全 文 ：第 32 卷 第 2 期
2016 年 4 月
哈 尔 滨 商 业 大 学 学 报( 自然科学版)
Journal of Harbin University of Commerce ( Natural Sciences Edition)
Vol． 32 No． 2
Apr． 2016
收稿日期:2015 － 08 － 10．
作者简介:齐欣欣(1990 －)，女，硕士，研究方向:食品分析．
假酸浆多糖的酶法提取及纯化工艺的研究
齐欣欣，王 遂
(哈尔滨师范大学 化学化工学院，哈尔滨 150025)
摘 要:采用正交设计法进行试验，以多糖的提取率作为评价指标，用木瓜蛋白酶法从假酸浆籽中提
取假酸浆多糖．确定了木瓜蛋白酶的最佳提取工艺为:酶用量 3%，pH = 7． 5 温度 55 ℃，提取时间 50
min． 多糖提取率为 6． 02% ．再将提取的粗多糖经脱蛋白、脱色等一系列工艺进行纯化，确定了假酸浆
多糖的最佳纯化工艺，在此条件下测得多糖的含量为 80． 6%，脱蛋白率为 77． 33%，脱色率为 70． 2% ．
关键词:假酸浆多糖;木瓜蛋白酶;提取;纯化
中图分类号:TQ281 文献标识码:A 文章编号:1672 － 0946(2016)02 － 0220 － 05
Extraction of seeds of nicandra physaloides by enzymatic
method and its purification
QI Xin-xin，WANG Sui
(School of Chemistry and Chemical Engineering，Harbin Normal University，Harbin 150025，China)
Abstract:Nicandra polysaccharide was extracted from the seed of nicandra physaloides by
papain method． Using the orthogonal design，the optimal method was confirmed，which was
as follows:the enzymatic concentration was 3%，the extraction pH was 7． 5，the extraction
temperature was 55 ℃，and the extraction time was 50 min． The extraction rate of polysac-
charide was 6． 02% ． Then the treatments of deproteinization，decolorization and so on were
carried out for purifying to confirm the optimal purification process of polysaccharide． Under
these conditions，the content of polysaccharide reached to 80． 6%，the protein removal rate
reached to 77． 33%，and the decolorization rate reached to 70． 2% ．
Key words:nicandra physaloides;papain;extraction;purification
假酸浆籽是假酸浆的种子，而假酸浆是一种中
草药，属茄科植物．假酸浆主要产于云南、贵州和广
西等地，经常生长于田边、荒地和房屋周围，有野生
的，现在也有人工种植的，其整株草都可以入药，药
效显著，可以镇静、祛痰、清热、解毒等，它可治疗感
冒、精神病、狂犬病、风湿痛、疥癣等病症．假酸浆也
是一种食品原料，可以制作凉粉(又称冰粉)，消暑
解渴、消炎利尿，是一种夏季的保健食品［1 － 3］．
多糖对人体具有很高的药用价值，经大量研究
发现，按照多糖的来源可以分为三大类:植物、动物
