中华中医药杂志(原中国医药学报)2016年4月第31卷第4期 CJTCMP , April 2016, Vol . 31, No. 4
·研究报告·
不同产地栽培及野生喜马拉雅紫茉莉的
分子鉴定研究
林辉1，牟银艳2，赵婷3，仁青加4，李佳慧3，彭莲3，闫永红3
（1华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部，武汉 430030；2利川市民族中医院，湖北利川 445400；
3北京中医药大学，北京 100029；4西藏藏医学院，拉萨 850000）
摘要：目的：利用分子技术测定喜马拉雅紫茉莉的DNA分子序列，比较不同产地栽培及野生喜马拉雅紫茉
莉的差异，为栽培品的合理使用提供依据。方法：提取喜马拉雅紫茉莉药材的DNA，以ITS序列通用引物进行PCR
扩增，扩增产物经纯化后测序，利用NCBI数据库及MEGA 5.0等软件对数据进行分析。结果：喜马拉雅紫茉莉样
品间DNA遗传距离差异较小，在0.000-0.040之间；样品分子间碱基变异位点少；系统发育树中，所有样品聚为一
大类，Boerhavia spicata.聚为一类，二者显著分开。而安国XZAGZP及甘南州GSGLYS聚为一类，其余样品聚为一
类。结论：不同产地栽培及野生的喜马拉雅紫茉莉药材在DNA分子序列方面的差异较小，为栽培品的合理使用提
供了理论依据。
关键词：喜马拉雅紫茉莉；分子鉴定；ITS序列；系统发育树
基金资助：北京市青年英才计划（No.50010402/0101324003）
Molecular identifi cation of wild and cultivated Mirabilis himalaica in different districts
LIN Hui1, MOU Yin-yan2, ZHAO Ting3, REN Qing-jia4, LI Jia-hui3, PENG Lian3, YAN Yong-hong3
( 1Department of Pharmacy, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan
430030, China; 2Lichuan National Hospital of TCM, Lichuan 445400, China; 3Beijing University of Chinese Medicine,
Beijing 100029, China; 4Tibetan Traditional Medical College, Lasa 850000, China )
Abstract: Objective: To compare the differences of wild and cultivated Mirabilis himalaica in different districts by
molecular techniques and offer the basis for the use of cultivated Mirabilis himalaica. Methods: DNA was extracted from wild and
cultivated Mirabilis himalaica, then PCR with ITS universal primers. The PCR products were purifi ed, then directly sequenced. In
the end, the data were analyzed by NCBI database and MEGA 5.0 software. Results: The genetic distance in Mirabilis himalaica
from different habitats ranged from 0.000 to 0.040. The variable sites was small. The phylogenetic trees suggested that there were
close genetic relationship among Mirabilis himalaica. XZAGZP and GSGLYS were clustered into one group, which comprised
another clade. Conclusion: There is no signifi cant difference in the variability of Mirabilis himalaica from different districts,
which is a foundation for the rational use of cultivated materials.
Key words: Mirabilis himalaica; Molecular identifi cation; ITS sequence; Phylogenetic tree
