全 文 ：第 10 卷 第 6 期 环 境 工 程 学 报 Vol． 10，No． 6
2 0 1 6 年 6 月 Chinese Journal of Environmental Engineering Jun ． 2 0 1 6
鼠李糖脂在铜绿假单胞菌 NY3
代谢烃过程中的生理作用
卢 剑 聂麦茜* 胡 睿 聂红云 蒋 欣 玉 亚 王静怡
(西安建筑科技大学环境与市政工程学院，西安 710055)
摘 要 为了解鼠李糖脂在菌代谢烃过程中所起的具体作用，对 NY3 菌体生理生化指标进行测定，研究了 NY3 菌降
解烃过程中，鼠李糖脂促进烃降解与细胞生理特性变化规律的相关性。结果表明，投加 60、100 和 140 mg /L鼠李糖脂，能使
正十六烷降解率分别提高 23. 7%、48. 3%和 32. 2%，且产酸明显。鼠李糖脂能加快疏水性有机物的传质速度，与未加鼠李
糖脂相比，鼠李糖脂浓度为 100 和 140 mg /L 时，菌细胞内积聚的正十六烷量增加 12. 5%和 37. 69%。鼠李糖脂存在下，
NY3菌细胞内正十六烷吸收是一个积累和消耗相互交替的动态过程。鼠李糖脂使菌体细胞中疏水性脂类的相对含量和细
胞表面的负电荷明显增加，但使所生长的细胞内脂多糖含量明显减少，生长过程投加鼠李糖脂浓度为 60、100、140 和 200
mg /L时，细胞中脂多糖含量分别减少 45. 65%、58. 13%、45. 61%、和 59. 44%。因此，鼠李糖脂能加快 NY3 菌对十六烷的降
解，同时对代谢过程中菌体的生理生化特性有明显的改变。
关键词 铜绿假单胞菌 NY3 鼠李糖脂 十六烷 生物降解 生理特性
中图分类号 X172 文献标识码 A 文章编号 1673-9108(2016)06-3281-06 DOI 10． 12030 / j． cjee． 201501069
Ｒhamnolipid on physiological property of strain
Pseudomonas aeruginosa NY3 in metabolic process of hydrocarbon
Lu Jian Nie Maiqian Hu Ｒui Nie Hongyun Jiang Xin Yu Ya Wang Jingyi
(School of Environmental and Municipal Engineering，Xi’an University of Architecture and Technology，Xi’an 710055，China)
Abstract To understand the specific function of rhamnolipid complexes in the process of hydrocarbon deg-
radation，hexadecane degradation and changes in cell physiological properties were studied by assessing the phys-
iological and biochemical indexes of Pseudomonas aeruginosa NY3. The degradation of hexadecane increased by
23. 7%，48. 3%，and 32. 2% for rhamnolipid concentrations of 60，100，and 140 mg /L，respectively． In addi-
tion，acid production improved significantly;compared with the blank controls，the amounts of hexadecane that
accumulated in cells increased by 12． 5% and 37. 69% for 100 mg /L and 140 mg /L of rhamnolipids，respective-
ly． Additionally，rhamnolipids accelerated the transfer rate of hydrophobic organic contaminants． In the presence
of rhamnolipids，the absorption of N-hexadecane in NY3 bacteria was a dynamic process that alternated between
