全 文 ：2014 年 4 月
第 37 卷 第 2 期
湖南师范大学自然科学学报
Journal of Natural Science of Hunan Normal University
Vol． 37 No． 2
Apr．，2014
直接器官发生途径的榉树微繁体系建立
刘雪梅，罗雪梅，王 征，金晓玲*
(中南林业科技大学风景园林学院，中国 长沙 410004)
摘 要 为了建立通过直接器官发生途径的榉树微繁技术体系，以当年生带芽茎段为外植体，进行了榉树不
定芽的直接诱导试验． 结果表明:适合不定芽诱导的培养基为 MS + BA 2． 25 ～ 4． 50 μmol /L，有效芽诱导率达到
76. 67%;继代增殖培养的培养基为 MS + BA 2． 25 μmol /L，增殖系数为 5． 1;壮苗培养基为 MS + BA 2． 25 μmol /L +
GA31． 45 μmol /L;生根培养基为 1 /2 MS + NAA 2． 69 μmol /L +活性炭 0． 1 g·L
－1，生根率 77． 78%，生根数达 4． 5条．
关键词 榉树;不定芽;直接器官发生;再生体系
中图分类号 Q943. 1 文献标识码 A 文章编号 1000-2537(2014)02-0017-05
Micro Propagation System Establishment of Zelkova
Schneideriana Through a Direct Organogenesis Way
LIU Xue-mei，LUO Xue-mei，WANG Zheng，JIN Xiao-ling*
(College of Landscape Architecture，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，China)
Abstract In order to establish Zelkova schneideriana regeneration system through a direct organogenesis way，
the current-year stems with a bud was used as explants． Ｒesults show that it was cultured on Murashige and Skoogs
(MS)medium that supplemented with 2． 25 μmol /L to 4． 50 μmol /L 6-benzylaminopurine (BA)to induce adven-
titious bud，and 76． 67% of stems with a bud can form adventitious bud． Then the adventitious bud was subcul-
tured on MS containing 2． 25 μmol /L BA to propagate shoots，and approximately five shoots per-explants were
propagation． Shoots were cultured on MS supplemented with 2． 25 μmol /L BA and 1． 45 μmol /L Gibberellin A3
(GA3)could be got sound seedling． The shoots were rooted on 1 /2MS containing 2． 69 μmol /L naphthylene acetic
acid (NAA)and 0． 1 g·L －1 activated carbon，on which 77． 78% shoots developed roots with average of 4． 5 roots
per-shoot．
Key words Zelkova schneideriana;adventitious bud;direct organogenesis;regeneration system
榉树(Zelkova schneideriana)不仅是珍贵的阔叶用材树种［1-2］，也是重要的园林树种［3］．由于过度采伐，我
国的野生榉树资源已经相当匮乏［4］．组培快速繁殖技术能较好地保持母树的优良性状，繁殖不受外界环境
