全 文 ：金柑 （Fortunella crassifolia Swingle）， 原产于
我国， 也称金橘、 金实、 柑子、 山橘、 卢橘、 四季
橘， 是芸香科、 柑橘亚科、 金柑属植物 [1]， 是福建
省特色水果之一 [2]， 主要产地分布在尤溪、 上杭、
长汀、 建阳、 大田和沙县等地。 其中尤溪县是福建
省的主产区， 也是我国金柑五大产区之一 [3]， 2007
年获得国家地理标志产品保护[4]。
多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部
分， 广泛存在于动物、 植物和微生物的细胞壁中，
是生物体内除核酸和蛋白质以外的又一类重要的生
物分子 [5]。 越来越多的研究表明， 多糖对细胞的各
种生命现象具有调节作用， 如黄精多糖 [6]、 莲藕多
糖[7]、 胡萝卜多糖 [8]、 无花果多糖 [9]、 姬松茸多糖[10]、
龙眼多糖 [11]等具有抗氧化，抑制肿瘤等作用， 金柑
多糖作为金柑中主要的成分之一， 目前其研究还尚
未见报道。 水提后的植物粗多糖中含有蛋白质、 色
素以及其它一些低分子物质（包括寡糖、 一些单糖、
盐分等）， 这些杂质影响了植物多糖结构和功效的
进一步研究。
国内外对粗多糖脱蛋白方法主要有 sevag 法、
三氟三氯乙烷法、 三氯乙酸法、 酶法、 盐酸法、 树
脂法等 [12]。 其中 Sevag 法是根据蛋白质在氯仿等有
机溶剂中变性的特点， 使粗多糖溶液中的蛋白质与
氯仿-正丁醇生成凝胶物， 从而达到去除蛋白质的
目的。 此方法在避免降解上有较好效果， 但效率不
高[13]。 而酶法是利用蛋白酶将粗多糖中的蛋白质水
解， 条件温和， 效率高[14]， 但此法往往会引入新的
蛋白质杂质， 所以与 Sevag 法相结合可取得较好的
效果。
笔者在金柑多糖提取工艺研究的基础上， 采用
木瓜蛋白酶和 Sevag 试剂相结合的方法研究金柑粗
多糖脱蛋白工艺， 通过对各工艺参数进行单因素实
验和正交试验， 以确定最佳工艺条件， 以期为金柑
多糖的分离纯化提供理论依据。
热带作物学报 2012， 33（1）： 166-170
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期： 2011-10-05 修回日期： 2011-12-10
基金项目： 福建省农产品（果蔬）加工工程技术研究中心资助项目（No.2009N2002）。
作者简介： 张 怡（1975—）， 女， 副教授， 博士。 研究方向： 农产品加工及贮藏工程。 E-mail:zyifst@163.com。 * 通讯作者： 郑宝东。
金柑多糖酶法脱蛋白工艺的研究
张 怡， 曾红亮， 曾绍校， 林雨菲， 郑宝东*
福建农林大学食品科学学院， 福建福州 350002
摘 要 蛋白酶法结合 Sevag 法对金柑粗多糖进行脱蛋白， 研究不同酶添加量、 温度、 pH 值、 时间等因素对金
柑粗多糖脱蛋白效果的影响。 结果表明， 金柑粗多糖酶法脱蛋白最佳工艺条件是： 木瓜蛋白酶添加量 120 U/mL、
酶解时间 80 min和酶解温度 40℃； 在此条件下， 蛋白质脱除率为 75.88％， 多糖的损失率为 5.45％； 再用 Sevag
试剂处理 3 次， 蛋白质脱除率和多糖损失率分别为 85.18％和 14.16％。
关键词 金柑多糖； 脱蛋白； 木瓜蛋白酶； Sevag
中图分类号 S666.1 文献识别码 A
Protein Removal from Fortunella margarita
Polysaccharides by Protease
ZHANG Yi, ZENG Hongliang, ZENG Shaoxiao, LIN Yufei, ZHENG Baodong
College of Food Science， Fujian Agricultural and Forestry University， Fuzhou,Fujian 350002， China)
Abstract The technology of protein removal from Fortunella margarita polysaccharides was studied by the
combination of Papain and Sevag. The results showed that the best technological conditions were as the following :
enzyme dose 120U/mL, hydrolysis time 80mins, and temperature 40℃ . Under the above conditions， the rate of
protein removal could reach to 75.88% , the losing rate of polysaccharides be 5.45 percent. Then the
polysaccharides were treated with Sevag three times, the rate of protein removal could reach to 85.18% , while
the losing rate of polysaccharides be 14.16%.