accumulation and consumption． The relative amount of hydrophobic esters contained in cells and the zeta poten-
tial of cell surfaces clearly increased by the addition of rhamnolipids;however，the amount of lipopolysaccharides
decreased． When the concentrations of rhamnolipids were 60，100，140，and 200 mg /L，the amount of lipopo-
lysaccharides contained in cells decreased by 45． 65%，58. 13%，45. 61%，and 59. 44%，respectively． There-
fore，it can be inferred that rhamnolipids accelerate the degradation of hexadecane and alter the physiological and
biochemical characteristics of P． aeruginosa NY3 during the metabolic process．
Key words Pseudomonas aeruginosa NY3;rhamnolipid;hydrocarbon;biodegradation;physiological
property of cell
基金项目:国家自然科学基金资助项目(51278405);陕西省国际科
技合作重点项目(2012KW-25);2011 榆林市产学研项目
收稿日期:2015 － 01 － 12;修订日期:2015 － 03 － 22
作者简介:卢剑(1989—)，男，硕士研究生，研究方向:石油污染物的
微生物降解技术。E-mail:997588108@ qq. com
* 通讯联系人，E-mail:niemaiqian@ xauat． edu． cn
随着人类对石油的开采利用，石油烃污染已经
成为人类面临的重要环境问题之一。因此，石油污
染物的降解处理对保障人体健康和社会发展有着重
要意义［1］。生物修复技术因其成本低，不易对环境
产生负面影响，而被广泛应用［2］。生物对水溶性小
环 境 工 程 学 报 第 10 卷
的长链烷烃和芳香烃等可利用性差，从而影响其修
复效果［3-4］。投加表面活性剂能提高微生物对疏水
性有机污染物的代谢效率［5-6］。鼠李糖脂是其中最
为常用的微生物表面活性剂。按照文献［7-8］报道，
鼠李糖脂能促进菌株在石油烃碳源上的生长，并提
高石油烃污染环境的修复速度。笔者所在实验室前
期获得一株铜绿假单胞菌 NY3［9］，能快速降解石油
烃。有研究者认为，鼠李糖脂因增加石油烃的表观
溶解度而提高降解速度［6］。然而，近年来研究发
现，鼠李糖脂也可能因改变菌体细胞的生理特性而
提高烃类的降解效率［10-11］。本研究通过测定生理生
化指标，研究 NY3菌降解烃过程中，鼠李糖脂促进烃
降解与细胞生理特性变化规律的相关性。研究工作
旨在深入理解鼠李糖脂促进石油烃降解的机理。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
1. 1. 1 菌种来源
铜绿假单胞菌 NY3(属于假单胞菌属，革兰氏
阴性菌)，本实验室分离并鉴定［9］。
1. 1. 2 试剂和培养基
无机盐培养基(MSM):1. 0 g NH4NO3，1 mL 微
量元素［8］，0. 5 mL 1 mol /L MgSO4·7H2O溶液，0. 1
mL 1 mol /L CaCl2·2H2O 溶液，25 mL 磷酸盐缓冲
液(K2HPO4 42 g，NaH2PO4 28 g)，pH为 7. 5，用蒸馏
水定容至 1 000 mL，121 ℃高压水蒸气灭菌 30 min，
备用。
LB培养基:NaCl 5. 0 g，牛肉膏 3. 0 g，蛋白胨
10. 0 g，蒸馏水 1 000 mL;pH 调节为 7. 5 左右，121
℃灭菌 30 min，备用。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 NY3 种子液的制备
将 NY3 接种于 LB培养基中，30 ℃，150 r /min，
好氧培养 24 h，OD600 nm达到 1. 85 ± 0. 06，备用。
1. 2. 2 鼠李糖脂的发酵与提纯
用 NY3 菌发酵所产鼠李糖脂，按文献［12］中方
法提取鼠李糖脂纯品，储于 4 ℃，备用。
1. 2. 3 菌种的培养和降解实验
正十六烷培养基:在无机盐培养基中加入 30
