全 文 ：北方园艺 2010(21):177 ～ 179 ·生物技术 ·
第一作者简介:胡仲义(1967-),男 ,本科 ,副教授 ,研究方向为植物
基础。
基金项目:浙江省教育厅科研资助项目(Y200803329)。
收稿日期:2010-06-28
斑点大吴风草叶片再生体系的建立
胡 仲义 , 何月秋
(宁波城市职业技术学院环境学院 ,浙江奉化 315502)
　　摘　要:现以斑点大吴风草为试材 ,系统研究了灭菌方式 、激素等因子对叶片再生的影响 ,建
立了斑点大吴风草不定芽的高频再生体系。结果表明:建立斑点大吴风草无菌培养物的较好方
法是0.1%HgCl2 加吐温-80处理叶片10 min;适宜的不定芽诱导培养基MS+6-BA 1.5 mg/ L+
NAA 1.0 mg/L;最佳的不定芽增殖培养基是MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L;其增殖系
数可达到 6.05;其芽长至2 ～ 3 cm时 ,最佳的生根培养基是 1/2MS+NAA 0.05 mg/L ,生根率达
到100%,最终得到完整的植株。该再生体系可作为基因转化的受体系统。
关键词:斑点大吴风草;叶片;不定芽;植株再生
中图分类号:S 688.4　文献标识码:A　文章编号:1001-0009(2010)21-0177-03
　　斑点大吴风草(Farf ugium japonica var.auseomac-
ulata)是菊科大吴风草属多年生草本植物 ,又称花叶如
意 ,原产日本[ 1] 。根状茎粗壮 ,叶面具有金黄色斑点 ,耐
荫、耐寒 、少病虫害 ,是优良的庭园种植 、城市绿化 、背阴
高架公路耐荫的地被材料 ,有着广阔的市场前景[ 2] 。然
而 ,目前的种子繁殖 、分株繁殖等方法远不能满足市场
的巨大需求 ,采用组织培养方法是一条有效的途径。周
根余[ 3] 、于爱萍[ 4]等以茎尖 、无菌苗叶片为外植体进行其
组培研究 ,但未见实现组培规模化生产。现首次采用地
栽斑点大吴风草叶片作外植体不经过愈伤组织阶段而
直接诱导出不定芽 ,取材方便 ,高效稳定 ,可大大降低生
产成本。同时 ,不定芽每株每年以612的几何频率扩增 ,
可在较短的时间内培育出大批商品苗。这不但为斑点
大吴风草在市场大量推广打下基础 ,而且为研究斑点大
吴风草叶面斑点形成机理 ,并进一步应用转基因技术实
现斑点大吴风草的品种改良提供一个良好的操作平台。
1　材料与方法
1.1　试验材料
试验材料为宁波城市职业技术学院环境学院温室
种植的斑点大吴风草。
1.2　试验方法
1.2.1　灭菌处理　将斑点大吴风草幼嫩叶片从植株上
小心剪下 ,带回实验室用洗洁精浸泡 15 min ,后用流水
冲洗 4 ～ 5次;分装好后移至超净工作台采用不同的灭
菌方法进行处理。
1.2.2　诱导和分化培养　诱导培养基以 MS +琼脂
7.0 g/L+白糖 30 g/L ,附加激素为 6-BA和NAA ,并参
阅周根余[ 3] 、于爱萍[ 4] 使用的浓度 ,并采用四因素三水平
正交设计[ L9(34),表 1] [ 5] 。培养基 pH 为 5.8 ,在温度
(25±1)℃、光照强度为 40μmol·m-2 ·s-1 、在每日光
照 14 h的条件下培养。接种 4周后统计每个组织块所
形成的不定芽数量。
　表 1　　丛生芽诱导和丛生芽增殖的正交实验 mg/L
水平 丛生芽的诱导 丛生芽的增殖
6-BA NAA 6-BA NAA
1 1.0 0.5 0.5 0.05
2 1.5 1.0 1.0 0.10
3 2.0 2.0 1.5 0.15
1.2.3　不定芽的增殖培养　不定芽长至 1 cm左右 ,将
不定芽分割成2 ～ 3个不定芽为一丛进行增殖培养。增
殖培养基以 MS+琼脂 7.0 g/L+白糖 30 g/ L ,附加不
同浓度的 6-BA 、NAA。接种 15 d后统计丛生芽的增殖
系数。
1.2.4　生根培养　不定芽长至2 ～ 3 cm时 ,将不定芽分