Key words Fortunella margarita polysaccharides； Removed protein； Papain； Sevag
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2012.01.034
第 1 期
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂 三明尤溪金柑， 九成熟， 由
尤溪县农业局提供.
木瓜蛋白酶购自北京奥博星生物技术责任有限
公司； 牛血清蛋白、 考马斯亮蓝 G-250、 大孔吸附
树脂 HP-20购自日本三菱公司； 大孔吸附树脂 X-5、
D101、 AB-8、 NKA-9、 S-8、 NKA-II和 HPD-600 为
南开大学化工厂产品； 无水乙醇、 正丁醇、 氯仿、
浓硫酸、 苯酚、 葡萄糖、 碳酸氢钠、 氢氧化钠、 氯
化钠等均为分析纯； 实验用水为二次蒸馏水。
1.1.2 主要仪器 DHL-A 恒流泵， 武汉予科实验
仪器有限公司； UV-2000 型紫外可见分光光度计，
尤尼柯（上海）仪器有限公司； RE-52A 型旋转蒸发
器， 上海亚荣生化仪器厂； 恒温水浴摇床， 天津奥
特赛恩斯仪器有限公司； 透析袋（分子量 14 000），
北京经科宏达生物技术有限公司 ； 玻璃层析柱
（Φ16 mm×400 mm）， 上海沪西分析设备厂； 试验
标准筛， 上虞市银河测试仪器厂。
1.2 方法
1.2.1 金柑粗多糖干粉的制作 金柑→清洗→冷
冻干燥→去核→粉碎→提取→金柑粗多糖溶液→旋
转浓缩→冷冻干燥→金柑粗多糖干粉。
多糖提取条件： 水提醇沉法， 液料比38 ∶1（V/m）、
温度88℃、 提取时间2.5 h、 乙醇浓度 70％的条件下
水提得到金柑粗多糖溶液。
1.2.2 多糖含量的测定 金柑多糖测定方法以葡
萄糖为标样， 采用硫酸―苯酚比色法[15-16]。
（1）标准曲线溶液的配制。 精确称取干燥的标
准葡萄糖 20 mg， 用 500 mL 蒸馏水定容， 分别吸
取 0、 0.4、 0.8、 1.2、 1.6、 2.0 mL， 各以蒸馏水补
至 2.0 mL， 加入 6％苯酚 1.0 mL， 再迅速加入浓硫
酸 5.0 mL， 显色后在冷水中冷却 15 min， 在波长
490 nm 处测定吸光度（A）， 以蒸馏水代替糖溶液作
空白对照。 绘制标准曲线为： Y=7.308 9X+0.023 5
（R2= 0.998 7）。 表明在 0~0.08mg/mL范围内葡萄糖溶液
浓度与吸光度 OD490nm值呈良好的线性关系。 X—表示
葡萄糖溶液浓度 ， 单位 mg/mL； Y—表示吸光度
OD490nm值。
（2）样品中多糖的含量。 将干燥的金柑粗多糖
用去离子水配成溶液， 吸取样品液 1.0 mL 按照上
述步骤， 在波长 490 nm 处测定吸光度 Y， 将 Y 代
入标准曲线方程， 得到样液中多糖的浓度 X。
多糖含量= X×VM×103 ×100
％
X—样液的浓度（mg/mL），
V—定容后的体积（mL）， M—所取金柑粉末的
重量（g）。
1.2.3 蛋白质含量的测定 [17-19] （1）标准曲线溶液
的配制。 精确移取牛血清白蛋白标准溶液（浓度为
0.1 mg/mL） 0、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0 mL， 依次
置于 6支试管中， 再分别加入去离子水， 使每支试
管中溶液的体积为 1 mL， 摇匀。 然后每管中分别
加入 5.0 mL 的染色液， 摇匀， 室温静置 3 min， 在
波长 595 nm 处测定吸光度（A）， 以空白溶液作对
照。 绘制得到标准曲线： Y=0.006 5 X+0.018 3（R2=
0.992 7）。 表明在0~100 μg/mL范围内牛血清白蛋白
溶液浓度与吸光度 OD 值呈良好的线性关系。 X-