μL的正十六烷，将 10%菌液接种于 20 mL 培养基
的 50 mL 三角瓶中，投加鼠李糖脂使其浓度达到
60、100 和 140 mg /L，以未投加鼠李糖脂作对照，在
恒温振荡器中 150 r /min，30 ℃，培养 72 h。用 3 × 4
mL正己烷萃取降解体系中的正十六烷后，定容至
10 mL。以正十二烷为内标物，用气相色谱法测定，
按计算:烷烃降解率 =［(十六烷初始浓度 －色谱测
定的剩余含量)/初始浓度］× 100%。
1. 2. 4 菌种生长量和产酸量的测定
在 100 mL MSM中加入 0. 15 g 正十六烷、0. 15
g正十六烷 + 100 mg /L鼠李糖脂、或 100 mg /L鼠李
糖脂，NY3 种子液接种量 10%，恒温培养。定时采
样，用平板计数法测定活菌数(cfu /mL)，以此表示
菌体生长量，同时用 pH计测培养液的 pH值。
1. 2. 5 生长过程中 NY3 菌细胞胞内正十六烷浓度
测量
在 20 mL MSM中加入 30 μL正十六烷，NY3 种
子液接种量 10%、投加鼠李糖脂，使其浓度分别达
到 0、60、100 和 140 mg /L，恒温培养 72 h 后收获菌
体，离心，用蒸馏水清洗菌体 3 次。用蒸馏水悬浮至
1. 5 mL，分别加入溶菌酶(lysozyme)至 6 mg /mL［13］，
调节 pH为 6. 5，于 45 ℃振荡破碎细胞，用正己烷萃
取细胞破碎液中的正十六烷。用气相色谱法测定正
十六烷，以正十二烷为内标物进行定量［14］。计算十
六烷含量，以“ng /mg干菌”表达。
1. 2. 6 鼠李糖脂浓度对 NY3 菌吸收十六烷的影响
实验
在 LB培养基制备 NY3 菌细胞，收获后悬浮在
MSM中，OD600nm值约为 1. 5。分别取 20 mL 菌液于
56 个 50 mL 锥形瓶中，分别加入 30 μL 正十六烷。
将 56 个瓶分为 4 组，每组 14 瓶，在第 1、2、3、4 组的
瓶中分别投加鼠李糖脂，浓度分别达到 0、60、100 和
140 mg /L。在 30 ℃，151 r /min 条件下培养，于 10、
20、30、60、90、120 和 180 min时，每组每培养时段各
采两个平行样。离心菌体，用蒸馏水清洗菌体 3 次，
悬浮至 1. 5 mL，分别加入溶菌酶至 6 mg /mL(lyso-
zyme)，调节 pH为 6. 5，于 45 ℃振荡破碎细胞，用正
己烷萃取细胞破碎液中的正十六烷。用气相色谱法
测定正十六烷，以正十二烷为内标物进行定量。计
算十六烷含量，以“ng /mg干菌”表达。
1. 2. 7 气相色谱条件
气相色谱测定十六烷含量及其降解率［15］:将
1. 2. 3 和 1. 2. 5 中萃取的正十六烷溶于 10 mL 正己
烷中，用安捷伦 6890N单检测器气相色谱仪(FID检
测器)，色谱条件:5% phenyl Methyl Siloxane HP-5
毛细管气相色谱柱(30 m ×320 μm ×0. 25 μm)。载
气:99. 99%高纯氮气。进样口温度 250 ℃，分流比
2823
第 6 期 卢 剑等:鼠李糖脂在铜绿假单胞菌 NY3 代谢烃过程中的生理作用
50. 0∶ 1。程序升温:初始 160 ℃，保留 1 min，再以
20 ℃ /min升温至 260 ℃，保留 6 min。
1. 2. 8 傅里叶红外谱图测定方法
200 uL正十六烷加入 100 mL MSM 中，NY3 种
子液接种 10%、投加鼠李糖脂，使其浓度分别达到
0、20、40、60、80 和 100 mg /L，在摇床上恒温培养 72
h后，离心收集菌体，用无机盐培养基洗 3 次。将菌
体烘干后，与 KBr 粉末压片后在 IＲ Prestige-21 /FT-
IＲ-8400S傅里叶红外光谱仪器上测定红外图谱［16］。
1. 2. 9 菌体细胞脂多糖 LPS的测定
200 μL正十六烷加入 100 mL MSM 中，NY3 种
子液接种 10%、投加鼠李糖脂，使其浓度分别达到
0、20、60、100、140 和 200 mg /L，恒温培养。生长 24、
48 和 72 h时采样，4 ℃，8 000 r /min 离心 5 min，收
集菌体，按文献［17］的方法提取脂多糖，并且采用
文献［18］中的方法进行检测。计算菌体脂多糖含
量，以“μmol /mg干菌”表达。
1. 2. 10 菌体表面 Zeta电位的测定
200 μL正十六烷加入 100 mL MSM 中，NY3 种
子液接种 10%、投加鼠李糖脂，使其浓度分别达到
0、20、60、100、140、150 和 200 mg /L，恒温培养 72 h，
离心收获菌体，蒸馏水洗 3 次，悬浮后 OD600 nm =