限制，因此该技术已经在许多植物优良品种的工厂化生产中得到应用［5-6］．榉树组织培养技术的研究目前还
处于初期阶段［7］，主要利用茎尖或愈伤组织诱导的方法进行增殖．但是利用茎尖培养的方法，具有繁殖系数
低的缺点［8］，而利用愈伤组织诱导的途径则后代容易产生变异［9］．本文拟建立通过榉树外植体直接器官发
生途径诱导不定芽或侧芽的形成，再经继代和增殖培养获得大量的不定芽，最后诱导生根成苗的榉树微繁技术体
* 收稿日期:2013-06-28
基金项目:湖南省科技计划资助项目(2011NK3040);湖南省研究生科研创新基金资助项目(CX2012B329) ;中南林业科
技大学研究生科技创新基金资助项目(CX2012B06)
* 通讯作者，E-mail:jxl0716@ hotmail． com
系．以期能在保持母树优良特性的前提下，提高不定芽的繁殖系数，为榉树工厂化育苗提供一定的技术支持．
1 材料和方法
1． 1 试验材料
供试材料栽植于中南林业科技大学校园内，外植体为当年生带芽茎段，采集于选育出的榉树黄色品系的
优树枝条，见图 1A．
1． 2 试验方法
1． 2． 1 初代培养 基本培养基采用MS，附加不同浓度的 BA，共设 6 个处理，每个处理 4 个重复，每个重复 8
个插穗，共 32 个插穗． 25 d后统计腋芽萌发率、有效芽诱导率及芽平均生长高度．
1． 2． 2 继代培养 当初代诱导的不定芽长到 1． 5 cm左右时，将萌发的幼芽从基部切下，并接种到增殖培养
基中培养，基本培养基采用MS，附加了不同浓度的 BA和 NAA，共设 9 个处理(L9(3
4)) ，每个处理 8 个幼苗，
重复 4 次，25 d后统计芽的增殖率、芽苗总数及芽苗的平均高度，计算增殖系数．
1． 2． 3 壮苗培养 在壮苗培养试验中，以高 1． 0 cm左右的不定芽为试验材料．基本培养基采用 MS，附加了
不同浓度的 BA和 GA3，共设 5 个处理．每种处理 8 个幼苗，重复 4 次，25 d后观察芽的生长状况．
1． 2． 4 生根培养 将经过壮苗培养的再生苗接种到生根培养基上，以 1 /2MS 为基本培养基，附加了不同浓
度的 NAA和活性碳诱导生根，共设 5 个处理．每个处理 8 个幼苗，重复 4 次，25 d后统计平均生根率、平均生
根条数、平均根长及平均茎高．
1． 2． 5 培养条件 培养基均附加琼脂 6 g /L，蔗糖 30 g·L －1，pH 为 6． 0．以上实验的培养条件均为培养温
度 25 ± 2 ℃，光照强度 1 500 lx，光照时数 14 h·d －1 ．
2 结果与分析
2． 1 细胞分裂素 BA对榉树初代培养不定芽诱导的影响
细胞分裂素对榉树带芽茎段诱导的影响结果见表 1 和图 1B．由表 1 可以看出，BA浓度对榉树带芽茎段
的萌发率、有效芽诱导率以及芽的平均高度等都有显著影响，总体表现为随着 BA 浓度的增加，萌发率逐渐
提高，当达到一定值后，随着 BA浓度的增加，芽的萌发率逐渐下降．当 BA浓度为 2． 25 μmol /L时，芽的萌发
率为 80%，当 BA浓度为 4． 50 μmol /L时，萌发率达到最大值 83． 33%，但两者没有显著差异，有效芽诱导率
达到 76． 67%，芽的平均高度也较高，2． 6 ～3． 0 cm，见图 1C;随着 BA浓度的增加，萌发率、有效芽诱导率以及芽
的平均高度等都逐渐下降，当 BA浓度为 35． 8 μmol /L时，不定芽的诱导率只有 30%，芽的高度不足 0． 5 cm，见
图 1D．因此，榉树带芽茎段的萌发需要较低浓度的 BA，合适的初代培养基为 MS + BA 2． 25 ～4． 5 μmol /L．
表 1 榉树茎段初代培养实验结果
Tab． 1 The results of Z． schneideriana stem initial culture
处理编号 BA浓度 /(μmol·L －1) 萌发率 /% 有效芽诱导率 /% 芽平均高度 /cm
D1 0 26． 67 Ee 16． 67 Ee 1． 0
D2 2． 25 80． 00 Aa 76． 67 aA 3． 0
D3 4． 50 83． 33 Aa 76． 67 Aa 2． 6
D4 8． 90 66． 67 Bb 56． 67 Bb 1． 5
D5 17． 9 53． 33 Cc 40． 00 cC ＜ 1． 0