Funding: Youth Talent Plan of Beijing (No.50010402/0101324003)
通讯作者：闫永红，北京市朝阳区北三环东路11号北京中医药大学教务处，邮编：100029，电话：010-64286447，E-mail：lxdyyh@yeah.net
喜马拉雅紫茉莉为紫茉莉科植物喜马拉雅紫茉莉Mirabilis
himalaica（Edgew.）Heim.的干燥根。最早记载于藏医学著作
《月王药诊》[1]中。藏医学认为该药具有引黄水、益肾滋补、利
尿排石等功效，作为常用藏药之一，应用广泛。野生喜马拉雅紫
茉莉一直是该药材的主要来源，在长时间应用过程中，其功效
是值得信赖的。但是，由于需求的增加，现在市场上流通的药
材一部分为栽培品。药材中药效物质是否会随着生长环境的改
变而改变不得而知，有的药材因为生长环境的改变导致其基因
发生改变，从而导致次生代谢产物（有效物质）的量或类型发
生改变，使得其临床应用的安全性、有效性不得而知。
传统的鉴定方法，如感官评价、显微鉴定和理化鉴定均存
在不同程度的局限性。而分子鉴定因其快速和准确的特点，得
到了更加广泛和有效的应用。植物核糖体DNA中的内转录间
隔区（ITS区）序列是中度保守区，进化速率较快，既具有核苷
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酸序列高度变异性又有长度上的保守性，可以提供较丰富的变
异位点和信息位点，广泛用于近缘属间、属内种间的分子系统
及鉴别[2]。如彭禄等[3]通过独活17个种、共26个样本的ITS序列
分析，为国内中药市场上的常见药——独活的分子鉴定提供依
据；林韵涵等[4]对药材桃仁及其近缘种进行ITS2分子鉴定，其NJ
树结果显示，桃仁的两基原物种聚为一枝，并与其他近缘种明
显分开；程小丽等[5]利用NCBI核酸数据库中ITS序列鉴定紫荆皮
商品药材及其混淆品种，为保证紫荆皮药材质量提供了依据。
因此，本文利用分子鉴定技术对不同产地栽培及野生喜马
拉雅紫茉莉药材进行鉴定，观察药材分子间的差别，为栽培品
的合理应用提供依据。
材料
1. 仪器 PCR仪（Biomerta，德国），水平电泳槽（君意东
方，中国），电泳仪（BioRed，美国），SIGMA3K-15低温高速离
心机（德国Sigma有限公司），BioRed GEL DOC 2000凝胶成像
扫描系统，GEANT雪花制冰机，BP 110S电子天平（万分之一，
Sartorius），10、20、100μL及1mL微量移液器（Gilson）及相应
规格的吸头。
2. 试剂与耗材 植物基因组DNA提取试剂盒（博迈德生
物公司），液氮，无水乙醇，r-Taq酶、dNTP、10×Taq DNA聚
合酶缓冲液（100mmol/L Tris-HCl pH值9.0，500mmol/L KCl，
1%Trion X-100）及MgCl2（均购自Takara），引物（上海生工合
成），EDTA、硼酸、醋酸、琼脂糖及溴化乙锭（EB）（均购于
Biotopped）。
3. 药材 收集17批次不同产地栽培及野生喜马拉雅紫茉莉
药材，所有样品经北京中医药大学闫永红教授鉴定为Mirabilis
himalaica（Edgew.）Heim.的干燥根。样品的详细信息见表1。
方法
1. DNA的提取 将样品粉碎，过4号筛，称取50mg加液氮
研细，利用博迈德生物公司的广谱植物基因组DNA快速提取试
剂盒提取药材，依据说明书提取总DNA。
2. ITS扩增 采用扩增ITS序列的通用引物[6]，ITS上游引物
P1：5’-AGA AGT CGT AAC AAG GTT TCC GTA GG-3’；ITS下
游引物P4：5’-CCT CCG CTT ATT GAT ATG C-3’。
PCR反应体系为：10×PCR Buffer（Mg2+ Free）5μL，MgCl2
3μL，dNTP 4μL，Taq酶0.25μL（5U/μL），引物P1和P4各2μL
（20μmol/L），模板DNA 2.5ng，灭菌蒸馏水加至50μL。扩增
程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延
伸1min，35个循环后，72℃延伸10min。
PCR产物经1%的琼脂凝胶切胶并采用DNA凝胶回收试剂
盒回收纯化后，由上海生工生物工程有限公司测序部测序。
利用Contig1软件对测序获得的正、反向序列进行拼接，根据
BLAST所获相似度最高物种的ITS序列边界，截取待鉴定物种的
ITS序列，然后利用DNAman软件对待鉴定样品的ITS序列和参比
ITS序列进行相似度分析，利用MEGA 5.0软件作进化树分析。
3. 分子鉴定
3.1 相似度比较及参比序列的筛选 通过NCBI对校对后的
样品序列进行检索，下载相似度99%以上的序列，见图1。对相
似度大于99%序列进行评价，利用Meg 5.0软件对所有序列进行