1. 0，用马尔文 Zeta电位仪测定菌体表面电位。
2 实验结果与讨论
2. 1 鼠李糖脂对 NY3 菌降解正十六烷的影响作用
按 1. 2. 4 中实验方法，分别以正十六烷、鼠李糖
脂、正十六烷 +鼠李糖脂等为唯一碳源进行培养，按
图 1 所示的培养时间采样，培养液 pH 值和活菌数
(cfu /mL)如图 1 所示。由图 1(a)结果看，鼠李糖脂
为单一碳源时，104 h内 NY3 菌无明显生长，当正十
六烷为唯一碳源时，NY3 菌体明显生长，但生长缓
慢，46 h，以活菌数(cfu /mL)表示的净生长量仅为
0. 519 × 109。投加“鼠李糖脂和十六烷”时，生长速
度明显加快。生长 26 h，菌体净生长量比未投加鼠
李糖脂提高 2 倍，培养时间越延长，鼠李糖脂促进则
更明显，生长 46 h，菌体活菌数(cfu /mL)提高 2. 4
倍。NY3 菌体代谢十六烷产生有机酸，使培养液 pH
降低，从图 1(b)看，菌体生长速度越快，产酸越多，
pH下降明显，104 h时 pH降低约 0. 8。而未投加鼠
李糖脂的正十六烷降解体系中 pH约降低 0. 2。
从图 1 降解结果看，与对照组相比，当 NY3 菌
生长约 72 h，投加鼠李糖脂和十六烷体系中，菌体生
图 1 鼠李糖脂对 NY3 菌以十六烷为碳源生长特性的影响
Fig. 1 Effect of rhamnolipid on growth properties by
P. aeruginosa NY3 on hexadecane as carbon sources
长量及其代谢液产酸量处在快速增长时期。为揭示
鼠李糖脂对十六烷降解的促进作用，另取 4 份溶液，
投加浓度鼠李糖脂至 0、60、100 和 140 mg /L，选择
培养 72 h采样，测定十六烷降解率，结果如图 2 所
示。与未投加鼠李糖脂比，十六烷去除率分别提高
23. 7%、48. 3%和 32. 2%。
图 2 鼠李糖脂对 NY3 菌降解正十六烷的效率的影响
Fig. 2 Effect of rhamnolipid on degradation of
hexadecane by P． aeruginosa NY3
2. 2 鼠李糖脂对 NY3 菌细胞体摄取十六烷效率的
影响
按照 1. 2. 5、1. 2. 6 及 1. 2. 7 中的实验方法进行
实验，结果如图 3 所示。
3823
环 境 工 程 学 报 第 10 卷
图 3 鼠李糖脂存在下生长 72 h NY3 菌细胞内
十六烷的积聚特征
Fig. 3 Effect of rhamnolipid on accumulation
characteristics of hexadecane by NY3 cells
NY3 菌体烃氧化酶为胞内酶，NY3 菌体在与正
十六烷接触后，胞内会积聚一定水平的正十六烷。
图 3 结果表明，NY3 菌降解十六烷过程中，与未投加
鼠李糖脂相比，当投加鼠李糖脂浓度为 100 和 140
mg /L 时，胞内正十六烷含量分别增加 12. 5% 和
37. 69%。从图 4 结果看，胞内积累十六烷的量是一
个随降解进程而动态变化的，变化范围约为 0. 5 ～
1. 5 ng /mg干菌。生长 72 h 时，未投加鼠李糖脂降
解液中剩余十六烷较多，同时，在 72 h 内 NY3 菌已
分泌出一些具有乳化性的物质(从生长至 72 h 时，
未投加鼠李糖脂发酵液有较明显的泡沫可以推
断)，因而造成菌体快速生长期内，未投加鼠李糖脂
细胞中积累的十六烷量比投加较低 Ｒha 浓度(60
mg /L)条件下积累量略高。
图 4 鼠李糖脂对 NY3 菌种子细胞摄取十六烷特性的影响
Fig. 4 Effect of rhamnolipid on intake efficiency
of hexadecane by NY3 cells
图 4 反映了在液体 LB培养基中生长的 NY3 菌
细胞，与鼠李糖脂短时间作用后，胞内十六烷的累积
特征。胞内十六烷浓度随时间发生变化，积累到最
大值后又逐渐被代谢，随后十六烷浓度又有升高趋
势。并且发现，与未投机鼠李糖脂相比，鼠李糖脂可
使胞内十六烷积累最大峰值出现的时间提前。鼠李
糖脂是一种两亲性物质［19-20］，可在油水界面定向排
列成单分子膜。其亲水基可与菌充分接触;憎水基
由不同长度碳链的脂肪酸构成，可与烃类物质接触，
从而使烃类物质进入菌细胞，加速疏水性有机物的
传质速度，促进 NY3 菌体对烃类化合物的摄取能
力，这也就解释了投加鼠李糖脂的降解体系中，NY3
菌对正十六烷的降解效率明显增加的现象。
2. 3 鼠李糖脂在 NY3 菌降解十六烷过程中对菌细
胞结构特征的影响
按 1. 2. 8 中的方法培养细胞，并测定干菌体的
