全 文 ：第 33 卷 第 3 期
2 0 1 5 年 3 月
中 华 中 医 药 学 刊
CHINESE AＲCHIVES OF TＲADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol． 33 No． 3
Mar． 2 0 1 5
中
华
中
医
药
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学
刊
DOI:10． 13193 / j． issn． 1673-7717． 2015． 03． 051
凤尾草抗肿瘤有效部位的提取工艺研究
王智勇1，王模强2，陈岩3
(1．哈尔滨医科大学附属第二医院静脉药物调配中心，黑龙江 哈尔滨 150086;
2．四川绵竹鸿基制药有限公司研发部，四川 绵竹 618200;
3．哈尔滨医科大学附属第一医院药学部，黑龙江 哈尔滨 150001)
摘 要:目的:研究凤尾草抗肿瘤有效部位的提取工艺及含量测定方法。方法:通过正交试验考察了乙醇浓
度、提取时间、提取次数和料液比对凤尾草抗肿瘤有效部位提取的影响，采用 HPLC 法测定 2β，15α －二羟基 －
(－)－ 16 －贝壳杉烯等二萜类成分的含量。结果:优选最佳提取工艺条件为:10 倍用量 70%乙醇回流提取 3 次，
每次 60 min。结论:HPLC法对凤尾草二萜类成分定量准确，能够控制产品质量。对最佳提取工艺进行了验证试
验，结果表明该工艺稳定，省时，简便。
关键词:凤尾草;二萜;提取工艺;高效液相色谱法
中图分类号:Ｒ284． 2 文献标志码:A 文章编号:1673-7717(2015)03-0679-03
Study on Extraction Process of Anti － Tumor Effective Parts in Pterismultifida Poir
WANG Zhiyong1，WANG Moqiang2，CHEN Yan3
(1． Pharmacy Intravenous Admixture Services of The 2nd Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150086，Heilongjiang，China;
2． Ｒ＆D，Sichuan Mianzhu Hongji Pharmaceutical Co，Ltd．，Mianzhu 618200，Sichuan，China;
3． Pharmacy Department of The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150001，Heilongjiang，China)
Abstract:Objective:To establish a method for the determination and the extraction technology of anti － tumor effective
parts from Pterismultifida Poir． Methods:By orthogonal test，the effects of ethanol concentration，extraction time，extraction
times and ratio of material to liquid of herb extraction effects were studied and HPLC method was used to measure 2β，15α
－ two hydroxy (－)－ 16 － kaurene． Ｒesults:The optimum extraction conditions were as follows:10 times the amount of
optimization;70% ethanol reflux extraction 3 times，each time 60 min． Conclusion:The HPLC method for two terpenoids
has quantitative accuracy and can control the quality of the products． The verification test on the optimal extraction