割成单个外植体 ,转入生根壮苗培养基 ,生根壮苗培养
基与丛生芽诱导和增殖培养条件基本相同 ,只是基本培
养为 1/2MS 、白糖 15 g/ L 附加不同浓度的 NAA 和
IBA ,转接15 d后调查苗的生根率 ,20 d后统计根长及生
长状况。
2　结果与分析
2.1　外植体灭菌试验分析
将不同灭菌方法处理的斑点大吴风草叶片接入培
养基中 ,每天观察外植体的污染状况作好记录。接种
10 d 以后 ,外植体的污染状况基本稳定。从表 1可知 ,
斑点大吴风草叶片无菌体系比较难建立。主要因为叶
片幼嫩 ,高浓度的灭菌剂导致绝大多数外植体出现褐
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·生物技术· 北方园艺 2010(21):177～ 179
化、坏死现象 ,因此外植体的存活问题成为系统研究斑
点大吴风草再生体系的重要障碍。试验表明 ,采用乙醇
和升汞混合使用的方法时 ,尽管随着乙醇处理的时间增
多 ,污染率略微有所下降 ,但成活率很低 ,最高仅有 5%;
单独采用升汞时 ,升汞处理时间为12 min以上时 ,污染
率有所下降 ,但叶片全部褐化死亡。相比较而言 ,采用
升汞加吐温-80的处理方式是较为理想的斑点大吴风
草灭菌方法 ,可以控制污染率在 40%左右 ,且能获得较
高的成活率。
　　表 2　不同灭菌方法对斑点大吴风草叶片的影响
编号 75%乙醇处理
0.1%升汞
处理/ min
吐温
-80
接种
数/块
污染
数/块
污染率
/ %
成活数
/块
成活率
/ %
M1 15 10 - 40 20 50.0 2 5.0
M2 20 10 - 40 18 45.0 2 5.0
M3 30 10 - 40 17 42.5 0 0.0
M4 - 10 - 40 20 50.0 3 7.5
M5 - 10 √ 40 16 40.0 4 10.0
M6 - 12 √ 40 12 30.0 0 0.0
M7 - 15 √ 40 10 25.0 0 0.0
2.2　斑点大吴风草叶片不定芽的分化
2.2.1　再生芽的获得　斑点大吴风草叶片在分化培养
基上培养 ,30 d后叶片逐渐肥厚和肿大 ,在培养过程中
边缘向远轴面卷曲 ,40 d后在切口边缘长出不定芽(图
1),随后 ,经过转移后不定芽迅速扩大繁殖(图 2)。形成
的不定芽并不经历愈伤组织阶段 ,而是直接从培养的叶
片分化产生 ,通常不定芽成簇密集生长 ,不定芽再生位
点主要集中在切口部位。再生的不定芽较少 ,经过一段
时间的培养后可长成小植株。试验中芽分化率较低 ,最
高仅有 44%。
　　表 3　　斑点大吴风草不定芽的诱导
编号 6-BA/ mg·L-1
NAA
/mg·L-1
外植体
/块
分化外植
体/块
诱导率
/ %
1 1.0 0.5 30 3 10.0
2 1.0 1.0 28 0 0.0
3 1.0 2.0 30 0 0.0
4 1.5 0.5 32 5 15.6
5 1.5 1.0 25 11 44.0
6 1.5 2.0 28 0 0.0
7 2.0 0.5 31 9 29.0
8 2.0 1.0 24 6 25.0
9 2.0 2.0 30 0 0.0
2.2.2　不同激素浓度对芽分化的影响　在 MS培养基
中加入不同的激素 ,配制成多种培养基 ,以长势良好的
叶片为外植体 ,筛选分化好的培养基。由表 3可看出 ,
所设计的 9个处理中 ,不定芽的分化率都比较低 ,甚至
有些培养基中不定芽的分化率为 0;同时 ,培养基中6-BA
和NAA的配比对不定芽的分化至关重要 ,细胞分裂素
对生长素的含量比值高时有利于芽的分化(1、3、4、7、8
号培养基),比值低时则不分化(2、3 、6 、9号培养基)。综
合观察表明 ,5号培养基分化的外植体数量最多 ,因此该
试验以该培养基作为分化培养基。
2.3　斑点大吴风草不定芽的增殖
将有不定芽的组织块转移添加到设计的 9种培养
基上 ,在5 、10 、15 d后观察生长 、增殖情况 ,统计增殖倍