和微生物多糖．其中植物多糖是由许多相同或不同
的单糖所组成的化合物，这些单糖又是以 α －或 β
－糖苷键所组成的．自然界中几乎所有的植物体中
都含有多糖，多糖可以维持生命的种种生理机能，
是一切有机体必不可少的一种成分．它具有显著的
药用功效，如抗肿瘤、抗病毒、降血糖、抗炎、抗补体
等作用，且毒副作用低，安全性强，近年来其在医药
领域的应用较为广泛［4 － 6］． 用酶法［7 － 11］从假酸浆
籽中提取多糖的工艺还鲜见报道，本实验采用正交
设计法用木瓜蛋白酶法从假酸浆籽中提取多糖，从
而确定了木瓜蛋白酶的最佳提取工艺，并对粗多糖
进行进一步的纯化．
1 材料与方法
1． 1 材料与仪器
1． 1． 1 主要原料
假酸浆籽(宿州市禾丰农业科技开发有限公
司)．
1． 1． 2 试剂
苯酚、浓硫酸、3，5 －二硝基水杨酸、丙三醇、氢
氧化钠、考马斯亮蓝 G － 250、牛血清蛋白、无水乙
醇、磷酸、酪氨酸、盐酸、碳酸钠、福林一酚、三氯乙
酸、干酪素、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、木瓜蛋白酶、
葡萄糖．
1． 1． 3 实验主要仪器与设备
DHG －9925A型电热恒温干燥箱(上海西箭仪
器有限公司)、R － 205 旋转蒸发仪(上海申胜生物
技术有限公司)、HC －2064 型离心机(科大创新股
份有限公司中佳分公司)、752 型紫外可见分光光
度计(上海光谱仪器有限公司)、SHB － B88 型循环
水式多用真空泵(郑州长城仪器有限公司)、SHA
－ C型水浴恒温振荡器(上海医疗器械五厂)、FW
－100 型高速万能粉碎机(天津泰斯特仪器有限公
司)、电子天平(上海奔普科学仪器有限公司)．
1． 2 实验方法
1． 2． 1 提取假酸浆多糖的工艺流程
木瓜蛋白酶法提取多糖→浓缩提取液→乙醇
沉淀→干燥→假酸浆粗多糖→蒸馏水溶解→木瓜
蛋白酶法和 Sevag 法除蛋白→大孔树脂脱色→干
燥→假酸浆精多糖→蒸馏水溶解→DEAE －纤维素
柱层析→浓缩→干燥→假酸浆多糖纯品．
1． 2． 2 采用木瓜蛋白酶法提取多糖
1)对木瓜蛋白酶进行酶活测定
①标准曲线的绘制
以酪氨酸为标准品，分别以酪氨酸质量浓度、
吸光度为横纵坐标，绘制出标准曲线，如图 1 所示．
②样品的测定
准确称取 1 g酶粉用缓冲溶液浸泡，再取滤液
稀释，分别取 1 mL 滤液于四支试管，一管作对照，
其余三管加入一定质量浓度酪蛋白，水浴后向滤液
中再加入福林一酚和碳酸钠溶液显色，于 680 nm
下测 A680 ．
根据酶活计算公式:(A － A0)× K × V × N /(t ×
W)，测得木瓜蛋白酶活力为 14 927 u /g．
2)单因素试验
①酶浓度对假酸浆多糖提取率的影响
图 1 酪氨酸标准曲线
准确称取 1 g 假酸浆籽粉末，加入一定量的
pH =4． 5 的磷酸氢二钠 －柠檬酸缓冲溶液，分别加
入 0． 5%、1． 0%、1． 5%、2． 0%、2． 5%、3． 0%的木
瓜蛋白酶，在 50 ℃水浴中震荡 80 min 后抽滤，取
滤液测量并计算出多糖提取率，确定最适酶浓度．
②反应 pH值对假酸浆多糖提取率的影响
准确称取 1 g假酸浆籽粉末，分别加入一定量
的 pH值为 3． 5、4． 5、5． 5、6． 5、7． 5 的磷酸氢二钠
－柠檬酸缓冲溶液，再加入 3%的木瓜蛋白酶，在
50 ℃水浴中震荡 80 min 后抽滤，取滤液测量并计
算出多糖提取率，确定反应的最适 pH值．
③反应温度对假酸浆多糖提取率的影响
准确称取 1 g 假酸浆籽粉末，加入一定量的
pH值为 6． 5 的磷酸氢二钠 －柠檬酸缓冲溶液，加
入 3%的木瓜蛋白酶，分别在 25、35、45、55、65 ℃
水浴震荡 80 min 后抽滤，再取滤液测量并计算出
多糖提取率，确定反应的最适提取温度．
④反应时间对假酸浆多糖提取率的影响
准确称取 1 g 假酸浆籽粉末，加入一定量的
pH值为 6． 5 的磷酸氢二钠 －柠檬酸缓冲溶液，加
入 3%的木瓜蛋白酶，分别在 55 ℃水浴中震荡 20、