表示牛血清白蛋白溶液浓度， 单位（μg/mL）， Y-表
示吸光度 OD值。
（2）样品的测定。 将干燥的金柑粗多糖用去离
子水配成溶液， 吸取样品液 1.0 mL按照上述步骤操
作， 在波长 595 nm处测定吸光度 Y1， 将 Y1代入蛋
白质标准曲线方程， 得到样液中蛋白质的浓度X1。
蛋白质含量= X1×V1M1
×100％。 X1-样液中蛋白质的
浓度（mg/mL）， V1—定容后的体积（mL）， M1—金柑
粗多糖粉末的重量（mg）。
1.2.4 脱蛋白试验 （1）蛋白酶法。 单因素试验：
取金柑粗多糖， 配制成 2 mg/mL 粗多糖溶液， 以蛋
白脱除率为指标， 研究蛋白酶酶解时不同的温度、
pH值、 酶添加量、 酶解时间对蛋白脱除率的影响。
正交试验： 根据单因素试验的结果， 选取蛋白
酶添加量 X1、 酶解时间 X2、 酶解温度 X3 等 3 因
素， 各设置 3个水平， 以蛋白质脱除率为指标， 设
计 L9（34）表做正交试验， 得出蛋白酶法脱除金柑多
糖中蛋白质的最佳工艺参数。
（2）sevag法[20-21]。 取经酶解处理后的多糖样品
液 30 mL， 加入 Sevag 试剂[氯仿 ∶ 正丁醇=4 ∶ 1（V/
V）]10 mL， 剧烈振摇20~30 min， 蛋白质变性生成
凝胶， 离心分离， 分去水层和溶剂层交界处的变性
蛋白质。 经离心去除沉淀后， 取少量溶液测蛋白质
含量， 然后将溶液再加入其体积 1/3 的氯仿-正丁
醇溶液， 重复 5 次。 按 1.2.5 公式计算多糖损失率
和蛋白脱除率。
1.2.5 计算方法
多糖保留率=m1/m2×100％
m1表示脱色后的多糖含量（mg）， m2表示脱色
前的多糖含量（mg）；
多糖损失率= （1－多糖保留率）×100％；
张 怡等： 金柑多糖酶法脱蛋白工艺的研究 167- -
第 33 卷热 带 作 物 学 报
100
90
80
70
60
50
40
30
脱
蛋
白
率
/％
30 40 50 60 70 80 90 100
图 3 酶解时间对脱蛋白率的影响
酶解时间/min
100
90
80
70
60
50
40
30
脱
蛋
白
率
/％
60 80 100 120 140 160 180
图 4 酶量对脱蛋白率的影响
酶添加量 U/mL
蛋白质去除率=（C1－C2）/C1×100％
C1表示脱色前的蛋白质浓度（μg/mL）， C2表示
脱色后的蛋白质浓度（μg/mL）。
2 结果与分析
2.1 金柑粗多糖脱蛋白工艺单因素实验
2.1.1 不同酶解温度对金柑多糖脱蛋白率的影响 将
酶解条件设定为： 原液 pH4.75， 酶添加量 120 U/mL，
于 20、 30、 40、 50、 60、 70℃下分别酶解 70 min，
高温灭酶活， 并在 4 000 r/min离心 10 min， 最后取
上清液测定蛋白质含量， 根据公式计算蛋白脱除
率。 试验结果如图 1所示。
由图 1可知， 在 20~40 ℃温度范围内， 随着酶
解温度的升高， 反应速度加快， 脱蛋白率显著增
加， 当酶解温度达到 40 ℃时， 脱蛋白率达到最大；
但当温度高于 40 ℃， 脱蛋白率随之下降。 这可能
是因为当温度超过酶的最适反应温度后， 酶蛋白质
变性， 使得酶活力减弱， 直至完全丧失活力。 因
此， 选择 40℃为酶解的最适温度。
2.1.2 不同酶解 pH对金柑多糖脱蛋白率的影响 将
酶解条件设定为 ： pH 选择 4.75、 5.0、 6.0、 7.0、
8.0、 9.0， 酶添加量 120 U/mL， 在 40 ℃下， 酶解
70 min， 高温灭酶活性， 并在 4 000 r/min 下离心
10 min， 最后取上清液测定蛋白质含量， 根据公式
计算蛋白脱除率。 试验结果如图 2所示。
由图 2 可知， 当 pH 小于 6.0 时， 脱蛋白率随
着 pH的增大而微增； 当pH 大于 6.0 时， 脱蛋白率