D6 35． 8 40． 00 Dd 30． 00 dD ＜ 0． 5
注:采用 Duncans法多重对比，小写字母表示在 0． 05 水平上的差异性，大写字母表示在 0． 01 水平上的差异性，字母相同
表示差异不显著，字母不同表示差异显著．下同．
2． 2 不同激素浓度对不定芽继代和增殖的影响
BA和 NAA的不同浓度和组合对榉树不定芽增殖的影响不同，实验结果见表 2．由表 2 可知，9 种处理对
不定芽增殖培养有显著影响．其中 E4 不仅增殖系数最高，其有效苗数也最多，E4 处理芽生长情况也是最好
的，其培养基配方是 MS + BA 2． 25 μmol /L，增殖系数为 5． 1．对不定芽增殖系数进行多因素方差分析，其结
果见表 3．
81 湖南师范大学自然科学学报 第 37 卷
刘雪梅等:直接器官发生途径的榉树微繁体系建立
表 2 榉树不定芽的继代增殖培养试验结果
Tab． 2 The shoots multiplication results of Z． schneideriana adventitious bud
处理编号
实验方案
BA/(μmol·L －1) NAA/(μmol·L －1)
有效苗数 /个 增殖系数 /倍 芽生长情况
E1 1(0． 45) 1(0) 2． 20 2． 27 基部无愈伤，少许丛生芽，苗较粗壮
E2 1(0． 45) 2(0． 54) 2． 33 2． 37 基部无愈伤，少许丛生芽，苗较粗壮
E3 1(0． 45) 3(2． 69) 2． 23 2． 23 基部少许愈伤，少许丛生芽，苗较弱
E4 2(2． 25) 1(0) 5． 10 5． 10 基部无愈伤，丛生芽较多，苗较粗壮
E5 2(2． 25) 2(0． 54) 4． 80 4． 93 基部少许愈伤，丛生芽较多，苗粗壮
E6 2(2． 25) 3(2． 69) 4． 20 4． 83 基部较多愈伤，丛生芽较多，苗粗叶较小
E7 3(4． 5) 1(0) 3． 80 3． 81 基部少许愈伤，丛生芽较多，苗较粗壮
E8 3(4． 5) 2(0． 54) 3． 73 3． 80 基部具愈伤，丛生芽较多，苗粗壮
E9 3(4． 5) 3(2． 69) 3． 40 3． 53 基部较多愈伤，较多丛生芽，苗叶弱小
表 3 增殖倍数方差分析结果
Tab． 3 The variance analysis results of the multiplication rate
变异来源 自由度 平方和 均方 F值 概率 P
Model 8 33． 280a 4． 160 318． 190 0． 000
BA 2 33． 081 16． 541 1 265． 145 0． 000
NAA 2 0． 068 0． 034 2． 589 0． 103
NAA* BA 4 0． 131 0． 033 2． 512 0． 078
误差 18 0． 235 0． 013
总计 27 381． 853
由表 3 可以看出，处理的总效应达到了极显著水平:F = 318． 190，P ＜ 0． 01，但 BA和 NAA之间的交互作
用的效应却不显著．进一步对 BA和 NAA两种因素进行了多重比较，结果见表 4 和表 5．
表 4 BA 3 水平的 Duncan检验
Tab． 4 Duncans three level test for BA
BA水平 平均值 0． 05 水平 0． 01 水平
BA(0． 45) 2． 212 c C
BA(2． 25) 4． 922 a A
BA(4． 5) 3． 641 b B
由表 4 可知，试验中 BA所选取的 3 个水平之间均存在极显著的差异，BA 为不定芽增殖的主要影响因
素．从平均值来看，BA水平在 2． 25 μmol /L时，其平均值最高，为 4． 922．由表 5 可知，试验中 NAA所选取的
3 个水平之间差异不显著．从统计结果来看，在不定芽增殖阶段不添加生长素 NAA最好．
表 5 NAA 3 水平的 Duncan检验
Tab． 5 Duncans three level test for NAA
NAA水平 平均值 0． 05 水平 0． 01 水平
NAA(0) 3． 661 a A
NAA(0． 54) 3． 570 a A
NAA(2． 69) 3． 544 a A
综上所述，BA是影响不定芽增殖培养的主要因子，NAA及其与 BA的交互作用对增殖的结果效果不显