聚类分析，观察聚类与物种基原是否合理，筛选最优参比序列
（登录号为DQ317101）。以其ITS 1、ITS 5.8及ITS 2对待检样品
进行修正，已修正后的序列作为后续分析所使用的序列。
图1 NCBI数据库中与待鉴定药材相似度最高的ITS序列信息
3.2 系统发育树的构建 选择该属植物的近缘属植物（紫
茉莉科黄细心属Boerhavia spicata.）为外类群，利用Meg 5.0软
件构建待鉴定样品与参比序列的系统发育树，根据聚类结果进
行鉴定。
结果
利用Meg 5.0软件观察待检样品遗传距离、碱基序列不同
之处。遗传距离，是衡量样品间若干性状综合遗传差异大小的
指标，遗传距离的大小反应了样品间分子差异的程度[7]。遗传
表1 喜马拉雅紫茉莉样品一览表
编号 产地 野生/栽培
GSGLYS1 甘肃甘南州 野生
GSGLYS2 甘肃甘南州 野生
GSGLYS3 甘肃甘南州 野生
XZLSYS1 拉萨夺底沟 野生
XZLSYS2 拉萨夺底沟 野生
XZLSYS3 拉萨夺底沟 野生
XZLSYS4 拉萨夺底沟 野生
XZLSYS5 拉萨夺底沟 野生
XZLSYS6 拉萨夺底沟 野生
XZLSYS 拉萨市售 野生
XZAGZP 安国市售（西藏产） 栽培
XZZLYS 西藏扎浪县 野生
XZGGZP3 西藏贡嘎县 栽培
XZGGZP4 西藏贡嘎县（基地） 栽培
XZGGZP1 西藏贡嘎县（基地） 栽培
XZGGZP2 西藏贡嘎县（基地） 栽培
XZLZYS 西藏林芝 野生
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距离图（见图2）显示各样品间遗传距离在0.000-0.040之间，
而编号为XZAGZP及GSGLYS的样品遗传距离相对较大，均为
0.035。碱基变异位点的多少直接说明了分子间的差异[8]，从图
3可发现，所测样品间碱基变异位点较少。系统发育树（见图4）
图谱显示，所有样品聚为一大类，Boerhavia spicata.聚为一类，
二者显著分开。而安国XZAGZP及甘南州GSGLYS聚为一类，其
余样品聚为一类。
讨论
不同产地野生与栽培喜马拉雅紫茉莉药材分子遗传距离
小、碱基突变较少，因此，从分子方面得出不同产地栽培及野
生喜马拉雅紫茉莉基因变异较少，为栽培品的使用提供理论依
据。但是基因型相同并不能说明其功效一样，环境因素及其他
因素也会影响药材中药效物质的种类和含量。因此，必须利用
化学成分结合药理实验来进行分析，得出令人信服的结果。而
安国XZAGZP、甘南州GSGLYS与其他样品比较，碱基变异位点
较多（图3），在系统发育树中也分成了不同类（图4），差异明
显，应在后续的深入研究中找到原因。
喜马拉雅紫茉莉药材的生长环境及分布区域在古代藏著
作中鲜有提及，近代的《中国藏药》和《藏药志》在这一方面做
了补充，它们记载该药材生长在海拔约700-3 300m的山坡路旁
或草丛中，分布于甘肃、云南、四川、西藏等地。因此本文搜集
甘肃及西藏多产地的该药材，应用分子鉴定技术鉴定其异同，
为该药材非道地产区及栽培品的合理使用提供依据。
随着藏药资源的不断推广，野生藏药材难以满足市场的需
求，人们必须通过栽培来获得足够的资源，而对于藏药材的质
量控制方面比较薄弱，不能对其质量进行有效地控制。因此，
在传统研究的基础上，研究者必须引进先进技术对其质量进行
评价，以促进藏药的现代化，更好地为人民的生命健康服务。
参 考 文 献
[1] 毛继祖,马世林.月王药诊.上海:上海科学技术出版社,2012:16
[2] 刘静,何涛,淳泽.基于ITS序列的中国药用石斛及其混伪品的
分子鉴定.中国中药杂志,2009,34(22):2853-2856
[3] 彭禄,余岩,王志新,等.基于ITS序列对独活17个种的分子鉴定.
中草药,2013,43(12):1648-1653
[4] 林韵涵,刘霞,胡志刚,等.基于ITS2序列鉴定桃仁及其近缘种.
世界科学技术-中医药现代化,2013,15(3):429-434
[5] 程小丽,廖彩丽,刘春生,等.基于NCBI核酸数据库的紫荆
皮混淆品种华中五味子的DNA鉴定研究.中国中药杂志,
2012,37(17):2534-2537
[6] Takaiwa T J,Oono K,Sugiura M.Nucleotide sequence of the17S-25S
spacer region from rice rDNA.Plant Mol Biol,1985,4:355
[7] 夏至,冯翠元,高致明,等.黄芩及其同属近缘种的DNA条形码
鉴定研究.中草药,2014,44(1):107-112
[8] 吴志刚,范传颍,包晓青,等.山药种质资源核糖体rDNA-ITS区
序列分析.中草药,2014,44(8):1136-1142
（收稿日期：2015年2月11日）图4 喜马拉雅紫茉莉样品和参比序列的系统发育树
图2 不同批次药材的遗传距离
图3 喜马拉雅紫茉莉样品碱基变异位点