随着 pH 的增大而显著降低。 这可能是因为 pH 会
影响酶活力， pH 通过静电作用维持了酶活性中心
的最佳三维构象， 促进酶与底物结合， 此外 pH 还
会影响酶催化速度， pH 不同， 酶及作用底物所带
电荷不同， 酶的立体构象以及酶与底物的亲和力不
同， 催化速度也就不同。 因此， 选择 pH 为原液的
pH值 4.75时， 蛋白脱除既方便效果也最好。
2.1.3 不同酶解时间对金柑多糖脱蛋白率的影响 将
酶解条件设定为： 酶添加量 120 U/mL， 在 40℃下
分别酶解 40、 50、 60、 70、 80、 90 min， 高温灭酶
活性， 并在 4 000 r/min 离心 10 min， 最后取上清
液测定蛋白质含量， 根据公式计算蛋白脱除率。 试
验结果如图 3所示。
由图 3 可知， 当酶解时间为 40、 50 min 时，
脱蛋白率比较接近， 但是随着酶解时间的增大， 脱
蛋白率显著增大， 至 70 min 后脱蛋白率变化不明
显。 酶解反应时间和酶解进行程度有密切的关系，
反应时间太短， 酶解不充分； 而当酶浓度达到一定
时， 酶促反应的时间延长并不能使脱蛋白率显著增
加。 因此， 选择 70 min 为最佳酶解时间。
2.1.4 不同酶用量对金柑多糖脱蛋白率的影响 将
酶解条件设定为： 酶添加量分别为 80、 100、 120、
140、 160 U/mL 时， 在 40℃下酶解 70 min， 高温灭
酶活性， 并在 4 000 r/min 离心 10 min， 最后取上
清液测定蛋白质含量， 根据公式计算蛋白脱除率。
试验结果如图 4所示。
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
脱
蛋
白
率
/％
4 5 6 7 8 9 10
pH值
图 2 pH 对脱蛋白率的影响
10 20 30 40 50 60 70 80
图 1 酶解温度对脱蛋白率的影响
酶解温度/℃
100
90
80
70
60
50
40
30
脱
蛋
白
率
/％
168- -
第 1 期
水平 酶添加量/（U/mL） 酶解时间/min 酶解温度/℃
1 100 60 35
2 120 70 40
3 140 80 45
表 1 正交试验因数和水平表
试验号
因素
脱蛋白率/％
A 酶添加量/（U/mL） B酶解时间/min C酶解温度/℃ D 空列
1 1（100） 1（60） 1（35） 1 63.59
2 1（100） 2（70） 2（40） 2 69.59
3 1（100） 3（80） 3（45） 3 68.99
4 2（120） 1（60） 2（40） 3 74.98
5 2（120） 2（70） 3（45） 1 66.59
6 2（120） 3（80） 1（35） 2 68.39
7 3（140） 1（60） 3（45） 2 69.59
8 3（140） 2（70） 1（35） 3 56.99
K1 202.17 208.16 188.97 203.97
K2 209.96 193.17 218.36 207.57
K3 200.37 211.17 205.17 200.96
k1 67.39 69.3867 62.99 67.99
k2 69.986 7 64.39 72.786 7 69.19
k3 66.79 70.39 68.39 66.986 7
优水平 A2 B3 C2 D2
极差R 3.1967 6 9.796 7 2.203 3
主次顺序 C>B>A>D
9 3（140） 3（80） 2（40） 1 73.79
表 2 正交试验结果
变异来源 偏差平方和 自由度 均方 F 值 显著水平/P
酶添加量 17.321 4 2 8.660 7 2.372 3 0.296 5
酶解时间 61.973 4 2 30.986 7 8.487 9 0.105 4
酶解温度 144.465 4 2 72.232 7 19.786 1 0.048 1