著．因此，榉树不定芽继代增殖培养最优培养基配方为 MS + BA2． 25 μmol /L，即 E4 组合，见图 1E，F．
2． 3 不同激素浓度及组合对不定芽壮苗培养的影响
为了使组培苗健壮，在基本培养基中添加了不同浓度配比的 BA 和 GA3，结果见表 6．由表 6 可知，单独
使用 BA，榉树不定芽能生长;单独使用 GA3 不能促进不定芽生长;BA和 GA3 的配合使用能促进不定芽生长
和壮苗，但试验中发现，低浓度的 GA3(1． 45 μmol /L)可以达到壮苗的目的，过高浓度的 GA3 反而会抑制不
定芽的生长(2． 9 μmol /L)．因此，榉树不定芽壮苗适宜的培养基为 MS + BA 2． 25 μmol /L + GA31． 45 μmol /
L，见图 1G．
91第 2 期
图 1 榉树直接器官发生途径植株再生过程
A．带芽壮苗培养茎段外植体;B．初代培养;C． MS + BA 2． 25 μmol /L;D． MS + BA 35． 8 μmol /L;E． 继代培养;F． 增殖培养;G． 壮苗培养;
H． 生根培养;I． 1 /2MS + NAA 2． 69 μmol /L +活性炭 0． 1 g·L －1
Fig． 1 The process of plantlet rgeneration through direct organogenesis
A． Stems with a bud as explants;B． Initiation culture;C． Adventitious buds on MS + BA 2． 25 μmol /L;D． Adventitious buds on MS + BA 35. 8
μmol /L;E． Subculture;F． Propagation;G． Culture for sound seedling;H． Ｒooting culture;I． Ｒooting on 1 /2MS + NAA 2． 69 μmol /L + activated car-
bon 0． 1 g·L －1
表 6 榉树不定芽的壮苗培养试验结果
Tab． 6 The results of shoots on strong seedlings culture
处理编号
激素种类
BA/(μmol·L －1) GA3 /(μmol·L
－1)
接种时芽平均
高度 /cm
28 d后芽平均
高度 /cm
生长状况
H1 0 0 1． 0 1． 3 生长慢，木质化程度高，叶色深绿
H2 2． 25 0 1． 0 2． 4 具较多新的腋芽，茎杆较细，叶色嫩绿
H3 2． 25 1． 45 1． 0 3． 5 生长速度快，植株粗壮，叶色嫩绿
H4 2． 25 2． 90 1． 0 2． 0 生长速度中等，新芽多玻璃化，叶色嫩绿
H5 0 2． 90 1． 0 1． 3 生长慢，木质化程度高，个别植株黄化
2． 4 不同浓度的 NAA和活性炭对不定芽生根培养的影响
不同浓度的 NAA和活性炭对榉树不定芽生根培养的影响见表 7．由表 7 可知，在试验所选取的浓度中，
生根培养基中添加较高浓度的 NAA和较低浓度的活性炭有利于榉树不定根的诱导和生长．适宜的榉树不定
芽生根培养基配方为 I4，即 1 /2MS + NAA 2． 69 μmol /L + 0． 1 g·L
－1活性炭，生根率 77． 8%，生根数达 4． 5
条，见图 1H，I．
02 湖南师范大学自然科学学报 第 37 卷
刘雪梅等:直接器官发生途径的榉树微繁体系建立
表 7 榉树生根培养试验结果
Tab． 7 The experimental data of Z． schneideriana rooting
处理编号
实验方案
NAA/(μmol·L －1) 活性炭 /(g·L －1)
开始生根
时间 /d
生根率 /% 平均根长 /cm 平均根数 /条
I0 0 0 15 10． 24 2． 4 1． 0
I1 0． 54 0． 1 8 30． 34 4． 4 1． 5
I2 0． 54 0． 25 10 22． 22 4． 3 1． 0
I3 0． 54 0． 50 － 0 0 0
I4 2． 69 0． 10 8 77． 78 0． 25 4． 5
I5 2． 69 0． 25 6 44． 44 2． 08 2． 0