process show that the process is stable，time saving and simple．
Key words:Pterismultifida Poir．;diterpene;extraction process;HPLC
收稿日期:2014 － 10 － 15
基金项目:黑龙江省卫生厅科研项目(2011 － 111)
作者简介:王智勇(1978 －) ，男，黑龙江哈尔滨人，主管药师，学士，
研究方向:药剂学。
凤尾草，为凤尾蕨科植物 Pterismultifida Poir． 的全草，
四季可采，始载于《本草拾遗》，其性凉，味淡、微苦，治疳、
疔、痔，散毒，敷疮，具有清热利湿，解毒止痢，凉血止血之功
效。凤尾草化学成分比较复杂，含黄酮类、萜类、苯丙素类、
挥发油类和多糖、氨基酸、微量元素等［1 － 4］，具有多种功效，
抗菌、抗肿瘤作用比较显著。目前，国内外报道凤尾草同属
植物普遍含有贝壳杉烷(烯)化合物，具一定的抗肿瘤活
性［5 － 6］，其中，2β，15α －二羟基 －(－)－ 16 －贝壳杉烯为
凤尾草中的已知抗肿瘤活性成分［7］。本研究以该类化合
物含量为评价指标，建立了 HPLC法测定含量，采用正交实
验考察溶剂浓度、提取时间、提取次数和料液比对热回流提
取效果的影响，优选出了最佳提取方案。
1 材料与方法
1． 1 仪器
高效液相色谱仪(1525 型二元泵、717 型自动进样器、
2996型紫外检测器，美国 Waters公司);BL － 310 型电子分
析天平(德国 Sartorius公司，十万分之一);pHS － 25 型 pH
计(上海精密科学仪器有限公司) ;QYC2102C 型水浴恒温
振荡器(上海福玛实验设备有限公司)Sorvall Legend Micro
17型离心机(美国 Thermo 公司);KQ －50 型超声波清洗器
(昆山市超声仪器有限公司)。
1． 2 试药
凤尾草药材采于绵竹市郊区，由哈尔滨医科大学生药
教研室金锐副教授鉴定为凤尾蕨科植物 Pterismultifida
Poir．的全草。甲醇、乙腈均为色谱纯，水为自制重蒸水，其
余试剂均为分析纯。2β，15α －二羟基 －(－)－ 16 －贝壳
杉烯等 6 种对照品对照品(由四川绵竹鸿基制药有限责任
公司提供，由哈尔滨工业大学化工学院鉴定)。结构式见
图 1、表 1，图 2、表 2，来源及纯度见表 3。
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图 1 2β，15α －二羟基 －对映 －贝壳杉烷类化合物结构式
表 1 2β，15α －二羟基 －对映 －贝壳杉烷类化合物结构式
对照品
编号
化合物名称 取代基位置
纯度
(%)
1
2β，15α － dihydroxy － ent
－ kaur － 16 － ene
Ｒ1 = OH，Ｒ2 － Ｒ4 = H，Ｒ5
= OH，Ｒ6 = CH3
99． 50
2
2β，15α － dihydroxy － ent
－ kaur － 16 － ene 2 － O
－ β － D － glucside
Ｒ1 = O － β － D － gluco-
side，Ｒ2 － Ｒ4 = H，Ｒ5 =
OH，Ｒ6 = CH3
98． 16
3
2β，6β，15α － trihydroxy
－ ent － kaur － 16 － ene
Ｒ1，Ｒ2 = OH，Ｒ3，Ｒ4 = H，
Ｒ5 = OH，Ｒ6 = CH3
98． 09
4
2β，6β，15α － trihydroxy
－ ent － kaur － 16 － ene 2
－ O － β － D － glucoside
Ｒ1 = 2 － O － β － D － glu-
coside，Ｒ2 = OH，Ｒ3，Ｒ4
= H，Ｒ5 = OH，Ｒ6 = CH3
99． 75
图 2 2β，16α －二羟基 －对映 －贝壳杉烷类化合物结构式
表 2 2β，16α －二羟基 －对映 －贝壳杉烷类化合物结构式
对照品
编号
化合物名称 取代基位置
纯度
(%)
5
2β，16α － dihydroxy － ent
－ kaur
Ｒ1 = H，Ｒ2 = H，Ｒ3 = CH3 98． 28
6
2β，15α － dihydroxy － ent
－ kaurane － O － β － D －
glucoside
Ｒ1 = O － β － D － gluco-
side，Ｒ2 = H，Ｒ3 = CH3
98． 81
1． 3 正交试验设计
为全面考察热回流提取法对贝壳杉烷类化合物提取效