50、80、110、140 min 后抽滤，再取滤液测量并计算
出多糖提取率，然后确定反应的最适提取时间．
3)正交试验
根据单因素试验结果，采用 L9(3
4)正交表进
行试验，以多糖提取率为评价指标，考察木瓜蛋白
酶浓度(A)、pH值(B)、反应温度(C)和反应时间
(D)四个因素之间的影响，最终确定了木瓜蛋白酶
的最佳提取工艺参数(见表 1)．
表 1 木瓜蛋白酶提取法正交试验因素水平表
水平
因 素
A酶用量
/%
B pH值
C提取
温度 /℃
D提取
时间 /min
1 2． 0 5． 5 55 20
2 2． 5 6． 5 65 50
3 3． 0 7． 5 75 80
·122·第 2 期 齐欣欣，等:假酸浆多糖的酶法提取及纯化工艺的研究
1． 2． 3 总糖含量的测定
采用苯酚硫酸法［12］测定，以葡萄糖为标准品，
分别以葡萄糖质量浓度、吸光度为横纵坐标，绘制
出标准曲线，如图 2 所示．
1． 2． 4 还原糖含量的测定
采用 3，5 －二硝基水杨酸比色法测定，以葡萄
糖为标准品，分别以葡萄糖质量浓度、吸光度为横
纵坐标，绘制出标准曲线，如图 3 所示．
1． 2． 5 多糖含量及提取率的测定
多糖的质量 =总糖质量 －还原糖质量
多糖的含量(%)=(多糖质量 /粗多糖质量)
× 100%
多糖的提质量分数(%)=(多糖质量 /子实体
干重)× 100%
图 2 总糖质量浓度的标准曲线
图 3 还原糖质量浓度的标准曲线
1． 2． 6 蛋白质质量浓度的测定
采用考马斯亮蓝 － G250 法［13］测定，以酪氨酸
为标准品，分别以酪氨酸质量浓度、吸光度为横纵
坐标，绘制出标准曲线，如图 4 所示．
图 4 蛋白质标准曲线
1． 2． 7 脱蛋白方法［14 － 17］
采用木瓜蛋白酶法和 Sevag 法联用:按酶法的
最佳提取工艺与 Sevag 法联用对假酸浆粗多糖进
行脱蛋白，最后确定蛋白的去除率和多糖的保留
率．
1． 2． 8 脱色方法［18 － 19］
采用 AB －8 型大孔吸附树脂脱色法
单因素试验
1)大孔树脂的用量对多糖脱色的影响
配制一定浓度的多糖溶液，向其中加入 AB －8
型大孔树脂，树脂与其质量体积比依次为 1%、
2%、3%、4%、5%，30 ℃水浴中保温 4 h后离心，然
后取上清液测定吸光度，再计算出脱色率及多糖保
留率．重复 3 次，取平均值．［20］
2)反应的温度对多糖脱色的影响
在多糖溶液中加入质量体积比 4%的 AB － 8
型大孔树脂，分别在 20、30、40、50、60 ℃温度下脱
色 4h后离心，然后取上清液测定吸光度，再计算出
脱色率及多糖保留率．重复 3 次，取平均值［21］．
3)反应的时间对多糖脱色的影响
多糖溶液中加入质量体积比 4%的 AB － 8 型
大孔树脂，在 30 ℃下，分别脱色 0． 5、1． 0、1． 5、2．
0、2． 5、3． 0、3． 5、4． 0 h 后离心，然后取上清液测定
吸光度，再计算出多糖脱色率及多糖保留率． 重复
3 次，取平均值．
4)正交试验
根据单因素试验结果，进行正交试验，考察树
脂用量 A、脱色温度 B 和脱色时间 C 三个因素之
间的影响，以脱色率为考察指标，试验因素水平设
计及结果见表 2．
表 2 正交试验因素水平表
水 平
因 素
A树脂用量 /% B提取温度 /℃ C提取时间 /h
1 3 20 1． 0
2 4 30 1． 5
3 5 40 2． 0
1． 2． 9 多糖的分级
DEAE －纤维素柱层析:将脱蛋白、脱色后的假
酸浆粗多糖溶液醇沉后，再配成质量分数 4%的多
糖溶液上 DEAE － 52(OH 型)纤维素柱，分别用 0
～ 0． 8 mol /LNaCl 进行洗脱，流速 0． 6 mL /min，以
每管 5 mL 分部收集，苯酚硫酸法显色． 检测出糖
峰，然后合并单一含糖峰位．
2 结果与分析
2． 1 木瓜蛋白酶提取法正交试验结果
·222· 哈 尔 滨 商 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 第 32 卷
由表 3 可知，四种考察因素对假酸浆多糖的提