I6 2． 69 0． 50 10 22． 22 4． 75 1． 0
3 结论与讨论
木本植物器官发生过程中，植物生长调节剂对不定芽的诱导和生长发育起着重要的作用，在直接诱导不
定芽的形成时，细胞分裂素应高于生长素的用量或只用细胞分裂素．已有研究表明［7-9］，直接诱导榉树不定芽
形成时，只用细胞分裂素或细胞分裂素高于生长素的用量诱导效果好．因此，在初代培养的实验设计中只考
虑细胞分裂素对榉树带芽茎段诱导的影响．这与周燕青等［10］对条叶榕的组织培养研究结果相似．
以当年生带芽茎段为外植体，建立起了榉树外植体通过器官发生途径直接诱导形成不定芽或侧芽，再通
过诱导生根而成苗的榉树微繁技术体系:最适诱导培养基为 MS + BA 2． 25 μmol /L 或 2． 50 μmol /L;最适增
殖培养基为 MS + BA 2． 25 μmol /L;最适壮苗培养基为 MS + BA 2． 25 μmol /L + GA3 1． 45 μmol /L;最适生根
培养基为 1 /2MS + NAA 2． 69 μmol /L +活性炭 0． 1 g·L －1 ． 榉树不定芽诱导生根的试验设计中只选择了
NAA一种生长素，常用的 IBA或 NAA与 IBA混合使用效果是否更好还有待进一步研究．
离体器官发生方式大致分为直接器官发生和间接器官发生 2 种方式．间接器官发生途径再生不定芽的
细胞突变率较高，不利于保持原植株的母本优良性状，而直接器官发生途径则能很好的保持母本的优良特
性，而且直接诱导的不定芽与通过愈伤组织诱导产生的不定芽相比，前者不仅繁殖周期短，而且不定芽生长
速度快［11］．这为进一步研究榉树工厂化育苗提供了一定的参考．
由于榉树是高大的落叶乔木，其组织培养快速繁殖技术要真正应用于工厂化生产还有许多问题需要解
决，如外植体的采样时间和采样母树的树龄是否对不定芽的诱导产生影响等等．
参考文献:
［1］ 毕 波，刘云彩，陈 强，等．榉树对大气污染物的净化能力研究［J］．西部林业科学，2011，40(4):77-79．
［2］ JIN X L，HU X J，SUN Y P，et al． Callus induction and plant regeneration from immature embryos of Zelkova sinica Schneid．
［J］． Hort Sci，2012，47(6) :790-792．
［3］ 金晓玲．榉树的生物学特性和微繁技术研究［D］．长沙:中南林业科技大学，2003．
［4］ 汪灵丹，张日清．榉树的研究进展［J］．广西林业科学，2005，34(4):188-191．
［5］ DIEGO N D，MONTALBN I A，MONCALEN P． In vitro regeneration of adult Pinus sylvestris L． trees［J］． South Afr J Bot-
any，2010，76(1) :158-162．
［6］ KATSUAKI I，NAOKI T，MANABU K，et al． Tissue culture of two medicinal trees native to Japan［J］． BMC Proceedings，
2011，5(7) :1-11．
［7］ 汪灵丹，张日清，金晓玲．大叶榉顶芽诱导与增殖培养［J］．中南林业科技大学学报，2010，30(6):75-79．
［8］ JIN X L，ZHANG D L，HE P，et al． Invitro plant regeneration of Zelkova schneideriana，an endangered woody species in Chi-
na，from leaf explants［J］． J Hort Sci Biotech，2009，84(4) :415-420．
［9］ 金晓玲，何 平．大叶榉愈伤组织诱导与继代培养的影响因素［J］．中南林学院学报，2003，23(1):32-36．
［10］ 周燕青，丁 兰，徐步青，等．不同植物生长调节物质对条叶榕组织培养的影响［J］．浙江农林大学学报，2013，30(3):
453-458．
［11］ 王 征，金晓玲，刘雪梅，等．杜仲成熟胚器官发生途径的研究［J］．中南林业科技大学学报，2013，33(6):79-83．
( 编辑 王 健)
12第 2 期