果的影响，根据预试验结果确定影响提取的 4 个主要因素:
乙醇浓度(A)、提取时间(B)、提取次数(C)和料液比(D)，
各取 3 个水平。按照 L9(3
4)正交表进行试验，
表 3 试验因素水平 L9(3
4)
水平
A
乙醇浓度(%)
B
提取时间(min)
C
提取次数(次)
D
料液比
1 45 30 1 1 /6
2 70 60 2 1 /8
3 95 90 3 1 /10
1． 4 正交试验方法
分别准确称取 20 g凤尾草药材粉末共 18 份，浸泡 30
min后，按表 1 和表 2 的因素和水平，进行 9 个试验，每个试
验平行进行 2 次，热回流法进行提取，合并提取液，过滤，记
录提取液体积，然后准确量吸取上清液 10 mL置的 100 mL
量瓶中，甲醇定容至刻度，作为储备液备用。
1． 5 含量测定方法
1． 5． 1 HPLC色谱条件 Waters高效液相色谱仪(2996 二
极管阵列检测器、Millennium32 色谱工作站，美国);Hypersil
C18色谱柱(250 mm ×4． 6 mm，5 μm，大连依利特公司) ;流
动相为:甲醇 － 水(55∶ 45)［72］;流速:1． 0 mL·min －1;检
测波长:348 nm;柱温:35 ℃;进样量:10 μL。
1． 5． 2 样品供试液制备 取“1． 4”项下储备液，0． 45 μm
微孔滤膜滤过，避光保存，续滤液即为 HPLC法供试液。
1． 5． 3 对照品溶液制备 准备称取 6 种对照品，每种剂量
为 1． 0 mg，放入容量瓶内(规格:25 mL)，待甲醇溶解、定
容，然后摇均。吸取混合后的对照品，吸取剂量要精准，分
别是 0． 1、0． 5、1． 0、1． 5 mL，甲醇溶液稀释到 2． 0 mL，再摇
均，应用 0． 45 μm 微孔滤膜进行滤过，滤液就是不同浓度
的对照品供试溶液。
1． 5． 4 定量法 精密吸取各供试液 10 μL，按照上述色谱
条件进样分析，以外标法计算凤尾草抗肿瘤有效部位提取
物中各指标成分含量。
2 结果
2． 1 线性关系考察
精密吸取各浓度混合对照品溶液 10 μL，按上述色谱
条件测定。各指标成分在测定浓度范围内线性关系良好，
结果见表 4。
表 4 线性结果
对照品
编号
标准曲线 r 线性范围 (mg·mL －1)
1 Y = 1． 709 × 107X － 7． 811 × 104 0． 999 7 5． 85 × 10 － 3 ～ 1． 17 × 10 － 1
2 Y = 2． 089 × 107X － 6． 723 × 105 0． 999 6 2． 28 × 10 － 3 ～ 4． 56 × 10 － 2
3 Y = 2． 755 × 107X － 1． 363 × 104 0． 999 5 5． 15 × 10 － 2 ～ 1． 03 × 10 － 1
4 Y = 3． 264 × 107X － 4． 983 × 104 0． 999 8 1． 01 × 10 － 2 ～ 2． 02 × 10 － 1
5 Y = 3． 835 × 107X － 5． 632 × 103 0． 999 5 2． 48 × 10 － 3 ～ 4． 95 × 10 － 2
6 Y = 2． 749 × 107X － 1． 719 × 104 0． 999 9 2． 58 × 10 － 3 ～ 5． 15 × 10 － 2
2． 2 色谱系统适用性试验
以 6 种指标成分计算，理论塔板数均大于 7000，拖尾
因子在 0． 95 ～ 1． 05 之间，与相邻色谱峰之间的分离度均大
于 1． 2。
2． 3 精密度试验
仪器精密度:取 HPLC法对照品混合溶液，按上述色谱
条件连续测定 5 次，6 种指标成分峰面积值 ＲSD 分别为
0. 3% ～ 1． 4%，仪器精密度良好。
方法精密度:取凤尾草抗肿瘤有效部位提取物粉末，精
密称取 5 份，按 1． 5． 2 项下制备 HPLC 法供试液，精密吸取
10 μL，按 1． 5． 1 项色谱条件进样分析，每份测定 3 次，并计
算凤尾草抗肿瘤有效部位提取物中各指标成分含量，ＲSD
分别为 0． 4% ～ 2． 6%，方法精密度良好。
2． 4 稳定性试验
对照品稳定性，精准吸取置于室温下，静置混合对照品
的储备液，然后在配制后 0、2、4、6、8 h，参照 HPLC 色谱条
件予以进样分析，计算得出各指标峰值面积、相对标准偏差
ＲSD在 0． 9% ～ 1． 7%范围内。结果发现，对照品溶液在 8