误差 7.301 4 2 3.650 7
总和 231.061 4
表 3 正交试验方差分析
由图 4 可知， 在酶添加量为 80~120 U/mL 时，
随着酶添加量的增加脱蛋白率显著增加； 当酶添加
量在 120 U/mL 时， 脱蛋白率达到最大； 当酶添加
量超过 120 U/mL 时对脱蛋白率影响很小。 因此，
选择 120 U/mL 为酶解的最适酶添加量。
2.2 金柑粗多糖脱蛋白工艺优化试验
2.2.1 因素水平表 在单因素考察的基础上， 用正
交试验对影响提取的因数进行条件优化。 在 pH 值
4.75， 对酶添加量、 酶解温度、 酶解时间 3个因素进
行正交试验， 每个因素选 3个水平， 以蛋白质脱除率
为考察指标， 选用正交表L9（34）， 因数水平如表 1。
2.2.2 正交试验结果 蛋白酶法脱蛋白正交试验
结果见表 2。 由正交表进行分析可知， 最佳工艺条
件为 ： A2、 B3、 C2 即木瓜蛋白酶量为 120 U/mL，
酶解时间为 80 min， 酶解温度为 40 ℃。 由极差分
析结果可以看出， 上述 3因素对蛋白质去除率的影
响程度依次为： 酶解温度、 酶解时间、 酶添加量。
由表 3正交试验方差分析表可知， 酶解温度对
蛋白去除率的影响显著， 酶添加量和酶解时间对蛋
白去除率的影响不显著。 在最佳工艺条件下， 蛋白
质脱除率为 75.88％， 多糖的损失率为 5.45％。
2.3 sevag法脱蛋白
将经优化酶解工艺处理后的多糖液利用 sevag
试剂进行脱蛋白处理 5次， 蛋白质脱除率和多糖损
失率情况如图 5所示。
结果显示， Sevag 法脱蛋白经过 3 次后， 蛋白
质脱除率趋于稳定， 但是多糖损失率却逐渐上升。
经过脱蛋白 5次后， 蛋白质脱除率达到了 85.48％，
多糖损失率却也高达 25.49％。 综合考虑， Sevag法
脱蛋白 3次为最佳方案， 此时蛋白质脱除率和多糖
损失率分别为 85.18％和 14.16％。
张 怡等： 金柑多糖酶法脱蛋白工艺的研究 169- -
第 33 卷热 带 作 物 学 报
200 250 300 350 400
波长/nm
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
吸
光
度
脱蛋白前
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
吸
光
度
200 250 300 350 400
波长/nm脱蛋白后
图 6 紫外-可见光谱全波段扫描图
责任编辑： 高 静
90.00
85.00
80.00
75.00
70.00
65.00
60.00
55.00
50.00
30.00
25.00
20.00
15.00
10.00
5.00
0.00
1 2 3 4 5
图 5 Sevag 试剂处理结果
Sevag 处理次数
脱
蛋
白
率
/％
多
糖
损
失
率
/％
2.4 纯度鉴定
金柑多糖液脱蛋白前和脱蛋白后在波长 200~
400 nm 区间紫外-可见光谱全波段扫描， 扫描间隔
为 0.5 nm， 扫描结果见图 6。 图谱显示未脱蛋白的
样品在 280 nm 处有明显的蛋白质特征吸收峰， 而
脱蛋白后的样品在 280 nm 处没有明显的蛋白特征
吸收峰， 说明金柑多糖中的蛋白质已被基本除净。
3 结论
通过蛋白酶和sevag 试剂相结合的方法脱蛋白
试验可知， 金柑多糖的蛋白酶法脱蛋白的最佳工艺
为： 酶添加量为 120 U/mL、 酶解时间为 80 min 和
酶解温度为 40 ℃， 在此工艺条件下， 蛋白质脱除
率为 75.88％， 多糖的损失率为 5.45％。 再用 sevag
试剂处理 3次， 此时蛋白质脱除率和多糖损失率分
别为 85.18％和 14.16％。
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