数。表 4表明 ,斑点大吴风草不定芽在不同激素处理下
均能较快的增殖。在适宜的培养基中 ,单芽增殖的不定
芽数目最多可达到8个之多(图2)。其中2号培养基增
殖效果最好 ,不但增殖系数高 ,平均可达到 6.05 ,而且丛
生芽生长旺盛;其它培养基中丛生芽的增殖倍数最少也
在 3.44。不过 ,观察表明 ,随着激素的浓度增加 ,丛生芽
叶片出现不同程度的增厚和畸变 ,甚至出现玻璃化苗 ,
生长速度也减缓。一般而言 ,细胞分裂素类物质/生长
素类物质的比值过大丛生芽的分化系数高 ,但诱导形成
的丛生芽矮小细弱 ,甚至培养时间长会导致玻璃化苗的
出现。综合以上结果可知 , MS+NAA 0.10 mg/L +
6-BA 0.5 mg/ L是斑点大吴风草不定芽增殖的最佳培养
基。
　　表 4 斑点大吴风草不定芽的增殖
编号 6-BA/mg·L-1
NAA
/ mg·L-1
增殖
倍数 　　　　　生长状态
1 0.5 0.05 4.23 不定芽生长速度慢,植株粗壮 ,并伴随有根的分化 ,叶色嫩绿
2 0.5 0.10 6.05 不定芽数量多,植株粗壮,生长快速 ,叶色嫩绿,斑点明显 ,生长旺盛
3 0.5 0.15 3.44 不定芽数量多,植株粗壮,生长快速 ,但部分叶片肥厚 ,卷曲
4 1.0 0.05 5.16 不定芽数量多,植株粗壮,生长快速 ,叶片深绿,生长旺盛
5 1.0 0.10 4.57 不定芽数量多且小,生长快速 ,但部分叶片肥厚,卷曲
6 1.0 0.15 4.57 不定芽数量较多 ,植株小,生长快速 ,但部分叶片肥厚 ,卷曲
7 1.5 0.05 4.36 不定芽数量多而且小,植株排列紧密 ,生长慢 ,叶片肥厚,卷曲
8 1.5 0.10 4.68 不定芽数量多而且小,植株排列紧密 ,生长慢 ,部分叶片肥厚,卷曲
9 1.5 0.15 4.51 不定芽数量多而且小,植株排列紧密 ,生长慢 ,叶片肥厚,卷曲
2.4　生长调节剂对组培苗生根的影响
将健壮的植株转入生根壮苗培养基 ,10 d后开始生
根并逐渐生长 ,新生长出根吸收营养物质后会明显促进
茎叶的生长 ,15 d后小植株可产生 2 ～ 5条根 ,长成粗状
的根系后 ,植株可长到 3～ 3.5 cm 高(图 3),最高生根率
达到 100%。各处理对斑点大吴风草生根率影响有较大
的影响 ,不但生根率差异明显 ,而且苗的长势也有不同
(表 5)。NAA浓度在 0～ 0.1 mg/ L时 ,组培苗的根诱导
率随着激素浓度的提高而逐渐上升 ,而且苗的长势逐渐
变好;但NAA浓度在0.1 mg/ L以上时 ,NAA浓度增加
反而不利于组培苗生根。综合观察结果认为 ,斑点大吴
风草组培苗最佳的组合为 1/2MS+NAA 0.1 mg/L。
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北方园艺 2010(21):177 ～ 179 ·生物技术 ·
　　　　图 1　叶片不定芽形成　　　　　　　　　　图2　叶片不定芽的增殖　　　　　图3　生根的斑点大吴风草组培苗
　　表 5　　　斑点大吴风草生根率
编号 NAA/
mg·L-1
接种芽
数/株
生根率
/ % 长势
1 0.00 38 94.4 小苗长势较弱 ,叶色淡绿 ,生根缓慢
2 0.05 38 95.2 小苗长势弱,叶色淡绿,根长但比较细弱
3 0.10 40 100 小苗健壮,叶色深绿 ,根数较多 ,根粗且长,侧根多,长势良好
4 0.20 32 92.3 小苗健壮,叶色深绿 ,根粗且长 ,但根毛少
5 0.50 33 96.0 小苗健壮,叶色深绿 ,根粗且长 ,但无侧根
3　讨论
斑点大吴风草叶片比较敏感 ,经过无菌处理后 ,极
易发生褐化 、枯死现象 ,是研究斑点大吴风草再生体系
的早期障碍。褐化主要是由于植物受伤后体内多酚氧
化酶被激活 ,使得酚类物质氧化产生有毒的醌类物质 ,
进而逐渐扩散到培养基中 ,毒害整个外植体[ 6] 。另外 ,
植物组织培养中 ,激素使用不当时材料也容易褐变。该