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h时间内具有很好的稳定性。
样品稳定性，精准吸取置于室温下，静置样品溶液，在
配制后 0、2、4、6、8 h，参照 HPLC 色谱条件进行进样分析，
计算得到各指标峰值面积，相对标准偏差 ＲSD 在 0． 8% ～
1． 9%范围内。结果发现，样品溶液在 8 h时间内具有很好
的稳定性。
2． 5 加样回收率试验
精密称取已知含量凤尾草抗肿瘤有效部位提取物生药
共 3 份，定容于 25 mL容量瓶，精密加入适量的对照品混合
溶液，按上述 HPLC 法测定，平均回收率分别为 97． 2%、
99. 2%、97． 5%、100． 7%、97． 6%、97． 7%，见表 5。
表 5 加样回收率实验结果(n = 6)
C加入浓度
(μg·mL －1)
C测试浓度
(μg·mL －1)± SD
回收率
(%)
ＲSD
(%)
0． 10 0． 103 ± 0． 010 102． 9 9． 35
050 0． 506 ± 0． 015 101． 2 3． 04
1． 00 1． 053 ± 0． 088 105． 3 8． 31
2． 6 色谱图
对正交试验所制备的 9 批凤尾草抗肿瘤有效部位提取
物样品进行 HPLC分析，典型 HPLC图谱见图 3。
A混合对照品图谱，B样品，1 ～ 6:指标成分 1 ～ 6
图 3 凤尾草抗肿瘤有效部位提取物 HPLC图谱
2． 7 正交试验结果
对正交试验所制备的 9 批凤尾草抗肿瘤有效部位提取
物样品进行 HPLC分析，指标成分总含量为 6 种指标成分
的含量测定结果之和，结果见表 6。
由表 3 直观分析可知，极差 Ｒ最大的为 C因素。影响
因素主次顺序为 CADB，热回流次数是热回流提取的关键
因素，乙醇浓度和料液比次之，提取时间影响最小。所以最
佳提取工艺是 A2B2C3D3。
2． 8 工艺验证试验
根据正交试验的结果，综合考虑生产成本和提取效率，
将最佳条件中的乙醇浓度、热回流时间、料液比三因素固
定，优选提取次数(2 次、3 次和 4 次)的水平。取凤尾草药
材，粉碎，过 4 号筛。称取 250 g，6 份，分别按上述工艺及
1． 5 项下含量测定方法进行，测定各斑点峰面积。其结果
见表 7。从结果可见，提取 3 次基本提取完全，最佳提取工
艺是 A2B2C3D3。
表 6 L9(3
4)正交试验方案与结果
试验号
A (乙醇
浓度)
B(提取
时间)
C(提取
次数)
D(料
液比)
指标成分总
含量(mg·g － 1)
1 1 1 1 1 0． 126
2 1 2 2 2 0． 349
3 1 3 3 3 0． 482
4 2 1 2 3 0． 477
5 2 2 3 1 0． 601
6 2 3 1 2 0． 325
7 3 1 3 2 0． 334
8 3 2 1 3 0． 293
9 3 3 2 1 0． 317
K1 0． 957 0． 937 0． 768 1． 044
K2 1． 403 1． 243 1． 143 1． 008
K3 0． 944 1． 124 1． 417 1． 252
k1 0． 319 0． 312 0． 256 0． 348
k2 0． 468 0． 414 0． 381 0． 336
k3 0． 315 0． 375 0． 472 0． 417
Ｒ 0． 153 0． 102 0． 216 0． 081
表 7 工艺验证试验结果
试验号
A (乙醇
浓度)
B(提取
时间)
C(提取
次数)
D(料
液比)
指标成分总
含量(mg·g － 1)
1 70 30 2 1:10 0． 542
2 70 30 3 1:10 0． 623
3 70 30 4 1:10 0． 640
3 结论
本实验通过正交试验考察了乙醇浓度、提取时间、提取
次数和料液比 4个影响因素对凤尾草提取效果的影响，通过
对凤尾草中 2β，15α －二羟基 －(－)－16 －贝壳杉烯等二萜
类成分含量的测定，HPLC法进行定量测定，具有准确度高、
重现性好等优点。能够控制产品质量。并综合考虑实际生
产，优选最佳提取工艺条件为:10倍用量 70%乙醇回流提取
3次，每次 60 min。并对其进行了验证试验，结果表明该工
艺稳定，省时，简便，为该药的开发研究提供了参考依据。
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