取量影响的顺序为:C ＞ D ＞ A ＞ B，由正交试验结
果确定的主要影响参数为 A3B3C1D2，也就是最佳
提取条件为:酶用量为 3%，pH值为 7． 5，提取温度
为 55 ℃，提取时间为 50 min． 在最佳提取条件下
进行试验，测得多糖提取率为 6． 02% ．
表 3 木瓜蛋白酶提取法正交试验方案及结果
序号 A B C D 多糖提取率 /%
1 A1 B1 C1 D1 3． 77
2 A1 B2 C2 D2 2． 29
3 A1 B3 C3 D3 3． 77
4 A2 B1 C2 D3 2． 18
5 A2 B2 C3 D1 3． 23
6 A2 B3 C1 D2 4． 95
7 A3 B1 C3 D2 5． 17
8 A3 B2 C1 D3 4． 25
9 A3 B3 C2 D1 2． 73
K1 9． 83 11． 12 12． 97 9． 72
K2 10． 36 9． 77 7． 20 12． 41
K3 12． 15 11． 44 12． 16 10． 21
k1 3． 28 3． 71 4． 22 3． 24
k2 3． 45 3． 26 2． 40 4． 14
k3 4． 05 3． 82 4． 06 3． 40
R 0． 77 0． 56 1． 82 0． 90
2． 2 木瓜蛋白酶法和 Sevag 法联用进行脱蛋白的
结果与分析
由图 5 可知，随着 Sevag 的使用次数增加脱蛋
白率递增，而多糖保留率下降，最佳的方法是酶法
最佳工艺和 Sevag使用两次联合，此时脱蛋白率为
77． 33%，多糖保留率为 69． 52% ．
图 5 假酸浆多糖的酶 － Sevag联合法脱蛋白
2． 3 AB －8 型大孔吸附树脂法进行脱色的正交试
验结果
由上表 4 可知，各种因素对假酸浆多糖脱色的
影响程度为:脱色温度 ＞树脂用量 ＞脱色时间，即
最佳试验条件为:A1B3C3 ． 此时测得的脱色率为
70． 2% ．
表 4 AB －8 型大孔树脂法正交实验方案及结果
序号 A B C 脱色率 /%
1 A1 B1 C1 66． 2
2 A1 B2 C2 68． 1
3 A1 B3 C3 70． 2
4 A2 B2 C3 57． 8
5 A2 B3 C1 60． 6
6 A2 B1 C2 58． 9
7 A3 B3 C2 50． 7
8 A3 B1 C3 52． 2
9 A3 B2 C1 54． 6
K1 204． 5 174． 7 177． 3
K2 177． 3 180． 9 180． 5
K3 157． 5 183． 7 181． 5
k1 68． 2 58． 2 59． 1
k2 59． 1 60． 3 60． 2
k3 52． 5 61． 2 60． 5
R 1． 6 3 1． 4
2． 4 DEAE －纤维素柱层析结果及分析
由图 6 可知，用洗脱剂洗脱假酸浆多糖可得到
五个级分，分别记作 PⅠ、PⅡ、PⅢ、PⅣ、PⅤ．其中
PⅣ含量最少，几乎可以忽略不计，PⅡ和 PⅢ含量
较多，为假酸浆多糖的主要组成部分．
图 6 假酸浆多糖的 DEAE －纤维素柱层析
3 结 语
在假酸浆多糖的提取中，采用正交实验法确定
了木瓜蛋白酶的最佳提取工艺:酶用量 3%、pH 值
为 7． 5、提取温度 55 ℃、提取时间为 50 min，假酸
浆多糖的提取率为 6． 02% ．另外，酶法是去除蛋白
高效且较温和的方法，对保持多糖的活性比较有
利，只是在酶解时产生的多肽会游离于水中，降低
脱蛋白率;而将酶法与 Sevag 法联用时，黏附在多
糖上的蛋白质可以被酶水解游离出来，接着用
Sevag法使蛋白质沉淀出来，从而达到脱蛋白的目
的．本实验采用木瓜蛋白酶法与 Sevag 法联用的脱
蛋白效率达到 77． 33%，采用 AB －8 型大孔树脂法
·322·第 2 期 齐欣欣，等:假酸浆多糖的酶法提取及纯化工艺的研究
使多糖脱色率达到 70． 2% ．经过脱蛋白、脱色等工
艺假酸浆多糖的质量分数达到 80． 6% ．
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