红外光谱。按照红外光谱分析原理，3 440 cm －1处
中等强度、且较宽的吸收带是 O—H和 N—H等(亲
水键)伸缩振动吸收引起的;2 700 ～ 3 000 cm －1范围
内谱峰为 C—H键(疏水键)的伸缩振动峰，为脂肪
链的特征吸收峰［21］，可反映菌体细胞中疏水性烃基
含量。当按文献［22］中的方法分别积分 3 440 cm －1
和 2 700 ～ 3 000 cm －1波峰处的面积，并计算峰面积
比值，如表 1 所示。
表 1 生长过程中投加鼠李糖脂对 NY3 菌
细胞红外吸收特性的影响
Table 1 Effect of rhamnolipid on FT-IＲ absorption
properties of NY3 cells in growth process
Ｒah投加量(mg /L)
2 700 ～ 3 000 cm －1峰面积与
3 440 cm －1峰面积比值
0 0. 009 6
20 0. 055
40 0. 066 2
60 0. 083 6
80 0. 077 2
100 0. 040 3
从表 1 结果看，生长过程中投加鼠李糖脂，所
生长的 NY3 菌菌体细胞红外谱中 2 700 ～ 3 000
cm －1峰面积与 3 440 cm －1峰面积的比值均有明显
提高。说明投加鼠李糖脂，所生长的细胞中疏水
性物质含量增加。这可能是由于烃类物质或类似
于聚羟基脂肪酸(PHA)类物质在细胞内的积累所
引起的［15］。
4823
第 6 期 卢 剑等:鼠李糖脂在铜绿假单胞菌 NY3 代谢烃过程中的生理作用
2. 4 生长过程投加鼠李糖脂对 NY3 菌体脂多糖
LPS含量的影响
按 2. 2. 9 中所采用的酚-水分离法提取 NY3 菌
细胞内的脂多糖，同时用 Purpald 试剂法，测定菌体
中脂多糖。测定结果见图 5。
图 5 生长过程投加鼠李糖脂对 NY3 菌脂多糖
LPS含量的影响
Fig. 5 Effect of rhamnolipid on content of LPS of NY3
cells in growth process
图 5结果表明，与未投加鼠李糖脂相比，生长过
程投加鼠李糖脂，菌细胞中 LPS含量明显降低。当投
加鼠李糖脂浓度分别为 60、100、140 和 200 mg /L时，
生长 72 h 细胞，脂多糖含量分别减少 45. 65%、
58. 13%、45. 61%和 59. 44%。因此，在投加鼠李糖脂
的情况下，会造成 NY3 菌体表面脂多糖含量的减小。
本实验发现这与 Al-Tahhan等［11］的研究结果相同。
2. 5 生长过程投加鼠李糖脂对 NY3 菌体其他生理
特性的影响
用马尔文电位仪测定 NY3 菌体表面 Zeta电位。
结果如表 2 所示。
表 2 生长过程投加鼠李糖脂对 NY3菌株 Zeta电位的影响
Table 2 Effect of rhamnolipid on surface Zeta
potential of NY3 cells in growth process
Ｒha浓度(mg /L) Zeta电位(mV)
0 － 29. 9
60 － 38. 5
100 － 42. 7
140 － 38. 1
150 － 34. 0
200 － 37. 4
从表 2 结果看，生长过程中投加鼠李糖脂，NY3
菌体细胞 Zeta电位均有明显的降低，说明菌体表面
所带的负电荷增加，从而导致菌体表面斥力的增加。
这使得菌体之间在培养体系中更容易分散，与烃类
接触机会大大增加。这也可以解释投加鼠李糖脂菌
体对正十六烷的降解率增加。
3 结 论
本论文通过测定生理生化指标，研究 NY3 菌降
解烃过程中，鼠李糖脂浓度与细胞生理特性变化规
律的相关性。结果表明，投加 60、100 和 140 mg /L
鼠李糖脂时，对正十六烷降解率分别提高 23. 7%、
48. 3%和 32. 2%。生长过程中投加 100、140 mg /L
鼠李糖脂，NY3 菌胞内正十六烷含量分别增加
12. 5%和 37. 69%。NY3 菌体胞内在不同时间段累
积的正十六烷是一个积累和消耗相互交替的动态平
衡过程。投加鼠李糖脂使所生长的菌体细胞中疏水
性脂类的相对含量明显增加，使细胞表面所带的负
电荷明显增加，而使胞内脂多糖含量明显减少，与未
投加鼠李糖脂相比，鼠李糖脂含量为 60、100、140 和
200 mg /L 时，胞内脂多糖分别减少 45. 65%、
58. 13%、45. 61%和 59. 44%。因此，在降解烃过程
中，鼠李糖脂促进烃降解与细胞生理特性变化有明
显的相关性。
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