研究表明 ,去除乙醇单独使用加有吐温-80的 0.1%升
汞处理叶片10 min是减小外植体伤害 ,降低材料褐变的
有效途径。在斑点大吴风草叶片分化阶段 ,使用 6-BA
1.5 mg/L 和 NAA 1.0 mg/L 浓度组合处理可获得
44.0%的分化率。虽然分化率不高 ,但不定芽的增殖和
生根相对容易 ,在降低了激素浓度增殖培养基本中获得
客观的增殖倍数 ,是斑点大吴风草的规模化的重要基
础;而在添加有 NAA的生根培养上 ,生根率一般可达到
90%以上。
参考文献
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Establishment of Leaf Regeneration in Farfugium japonica var.auseomaculata
HU Zhong-yi ,HE Yue-qiu
(Environmental Faculty of Ningbo City Colleg e of Vocational Technology , Fenghua , Zhejiang 315502)
Abstract:The F.japonica var.auseomaculata leaf regeneration was thoroughly discussed for the first time.The leaves of
F.japonica var.auseomaculata were used as the experimental material.Several factors such as sterilization methods ,
hormone concentration , and so on were investigated to optimize the regeneration system in vitro.The results showed that
the treatment of 0.1%HgCl2 +tween-80 10 minuts had better result to the explants.The high f requency of shoot
regeneration was observed when leaf explants were cultured on MS medium supplemented with 6-BA 1.5 mg/L and
NAA 1.0 mg/ L.The high proliferation times of adventitious bud was observed when adventitious buds were cultured on
MS medium supplemented with 6-BA 0.5 mg/L and NAA 0.1 mg/L ,which reached to 6.05.The buds were transferred
into the rooting medium when it reached to 2 ～ 3 cm.The best rooting medium for the radication w as 1/2MS medium
supplemented with NAA 0.05 mg/L.The rate of rooting could be 100%.This regeneration system can be applied to
F.japonica var.auseomaculata t ransgenic manipulation.
Keywords:Far fugium japonica var.auseomaculata;leaves;adventitious buds;plant regeneration
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